一种鱼类体内肠道细胞迁移的快速标记方法与流程

1.本发明涉及一种活体标记方法，尤其是涉及一种鱼类体内肠道细胞迁移的快速标记方法。


背景技术：

2.水产养殖是食品生产行业增速最快的产业之一，为人类提供了大量的优质动物性蛋白。然而，由于集约化养殖环境，养殖鱼类经常会发生各种病菌性感染，造成大量经济损失。感染多数发生于粘膜（尤其是肠粘膜），因与肠腔内大量的细菌、病毒、生物毒素及化学毒素的接触，肠粘膜组织成为鱼类遭受威胁的最大的部位。此外，研究表明高植物蛋白替代鱼粉后，易造成鱼类肝肠损伤，引发一系列免疫介导的疾病，这些因素均限制了水产养殖的可持续发展。
3.现有研究学者采取中草药防治方法预防并治疗鱼类肠道炎症的发生，得到了较好的效果，例如一些中草药如姜黄素、小檗碱等均可改善鱼类肠道健康，但其中的药理作用有待深入研究，作用机制也不甚清楚。
4.在体外研究中发现姜黄素可促进细胞增殖和迁移，但是在体内的试验中如何验证这些药物确实可以促进鱼类活体内肠道细胞增殖和迁移，这就需要开发设计一种鱼类肠道细胞迁移的活体标记方法。


