PEI-MXene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用

pei-mxene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用
技术领域
1.本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种pei-mxene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用。


背景技术：

2.在变化多端、灾害频繁的自然因素下，各种不利逆境都对植物生长过程中产生生存压力。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。其中，土壤盐渍化及土壤干旱均是制约作物生长与产量形成的主要环境因素之一。土壤盐渍化（soil salinization）是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。主要发生在干旱、半干旱和半湿润地区。盐碱土的可溶性盐主要包括钠、钾、钙、镁等的硫酸盐、氯化物、碳酸盐和重碳酸盐。干旱是指淡水总量少，不足以满足人的生存和经济发展的气候现象，一般是长期的现象。干旱区约占陆地面积的30%。目前治理土壤盐渍化和干旱的方法包括化学改良措施、生物改良措施和综合改良措施。
3.纳米生物技术是一门新兴的跨学科的前沿工具。在农业科学领域中，越来越多纳米技术被应用于研究如何促进植物生长和提高农作物产量。比如，wu et al（2017）证明了带负电荷的氧化铈纳米颗粒在过量光、热的条件下增加了拟南芥的光合作用以及 ros 的清除能力；alabdallah and alzahrani (2020)证明了盐胁迫下zno或zno np可提高光合色素的含量、sod和cat的活性，然后降低脯氨酸和总可溶性糖的积累。庞星月（2022）等发现了外源sls、n-k2moo4可以通过提高油菜种子萌发期的保护酶活性和渗透调剂物质含量从而来提高油菜的抗旱性。mxene(二维过渡金属碳-氮化物))是一种新兴的纳米材料，具有良好的导电性、亲水性等特点，一般被应用于电池、电容器等储能领域。目前，并未发现mxene作为量子点被应用到植物抗逆上的记载。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种pei-mxene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用，通过将pei-mxene量子点喷施于植物表面，提高植物在盐碱环境中的生存能力。
5.本发明的技术方案如下：本发明提供了一种pei-mxene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用，所述pei-mxene量子点的制备方法包括以下步骤：将ti3c
2 mxene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液透析，即得。
6.优选的，所述ti3c
2 mxene粉末和聚乙烯亚胺的质量比为1~3：1。
7.优选的，所述离心为3000~8000rpm下离心3~10 min。
8.优选的，透析前，调整所述上清液的ph为6-8。
9.优选的，所述透析后的溶液进行冷冻干燥。
10.本发明中，作为一种实施方式，将所述pei-mxene量子点对植物进行叶面处理，所述pei-mxene量子点的使用浓度在40 mg/l以上。
11.优选的，所述植物为双子叶植物；进一步的，所述植物为油菜或棉花。
12.优选的，所述抗逆为抗盐碱或抗干旱胁迫。
13.本发明还提供了一种mxene量子点叶面喷施肥，所述叶面喷施肥中包括上述的pei-mxene量子点和表面活性剂。
14.优选的，所述表面活性剂的质量浓度为0.05%-0.5%。
15.本发明的有益效果：本发明提供的pei-mxene量子点可以有效提高植物的抗逆胁迫能力。通过试验表明，本发明pei-mxene 量子点对植物进行叶面处理后，能够提高盐胁迫下植物的生物量，植株鲜重增加，叶片明显增大。植物叶片中的活性氧含量明显降低。
16.本发明的pei-mxene量子点具有提高植物抗逆胁迫的作用，制备成叶面喷施肥，价格低廉、制备简单、水溶性好、生物相容性好、无毒副作用等特点，使用方法简便，作用明显。
附图说明
