一种干细胞微粒在制备治疗帕金森的药物中的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体一种干细胞微粒在制备治疗帕金森的药物中的应用。


背景技术：

2.帕金森病是一种影响中枢神经系统的慢性神经退化疾病，主要影响运动神经系统。它的症状通常随时间缓慢出现，早期最明显的症状为颤抖、肢体僵硬、运动功能减退和步态异常，也可能有认知和行为问题；痴呆症在病情严重的患者中相当常见，超过三分之一的病例也会发生重性抑郁障碍和焦虑症。其它可能伴随的症状包括知觉、睡眠、情绪问题。帕金森治疗是一个世界难题。目前治疗药物，包括补充多巴胺(美多巴、息宁等)、抗胆碱能药物(苯海索等)只能控制症状，保持基本的生活质量，而不能延缓疾病的进展。
3.间充质干细胞来源的微粒(mvs，简称干细胞微粒)，是干细胞细胞膜上脱落或分泌的磷脂双分子层膜结构的囊泡状小体，直径从100nm到1000nm不等，内含蛋白质、脂质、mrna、mirna等成分。并且也可检测到表达cd63、cd81等标志物。mvs可以通过与靶细胞发生质膜融合，或是通过细胞内吞作用被内化，或是与细胞表面受体作用影响胞内信号通路，与邻近细胞交换生物活性分子参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。mvs相比于干细胞，具有体积小、性质稳定、易于存储运输、无细胞活性、免疫原性低、无形成肿瘤风险等优势，无伦理争议，安全性高。
4.目前没有干细胞微粒在帕金森治疗方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种干细胞微粒在制备治疗帕金森的药物中的应用。
6.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
7.一种干细胞微粒在制备治疗帕金森的药物中的应用。
8.进一步地，所述干细胞微粒为间充质干细胞微粒。
9.更进一步地，所述干细胞微粒为脐带间充质干细胞微粒。
10.有益效果：
11.本发明发现，干细胞微粒可以有效缓解帕金森病的症状。因此，干细胞微粒具备开发成治疗帕金森的药物的前景。
附图说明
12.图1为间充质干细胞在100倍镜下观察结果；
13.图2为干细胞微粒的电镜观察结果；
14.图3为干细胞微粒cd63、tsg101、cd9蛋白检测结果；
15.图4为nta测定结果；
16.图5为转棒疲劳实验结果；
17.图6为小鼠纹状体、黑质中蛋白检测结果。
具体实施方式
18.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
19.一、实验材料
20.干细胞来源：第1代干细胞(p0)为由四川大学华西妇产儿童医院产科提供的新生儿脐带组织中分离的华通氏胶，经过组织培养法获得。母体年龄控制在20-32周岁，且母体与婴儿经过严格筛查，不具有传染性疾病及严重的遗传性疾病。细胞质量标准为：cd105、cd90、cd73≥95％；cd45、cd19、cd34、cd11b和hla-dr≤2％，且具有体外诱导三分化能力。
21.干细胞培养基：按照专利cn112143695a配制。
22.显微镜与透射电子显微镜：显微镜使用leicadmi1倒置显微镜；透射电子显微镜选用日立(ht7800)。
23.离心机与超高速离心机：离心机使用贝克曼库尔特allegrax-12系列离心机；超高速离心机使用贝克曼库尔特optimaxpn系列超高速离心机。
24.纳米颗粒跟踪分析(nta)：使用德国particlemetrix公司的zetaviewtwinpmx-220。
25.bca蛋白定量试剂盒：购买自上海碧云天，货号p0009。
26.surepage-凝胶：购买自金瑞斯生物科技。
27.检测微粒标志抗体，cd63(af5117)、cd9(af5193)、tsg101(df8427)均购自affinity公司。多巴胺转运体(ab184451)、酪氨酸羟化酶(ab137869)、α-突触核蛋白(ab138501)、磷酸化α-突触核蛋白(ab51253)，内参gapdh(ab8245)均购自abcam公司。
28.chemidoc
tm
触摸成像系统：使用bio-rad公司chemidoc
tm mp。
29.mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)：mptp购自东京化成，编号m2690。将500mg mptp溶解于50ml pbs溶液当中，构成10mg/ml的溶液用于帕金森动物模型的构建。
30.小鼠：c57bl/6雄性8周小鼠被用于实验，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
31.转棒疲劳测试仪：使用上海欣软信息科技有限公司的xr1514测试仪。
32.二、实验方法
33.1、干细胞培养