技术实现要素：

5.本发明是为了解决目前无法验证药物可以促进鱼类活体内肠道细胞增殖和迁移的问题，提供了一种安全、高效且精准的鱼类体内肠道细胞迁移的快速标记方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的一种鱼类体内肠道细胞迁移的快速标记方法，包括以下步骤：（1）选取摄食外源物质的活体鱼，将5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（brdu）溶液按照50 mg/kg的注射剂量注射到鱼体腹部。
7.（2）将荧光探针fitc-keratin按照所需的注射剂量注射到鱼体腹部，荧光探针fitc
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keratin的核苷酸序列如seq id no.1所示。荧光探针fitc
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keratin的核苷酸序列为attcatgccatgctttgacctcctcctggttcttc；为提高其靶向精准度，荧光探针fitc
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keratin的核苷酸序列优选经硫代磷酸化及锁核酸修饰处理，经硫代磷酸化及锁核酸修饰处理后的荧光探针fitc-keratin的核苷酸序列为：/a /*/t /*/t /*c*a*t*g*c*c*a*t*g*c*t*t*t*g*a*c*c*t*c*c*t*c*c*t*g*g*t*t*c*/t /*/t /*/c /（*代表硫代磷酸化，/a /代表锁核酸修饰）。
8.（3）于注射后的24h，取活体鱼的肠道组织，并将肠道组织置于组织固定液中固定，得固定样品。
9.（4）将固定样品制成冰冻切片。
10.（5）将冰冻切片进行抗原修复。
11.（6）画圈封闭：将步骤（5）中得到的切片稍甩干后，用组化笔在组织周围的载玻片上画圈，并在圈内滴加封闭液室温孵育30min；所述封闭液为5%bsa。
12.（7）加一抗：甩掉封闭液，在切片上滴加一抗后平放于湿盒内4℃孵育过夜。
13.（8）加二抗：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育。
14.（9）自发荧光淬灭：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，在圈内加入自发荧光淬灭剂，淬灭后流水冲洗。
15.（10）dapi复染细胞核：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
16.（11）镜检拍照：将切片置于荧光显微镜下观察，并采集图像。
17.作为优选，步骤（1）中，选取摄食外源物质八周的活体鱼。
18.作为优选，步骤（3）中，所述组织固定液为4%pfa溶液。
19.作为优选，步骤（4）中，所述冰冻切片通过以下方法制得：（
ⅰ
）脱水：将肠道组织从固定液取出，放于15%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后，转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。
20.（
ⅱ
）oct包埋：将脱好水的肠道组织取出用滤纸将表面水稍吸干后，用手术刀将目的部位组织修平整，切面朝上放于样本托上，组织周围滴上oct 包埋剂，将样本托放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct 变白变硬后即可进行切片。
21.（
ⅲ
））切片：将样本托固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
22.作为优选，步骤（5）中，所述抗原修复的具体步骤为：组织切片置于盛满ph8.0的edta抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10min停火10min转中低火7min，自然冷却后将载玻片置于ph7.4的pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤。
23.5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo 2-deoxyuridine，brdu）是dna前体胸腺嘧啶核苷的类似物，能选择性的掺入到处于细胞周期s期（即dna合成期）细胞的单链dna核苷酸序列中；在活体引用合成dna的可示踪的前体物质brdu，使增殖期细胞可竞争性的替代胸腺嘧啶而掺入，成为细胞增殖的重要标志；然而brdu可以掺入到处于细胞dna合成期的所有细胞中，所得到的结果会混杂其他细胞的阳性结果，keratin是一种特异性细胞骨架蛋白，存在于上皮细胞表面，是上皮细胞生长、分化及成熟的特征性标志物，因此，本发明通过设计fitc
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keratin探针以靶向肠上皮细胞，结合brdu活体标记和荧光探针技术，后续通过冰冻切片进行荧光免疫，可确保荧光免疫后的是肠上皮细胞，而不是肠道其他细胞，从而可以观察外源物质对鱼体肠上皮细胞的增殖和迁移效果。
24.作为优选，步骤（6）中，所述封闭液为5%bsa封闭液。
25.作为优选，步骤（7）中，所述一抗为兔来源ck-18。
26.作为优选，步骤（8）中，所述二抗为兔来源ck-18。
27.作为优选，步骤（9）中，所述自发荧光淬灭剂为servicebio g1221。
28.作为优选，步骤（10）中，所述抗荧光淬灭封片剂为servicebio g1401。
29.因此，本发明具有如下有益效果：提供了一种安全、高效且精准的鱼类活体标记方法，并创造性地将brdu活体标记方法与荧光探针技术结合应用到鱼类肠道上皮细胞增殖和
迁移研究中，为研究外源物质对鱼类肠道上皮细胞增殖和迁移的促进作用提供技术途径，对于鱼类的高效健康养殖具有非常重要的意义。
附图说明
30.图1为实施例1中的冰冻切片显色结果。
31.图2为实施例2中的冰冻切片显色结果。
32.图3为实施例3中的冰冻切片显色结果。
具体实施方式
33.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
34.实施例1（1）选取摄食外源物质（姜黄素）八周的活体鱼（黄姑鱼），将brdu溶液按照所需的注射剂量注射到鱼体腹部。
35.（2）将荧光探针fitc-keratin按照50 mg/kg的注射剂量注射到鱼体腹部，荧光探针fitc-keratin的核苷酸序列如seq id no.1所示。
36.（3）于注射后的24h，取活体鱼的肠道组织，并将肠道组织置于组织固定液（4%pfa溶液）中固定，得固定样品。
37.（4）将固定样品制成冰冻切片；冰冻切片通过以下方法制得：（
ⅰ
）脱水：将肠道组织从固定液取出，放于15%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后，转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。
38.（
ⅱ
）oct包埋：将脱好水的肠道组织取出用滤纸将表面水稍吸干后，用手术刀将目的部位组织修平整，切面朝上放于样本托上，组织周围滴上oct 包埋剂，将样本托放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct 变白变硬后即可进行切片。
39.（
ⅲ
））切片：将样本托固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