17.图1为本发明pei-mxene量子点的表征数据，其中，(a)：pei-mqd 的 tem 图像；(b)：pei-mqd的tem；(c)：pei-mqd的水合粒径；(d)：荧光光谱仪测定pei-mqd不同激发光下的荧光强度；(e)：pei-mqd的电位；(f)：pei-mqd的xrd图像；(g)：pei-mqd的ftir图像。
18.图2为pei-mqd 在340 nm 激发光下的荧光强度随时间的变化，其中，(a)：室温条件下，(b)：h2o2条件下。
19.图3为pei-mqd 溶液中ti的含量，其中，(a)： 200 mg/l pei-mqd 溶液中ti的含量；(b)：200 mg/l pei-mqd 原溶液与200 mg/l pei-mqd加了h2o2第3天的溶液用300 nm 透析袋透析48 h后透析袋外液体中ti的含量。
20.图4为pei-mqd在油菜和棉花叶片的共定位，其中，(a)(c)：fitc pei-mqd在油菜和棉花的共定位情况；(b)(d)：分别为油菜和棉花上的共定位率。
21.图5为pei-mqd在盐胁迫下油菜的表型、鲜重及叶片长宽。
22.图6为pei-mqd在盐胁迫下棉花的表型、叶绿素含量及鲜重。
23.图7为pei-mqd在干旱胁迫下棉花的表型、鲜重、干重、相对含水率和ttf含量。
24.图8为油菜叶片内hpf、dhe和h2dcfda的荧光强度，其中，左图：染色图片，右图：荧光值统计。
25.图9为棉花叶片内hpf、dhe和h2dcfda的荧光强度，其中，左图：染色图片，右图：荧光值统计。
具体实施方式
26.本发明提供了pei-mxene量子点在提高植物抗逆胁迫中的应用。本发明将所述pei-mxene量子点对植物进行叶面处理，可以提高植物的耐盐碱、耐旱胁迫性能，提高盐碱、干旱胁迫下植物的生物量，降低植物叶片中的活性氧含量。
27.本发明中所述pei-mxene量子点的制备方法包括以下步骤：将ti3c
2 mxene粉末和聚乙烯亚胺溶于水中，在110~130℃下反应7~9 h，反应后的液体离心，取上清液用透析袋透析，得到pei-mxene qd 纳米颗粒。
28.本发明中，ti3c
2 mxene粉末和聚乙烯亚胺的质量比优选为1~3：1，更优选为2：1。作
为一种实施方式，本发明聚乙烯亚胺与水的质量体积比为2~3：1。作为一种实施方式，本发明在上述混合溶液中充惰性气体5~10min，排除溶液中的氧气，防止ti3c
2 mxene粉末被氧化，尽可能保证水热反应在无氧的环境下发生。
29.本发明将ti3c
2 mxene粉末和聚乙烯亚胺的混合溶液在110~130℃下反应7~9 h。优选反应在聚四氟乙烯反应釜中进行，反应温度优选为120℃，反应时间优选为8 h。反应后得到淡黄色溶液进行离心。本发明对离心的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规离心方法即可。本发明优选离心速率为3000~8000rpm，更优选为4000~6000rpm；离心时间优选为3~10 min，更优选为5~6min。
30.离心后的上清液用透析袋透析，得到pei-mxene量子点。作为一种可实施的方式，透析前，调整所述上清液的ph为6~8，优选为7。可选的，用盐酸溶液调节ph值。本发明的透析袋采用常规透析袋，透析袋的分子截留量为3500 da，对透析袋的来源没有特殊限定。透析时间优选的为24~48h，间隔8~12 h换一次水。透析得到的溶液中含有pei-mxene量子点。为了便于使用和储存，将透析液冷冻干燥，得到pei-mxene量子点的粉末。
31.通过对本发明制备得到的pei-mxene量子点tem图像中可以看到，本发明的pei-mxene量子点为粒径大约2-3 nm的纳米颗粒，pei-mxene量子点的晶格间距约为0.268nm，符合对碳量子的普遍认知。
32.本发明将所述pei-mxene量子点对植物进行叶面处理，可以提高植物的耐盐碱、耐旱胁迫性能，提高盐碱、干旱胁迫下植物的生物量，降低植物叶片中的活性氧含量。作为一种可选的实施方式，所述pei-mxene量子点的使用浓度在40 mg/l以上，更优选为50-200mg/l。
33.本发明所指的植物优选为双子叶植物。进一步的可以为十字花科植物，如油菜；或锦葵科植物，如棉花。本发明由于材料限制，并未提供单子叶植物的相关实验，但预估会出现与双子叶植物相同或相似的效果。