34.将1ml第1代间充质干细胞与上述培养基轻柔混匀，使用移液枪将混合液转移到175mm细胞培养皿中，置于37℃5％co2细胞培养箱中孵育。每三天更换一次培养基，并置于leica倒置显微镜下观察细胞形态、数量。待细胞生长至约占培养皿的70％-80％后，加入0.25％胰蛋白酶3ml，在37℃5％co2孵箱中消化5min。随后加入5ml pbs摇晃均匀，并将细胞悬液于20℃1000g离心机离心3min。离心后舍弃上清液，用培养基重悬沉淀细胞，重新铺板用于传代培养直至第5代(p5)。
35.2、干细胞微粒提取和鉴定
36.待第5代间充质干细胞增殖至80％以上融合时，弃去细胞上清，加入5ml pbs，冲洗3遍；吸尽瓶中残留的pbs，用不加血清血清培养基，于37℃co2培养箱中饥饿培养48小时，诱导干细胞释放mvs。干细胞饥饿培养48小时后，置于无菌操作台中，用电动移液枪吹打细胞
表面数次后，收集细胞上清液至50ml离心管中，4℃400g离心10min后，再4℃2000g离心20min。仔细的将上清液转移到一个新的50ml离心管中，弃去沉淀。将收集的上清液，转移到超高速离心机专用离心管中；将离心管置于超高速离心机中，用电子秤严格配平，4℃50000g离心2小时，弃去上清，将离心管中的沉淀用pbs洗涤并转移到另一个离心管中，再次离心4℃50000g 2小时，弃去上清，用1ml pbs重悬沉淀，即得提取的mvs，-80℃保存备用。取适量mvs，于电镜下观察，western blot测定cd63、tsg101、cd9蛋白表达，纳米颗粒跟踪分析(nta)测量微粒内径。
37.3、帕金森动物模型制备、分组和给药处理
38.使用mptp进行帕金森动物模型的构造。mptp帕金森动物模型是目前公认的、使用最广泛的帕金森症的动物模型。参考文献包括(doi:10.1002/npr2.12060，doi:10.18632/aging.102221.，doi:10.1016/j.neulet.2020.135032.)。
39.首先将8周雄性c57bl/6小鼠随机分为4组，每组8只，分别为：
40.1、盐水 盐水组；
41.2、盐水 微粒组；
42.3、mptp 盐水组；
43.4、mptp 微粒组。
44.帕金森动物模型的制备方法是在造模日当天，分别于上午9点、11点与下午1点通过腹腔注射的方式，向造模组小鼠注射mptp(10mg/kg)，同时给予对照组腹腔注射等量盐水。造模一周后，使用微粒进行治疗。将提取出的间充质干细胞微粒溶解于盐水，最终浓度为2.5μg/ml，通过尾静脉注射的方式，微粒治疗组每只老鼠注射5μg微粒，对照组注射等量盐水。
45.4、小鼠行为学测试
46.微粒治疗一周后，进行行为学测试。使用xr1514型号的大小鼠转棒疲劳测试仪(购自上海欣软信息科技有限公司)进行检测，设置转速为30r/min，时间为5min。记录小鼠在转棒上的运动时间，测试3次取平均值。在测试前要对小鼠进行转棒训练3次。
47.5、小鼠大脑纹状体、黑质中蛋白检测
48.将大脑纹状体、黑质置于液氮中研磨，研磨粉碎后加入细胞裂解液并充分混匀。使用bca蛋白质测定试剂盒定量含50ug蛋白质溶液，后加入β-巯基乙醇在95℃下加热5分钟，-20℃保存以备使用。使用surepage-凝胶对蛋白质溶液进行凝胶电泳。电泳后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。将膜在2％bsa中室温封闭1小时，封闭后分别与对应抗体(多巴胺转运体、酪氨酸羟化酶、α-突触核蛋白、磷酸化α-突触核蛋白)在4℃下共同孵育过夜。第二天，将印迹在tbst中洗涤3次后，与二抗(gapdh)室温下孵育1小时。在最后3次洗涤后，使用chemidoc
tm
触摸成像系统捕获图像并分析图像。
49.6、统计学分析
50.使用统计分析软件spss(verison 20)进行数据分析。数据均采用双因素方差分析(two-way anova)进行统计分析。星号代表有统计学差异，*代表p《0.05，**代表p《0.01，***代表p《0.001。
51.三、实验结果
52.1、干细胞观察结果
53.间充质干细胞在100倍镜下观察结果如图1所示，呈梭形，符合间充质干细胞的特点。
54.2、干细胞微粒鉴定结果
55.干细胞微粒的电镜观察结果如图2所示，形态良好，符合干细胞微粒的特点。western blot测定结果如图3所示，cd63、tsg101、cd9蛋白阳性表达，符合干细胞微粒的特点。
56.nta测定结果如图4所示，微粒内径约100-1000之间，符合微粒内径长度。
57.3、小鼠行为学测试结果
58.转棒疲劳实验结果如图5所示，mptp造模的小鼠在转棒上的停留时间明显降低，而干细胞微粒治疗能够缓解这种降低，说明干细胞微粒能够缓解帕金森模型小鼠的行为异常。
59.4、小鼠大脑纹状体、黑质中蛋白检测结果
60.纹状体、黑质中蛋白检测结果如图6所示，帕金森模型小鼠纹状体与黑质中多巴胺转运体和酪氨酸羟化酶表达降低、α-突触核蛋白磷酸化比例增高，而干细胞微粒能够改善帕金森模型小鼠的蛋白表达紊乱，恢复神经细胞的功能。
61.上述实验结果说明，干细胞微粒可以有效缓解帕金森病的症状。因此，干细胞微粒具备开发成治疗帕金森的药物的前景。
62.上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。