40.（5）将冰冻切片进行抗原修复；抗原修复的具体步骤为：组织切片置于盛满ph8.0的edta抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10min停火10min转中低火7min，自然冷却后将载玻片置于ph7.4的pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤。
41.（6）画圈封闭：将步骤（5）中得到的切片稍甩干后，用组化笔在组织周围的载玻片上画圈，并在圈内滴加封闭液室温孵育30min；封闭液为5%bsa封闭液。
42.（7）加一抗：甩掉封闭液，在切片上滴加一抗后平放于湿盒内4℃孵育过夜，一抗为兔来源ck-18。
43.（8）加二抗：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育，二抗为山羊抗兔igg h&l。
44.（9）自发荧光淬灭：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，在圈内加入自发荧光淬灭剂，淬灭后流水冲洗，自发荧光淬灭剂为servicebio g1221。
45.（10）dapi复染细胞核：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，抗荧光淬灭封片剂为servicebio g1401。
46.（11）镜检拍照：将切片置于荧光显微镜下观察，并采集图像，采集的图像如图1所
示。
47.实施例2（1）选取摄食外源物质（小檗碱）八周的活体鱼（黄姑鱼），将brdu溶液按照所需的注射剂量注射到鱼体腹部。
48.（2）将荧光探针fitc-keratin按照50 mg/kg的注射剂量注射到鱼体腹部，荧光探针fitc-keratin的核苷酸序列如seq id no.1所示。
49.（3）于注射后的24h，取活体鱼的肠道组织，并将肠道组织置于组织固定液（4%pfa溶液）中固定，得固定样品。
50.（4）将固定样品制成冰冻切片；冰冻切片通过以下方法制得：（
ⅰ
）脱水：将肠道组织从固定液取出，放于15%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后，转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。
51.（
ⅱ
）oct包埋：将脱好水的肠道组织取出用滤纸将表面水稍吸干后，用手术刀将目的部位组织修平整，切面朝上放于样本托上，组织周围滴上oct 包埋剂，将样本托放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct 变白变硬后即可进行切片。
52.（
ⅲ
））切片：将样本托固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
53.（5）将冰冻切片进行抗原修复；抗原修复的具体步骤为：组织切片置于盛满ph8.0的edta抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10min停火10min转中低火7min，自然冷却后将载玻片置于ph7.4的pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤。
54.（6）画圈封闭：将步骤（5）中得到的切片稍甩干后，用组化笔在组织周围的载玻片上画圈，并在圈内滴加封闭液室温孵育30min；封闭液为5%bsa封闭液。
55.（7）加一抗：甩掉封闭液，在切片上滴加一抗后平放于湿盒内4℃孵育过夜，一抗为兔来源ck-18。
56.（8）加二抗：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育，二抗为山羊抗兔igg h&l。
57.（9）自发荧光淬灭：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，在圈内加入自发荧光淬灭剂，淬灭后流水冲洗，自发荧光淬灭剂为servicebio g1221。
58.（10）dapi复染细胞核：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，抗荧光淬灭封片剂为servicebio g1401。
59.（11）镜检拍照：将切片置于荧光显微镜下观察，并采集图像，采集的图像如图2所示。
60.实施例3（1）选取摄食外源物质（姜黄素和小檗碱）八周的活体鱼（黄姑鱼），将brdu溶液按照所需的注射剂量注射到鱼体腹部。
61.（2）将荧光探针fitc-keratin按照50 mg/kg的注射剂量注射到鱼体腹部，荧光探针fitc
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keratin的核苷酸序列如seq id no.1所示。
62.（3）于注射后的24h，取活体鱼的肠道组织，并将肠道组织置于组织固定液（4%pfa溶液）中固定，得固定样品。
63.（4）将固定样品制成冰冻切片；冰冻切片通过以下方法制得：
（
ⅰ
）脱水：将肠道组织从固定液取出，放于15%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后，转入30%的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。
64.（
ⅱ
）oct包埋：将脱好水的肠道组织取出用滤纸将表面水稍吸干后，用手术刀将目的部位组织修平整，切面朝上放于样本托上，组织周围滴上oct 包埋剂，将样本托放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，oct 变白变硬后即可进行切片。
65.（
ⅲ
））切片：将样本托固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
66.（5）将冰冻切片进行抗原修复；抗原修复的具体步骤为：组织切片置于盛满ph8.0的edta抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火10min停火10min转中低火7min，自然冷却后将载玻片置于ph7.4的pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤。
67.（6）画圈封闭：将步骤（5）中得到的切片稍甩干后，用组化笔在组织周围的载玻片上画圈，并在圈内滴加封闭液室温孵育30min；封闭液为5%bsa封闭液。
68.（7）加一抗：甩掉封闭液，在切片上滴加一抗后平放于湿盒内4℃孵育过夜，一抗为兔来源ck-18。
69.（8）加二抗：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育，二抗为山羊抗兔igg h&l。
70.（9）自发荧光淬灭：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，在圈内加入自发荧光淬灭剂，淬灭后流水冲洗，自发荧光淬灭剂为servicebio g1221。
71.（10）dapi复染细胞核：将载玻片置于pbs缓冲液中，在脱色摇床上晃动洗涤后，将切片甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片，抗荧光淬灭封片剂为servicebio g1401。
72.（11）镜检拍照：将切片置于荧光显微镜下观察，并采集图像，采集的图像如图3所示。
73.从实施例1~3中的冰冻切片显色结果可以看出，肠道组织的显色结果有brdu和fitc
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keratin显色结果，其结合部位即为上皮细胞，可以很清晰的看出上皮细胞迁移情况。
74.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。