34.本发明还提供了一种mxene量子点叶面喷施肥，所述叶面喷施肥中包括上述的pei-mxene量子点和表面活性剂。作为优选的，所述药剂中的pei-mxene量子点的有效作用浓度为40 mg/l以上，更优选为50-200mg/l。本领域技术人员可以适当调节叶面喷施肥中pei-mxene量子点的浓度，例如高浓缩型叶面喷施肥，便于生产、运输和贮藏，使用时，稀释至所需浓度即可。
35.本发明中的表面活性剂优选为有机硅表面活性剂。有机硅表面活性剂毒性低，安全性好，在同等浓度的溶液中具有更低的表面张力，能够更好的使碳量子点均匀的附着在植物叶片表面，提高植物光合作用的效果。所述有机硅表面活性剂可选的为silwet，可以商业购买得到。本发明表面活性剂添加的质量浓度优选的为0.05%-0.5%，更优选的为0.1%-0.4%。
36.本发明将pei-mxene量子点和表面活性剂混合，对植物进行叶面处理后，能够提高盐胁迫下植物的生物量，植株鲜重增加，叶片明显增大。植物叶片中的活性氧含量明显降低。
37.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.以下实施例中的ti3c
2 mxene粉末购自吉林省科技有限公司，聚乙烯亚胺货号为
sigma mv 1800，本领域技术人员可自由选择材料来源。
39.以下实施例以油菜和棉花为例，说明pei-mxene 量子点可以有效提高植物的抗逆胁迫能力。
40.实施例1本实施例提供一种pei-mxene量子点（pei-mqd）的制备方法。
41.将50 mg ti3c
2 mxene粉末（吉林省科技有限公司）分散于10 ml超纯水中，加入25 mg聚乙烯亚胺(sigma mv 1800)。然后，在得到的分散液中通入n2保护5 min以去除溶液中多余的氧气，尽可能保证水热反应在无氧的环境下发生。随后在微型高压反应釜（25 ml反应釜）中120 ℃反应8 h，冷却至室温。随后5000 rpm离心5 min以除去沉淀物，然后将得到的上清液加入3 m hcl调节反应液的ph值，直至ph=7左右。所得溶液用分子截留量为3500 da的透析袋在超纯水中透析48 h，间隔12 h换一次水，最后的产品经冷冻干燥后得到粉末，密封放入干燥器中待用。
42.从图1可以看到，合成的pei-mxene 量子点粒径大约为2-3 nm，右上角的小图是pei-mxene qd 纳米颗粒的晶格图片。经过测量，本发明的pei-mxene qd 纳米颗粒的晶格间距约为0.268 nm，符合对碳量子的普遍认知。pei-mxene 量子点的最强激发光波长在340nm。
43.实施例2pei-mqd的降解pei-mqd在室温下的降解将8个装有3 ml 200 mg/l pei-mqd的离心管在室温（21-24 ℃）条件下避光放置，后依次测定pei-mqd在0 h、0.5 h、1 h、3 h、7 h、12 h、24 h、72 h时340 nm的荧光强度，观察其变化。
44.pei-mqd在h2o2（100μm)下的降解将30μl 30% h2o2迅速加入装有3 ml 200 mg/l pei-mqd的离心管（用锡纸包裹，避光）中，8个重复，摇匀，后将其室温（21-24 ℃）避光放置，按开始加入过氧化氢时的0 h（对照，未加过氧化氢）、0.5 h、1 h、3 h、7 h、12 h、24 h、72 h依次测定pei-mqd在340 nm的荧光强度，观察其变化。
45.结果如图2所示。说明本发明的pei-mqd在室温下有极高的稳定性，72h内基本无降解。pei-mqd在h2o2条件下降解。
46.为进一步验证其是否降解，将最初未加过氧化氢的200 mg/l pei-mqd的溶液和加了过氧化氢第三天的pei-mqd溶液各取3 ml放入装有40 ml超纯水的离心管中进行透析(透析袋的分子截留量为300 da)，48 h后将透析袋外溶液用35 ℃烘箱烘干至15 ml提高ti的浓度，最后将所得溶液过220 nm的滤膜后送样检测，测定溶液中钛的含量。
47.结果见图3，可以看出加了过氧化氢的pei-mqd溶液在透析后溶液中钛的含量与未加过氧化氢的pei-mqd溶液中钛含量相比有显著降低，进一步说明本发明的pei-mqd在h2o2条件下会分解。
48.实施例3pei-mqd在油菜和棉花叶片中的共定位合成fitc pei-mqd ：用 fitc（3',6'-dihydroxy-5-isothiocyanato-3h-spiro
[isobenzofuran-1,9'-xanthen]
ꢀ‑
3-one ，一种荧光基团，sigma）标记 mqd。将 200μl 100%酒精、50μl 2.5 mg/ml fitc(无水乙醇溶解) 、1ml 50%酒精和1ml、2000 mg/l mqd（溶解在纯水中）依次加入 20 ml 玻璃小瓶中，以 1000 rpm 混合 5 分钟。 使用 10 kda 过滤器 (4200 g ，5 分钟一次，至少8次) 纯化所得混合物以去除游离化学物质。最终溶液标记为 fitc-mqd 并储存在4
°
c 的冰箱中以供进一步使用。
[0049]
将合成的fitc pei-mqd与silwet（浓度：万分之五）混合后涂抹到油菜和棉花叶片，暗适应3个小时，取处理后的油菜和棉花第三片叶用打孔器打孔取叶盘并将其装入载玻片内（预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺（pfd）以防止荧光猝灭），盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40 倍物镜，488 nm 激发光；pmt1： 515 nm-525 nm；pmt2：700 nm-785 nm；作 4-6 次重复，使用las软件进行共定位分析。
[0050]
由图4可知，在共聚焦显微镜的观察下，用fitc pei-mqd处理的油菜和棉花叶片内具有一定强度的荧光信号，而在对照组内没有观察到相应的荧光信号，说明pei-mqd可以进入细胞。
[0051]
实施例4油菜盐胁迫实验本实施例中使用的油菜品种为中双11。
[0052]
油菜种子用1 % naclo浸泡15分钟，随后用纯水冲洗5分钟，吸水纸上晾干后挑取颗粒饱满，均匀一致的种子放入发芽盒中，内装10 ml纯水铺上两层吸水纸便于根系生长。放在暗培室进行培养，培养室温度设置为：日间21
±
0.5℃，夜间 19
±
0.5℃，湿度条件为：55%-65%。生长7天后将其移至土壤（营养土与蛭石比为1：1）中培养，土培室温度设置：20℃
±
1℃，湿度条件为：55%-65%，光强为：120
µ
mol
·
m-2 s ‑1。待其长出两片真叶时，挑选大小、生长状况一致的幼苗用纳米材料对其进行叶面处理。
[0053]
处理方式：移液枪涂抹，每片叶大约100μl；对照组: 纯水加0.05% silwet（源叶公司）；处理组：实施例1的pei-mqd溶液加0.05% silwet。
[0054]
将处理后的苗子暗适应3个小时后加入1.5 l 200 mm nacl溶液，待25天后（生长期间定期补加1 l nacl溶液）测定其干鲜重、叶面长宽等表型数据。
[0055]
图5（a）为油菜在盐胁迫下培养25天后的表型图，（b）-（d）为油菜在盐胁迫下的鲜重及叶片大小。相比于对照组，施用本发明pei-mqd溶液处理组油菜长势较好，能明显提高油菜在盐胁迫下的植株鲜重及叶片长宽度，植株损害明显减轻。
[0056]
实施例5棉花盐胁迫实验本实施例中使用的棉花品种为新陆早74。
[0057]
棉花种子用0.3 % h2o2浸泡3分钟，随后用自然水冲洗40分钟，吸水纸上晾干，后将其播到土壤（营养土与蛭石比为1：1）中，土培室温度设置：20℃
±
1℃，湿度条件为：55%-65%，光强为：120
µ
mol
·
m-2 s ‑1。待其生长10天之后将其根部洗净移至营养液中培养，等幼苗长出两片真叶时，挑选大小、生长状况一致的幼苗用纳米材料对其进行叶面处理。
[0058]
处理方式：移液枪涂抹，每片叶大约100μl；对照组: 纯水加0.05% silwet（源叶公司）；
处理组：实施例1的pei-mqd溶液加0.05% silwet。
[0059]
将处理后的苗子暗适应3个小时后加入1.5 l 200 mm nacl溶液，生长期间定期补加1 l nacl溶液。待5天后测定其干鲜重、叶面长宽等表型数据。
[0060]
棉花营养液配方如下：100 ml钙盐、50 ml大量和25 ml铁盐混合定容到5 l。
[0061]
钙盐的配置：称取66.6 g cacl2和47.2 g ca(no3)4溶于1 l水中。
[0062]
大量的配置：称取43.6 g k2so4、13.6 g kh2po4和101 g mgso4·
7h2o溶于1 l水中。
[0063]
铁盐的配置：称取0.6527 g na2edta和0.4865 g feso4·
7h2o溶于800 ml水中。
[0064]
图6（a）为棉花在250 mm nacl 胁迫下第10天的表型图，（b）为棉花在250 mm nacl 胁迫下第10天的第一片真叶的叶绿素含量，（c）为棉花在250 mm nacl 胁迫下第10天的鲜重。可以看出，施用本发明pei-mqd溶液处理组棉花的抗逆碱性能明显提高，植株鲜重及叶片叶绿素含量明显高于对照组。
[0065]
实施例6棉花耐旱性试验本实施例中使用的棉花品种为新陆早74。
[0066]
棉花种子用0.3 % h2o2浸泡3分钟，随后用自然水冲洗40分钟，吸水纸上晾干，后将其播到土壤（营养土与蛭石比为1：1）中，土培室温度设置：20℃
±
1℃，湿度条件为：55%-65%，光强为：120
µ
mol
·
m-2 s ‑1。待其生长10天之后将其根部洗净移至营养液中培养，等幼苗长出两片真叶时，挑选大小、生长状况一致的幼苗用纳米材料对其进行叶面处理。
[0067]
试验以10% peg（质量比，渗透势-0.17mpa）水培体系模拟棉花干旱胁迫。试验设置三个处理组：空白对照处理以及100 mg/l、200 mg/l pei-mqd处理。干旱处理7天后明确植株表型，测定生物量等相关数据。
[0068]
叶片相对含水率的测定取干旱胁迫处理7天后的棉花植株，将根部用自来水冲洗干净后擦干，使用电子天平测定重量，记为鲜重(fw)，之后将其放入盛水的培养皿中(水量占培养皿2/3)，浸泡后待植株中重量恒定，用吸水纸将其叶面水擦干，称其重量，记为饱和鲜重(sfw)，fw与sfw均在室温下测定，温度25℃，湿度60%～70%。之后将所有样品放入烘箱，105℃杀青30min，再置于80℃烘干至恒重，冷却至室温后称其干重(dw)。
[0069]
叶片相对含水量计算公式为:rwc%=(fw-dw) /(sfw-dw)
×
100。
[0070]
根系活力取棉花幼苗根系0.1 g，用清水洗净后把地上部分从茎基切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液（1%ttc溶液、0.4mol/l的琥铂酸、ph为7磷酸缓冲液）按1:5:4比例混合，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1-3小时，以观察着色情况，根系呈明显红色表明此处有脱氢酶的存在。定量分析时，用甲醇溶液在暗处对生成的ttf色素进行提取3小时左右，之后在吸光度485 nm处对提取液进行比色，与标曲进行比对得到ttf色素含量。
[0071]
图7为pei-mqd在干旱胁迫下棉花的表型、鲜重、干重、相对含水率和ttf含量。通过图7可以表明，两种浓度的pei-mqd均显著改善了干旱胁迫下的棉花生长。
[0072]
实施例7
油菜和棉花叶片共聚焦成像实验使用激光共聚焦显微镜对油菜和棉花叶片叶肉细胞内活性氧进行成像。使用二氢乙锭（dhe）、2
′
，7
′‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯（h2dcfda）和羟基苯基荧光素（hpf）分别作为
·o2-、h2o2和
·
oh的荧光染料。
[0073]
pei-mqd处理25天后，取处理后的油菜和棉花第三片叶用打孔器打孔取叶盘浸泡于 25 μm h2dcfda 、10 μm dhe 染料和10 μm hpf（用10 mm tes稀释，ph为7.5）中，黑暗条件下用h2dcfda孵育30 min、dhe孵育45 min、hpf孵育90 min。孵育结束后，用tes冲洗三次，并将其装入载玻片内（预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺（pfd）以防止荧光猝灭），盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40 倍物镜，488 nm 激发光；pmt1： 500 nm-600 nm；pmt2：700 nm-790 nm；作 4-6 次重复，使用image j软件计算 h2dcfda 和 dhe 荧光强度。
[0074]
图8-9是通过imagej软件分析得到的荧光强度。在盐胁迫25天后，由pei-mqd处理后的油菜和棉花叶片内的
·
oh、
·o2-和h2o2的含量显著低于对照组，说明本发明的pei-mqd 能够有效清除油菜和棉花叶片中的活性氧。
[0075]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。