一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法与流程

1.本发明涉及一种含量测定方法，特别是涉及一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法，属于含量测定方法技术领域。


背景技术：

2.玄参为玄参科植物玄参的干燥根，味甘、苦、咸，微寒，功能清热凉血，滋阴降火，解毒散结。
3.玄参中主要化学成分为环烯醚萜类、苯丙素类、萜类成分、苯酚及苯乙醇苷类、黄酮及甾体成分等，近年来研究表明玄参在抗炎、治疗神经退行性疾病、治疗糖尿病、保肝、抗肿瘤、抗氧化等方面具有很好的药理活性，哈巴俄苷为环烯醚萜苷类成分，是玄参主要的功效成分之一，在玄参药材和饮片中的含量作为质量控制标准现收载于2020年版中国药典一部。
4.目前中国药典、美国药典、日本药典、欧洲药典等均对所收载的植物药材中活性成分含量做出最低限度要求，并多采用高效液相色谱仪使用外标法或者内标法进行检测，通常高效液相仪配备的各种常规检测器如紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器等仅有一个信号与待测成分或者标准物质的注入量相关，如峰面积、峰强度等。
5.在一定质量浓度范围内仪器检测信号与注入量二者相互对应并具有良好的线性关系，这是常规传统的定量测定方法，这种依据检测仪器上数值信号的定量方法严重依赖了仪器自身的制作工艺水准，引入了诸多的不稳定因素，如信号波动。
6.为此，开发在分析测定仪器上以待测成分自身信号间定量关系为依据的含量测定方法，完善并扩展定量分析的方法与途径。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的是为了提供一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法，。
8.本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
9.一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法，包括如下步骤：
10.供试品溶液制备步骤：
11.取0.5g玄参药材，研磨粉碎，取出粉碎后的玄参药材放置于烧杯内；
12.将50ml甲醇水溶液倒入至烧杯内浸泡玄参药材1h；
13.对浸泡1h后的溶液进行超声提取30min，提取液过滤即得到供试品溶液；
14.对照品溶液配制步骤：
15.取哈巴俄苷对照品适量，精密称定；
16.加甲醇水溶液稀释制成系列质量浓度的溶液，得到对照品溶液；
17.含量测定步骤：
18.精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；
19.记录质谱图，测定离子峰强度，计算比值，绘制标准曲线；
20.在同样的条件下，对供试品溶液进行检测，根据上述标准曲线，得到玄参药材中哈巴俄苷的含量。
21.优选的，液相色谱仪采用超高效液相色谱仪联用单四级杆质谱检测器。
22.优选的，色谱柱为behc18色谱柱，2.1
×
50mm,1.7μm，流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.39min，3％a；1.39～1.67min，3％～15％a；1.67～4.86min，15％～35％a；4.86～6.25min，35％～60％a；6.25～7.64min，60％～80％a；7.64～9.03min，80％a；9.03～9.33min，80％～3％a；9.33～10.00min，3％a；检测波长为278nm；流速为0.3ml/min，进样量为10μl。
23.优选的，质谱条件：使用电喷雾电离源(esi)，正离子模式；
24.毛细管电压为1.5kv；探针温度为600℃；
25.采样速率为10点/秒；
26.采用多离子监测扫描模式。
27.优选的，在供试品溶液制备步骤中甲醇水溶液为体积浓度50％的甲醇水溶液。
28.优选的，在对照品溶液配制步骤中所述甲醇水溶液为体积浓度50％的甲醇水溶液；
29.在对照品溶液配制步骤中所述哈巴俄苷系列质量浓度的溶液依次为50、39、30、21、9、6、3μg
·
ml-1
。
30.优选的，超高效液相色谱仪为二元溶剂管理器binary solvent manager(bsm)，样品管理器sample manager(ftn)，二极管阵列检测器eλdetector(pda)，柱温箱column heater(ch-a)；
31.所用单四级杆质谱检测器为waters qda配有电喷雾电离源(esi)；
32.单四级杆质谱检测器qda与二极管阵列检测器pda是通过非最小死体积管线进行连接的；
33.所述非最小死体积管线为管线内径和总长度共同作用下可以延长哈巴俄苷离子化时间大于0.2min；
34.所述非最小死体积管线为选自peek材质管线、不锈钢材质管线、ptfe橡胶材质管线的一种或者几种；
35.所述非最小死体积管线为管线中间任意位置可以连接有阻尼装置；
36.优选的，非最小死体积管线为peek材质的regulator,back pressure,250psi(#700010006)(waters)背压管线。
37.优选的，液相色谱-质谱条件中采用多离子监测扫描模式(full scan)，质量扫描范围为500-800道尔顿，扫描时间4-7min；
38.所述配制流动相用水为屈臣氏商品蒸馏饮用水。
39.优选的，在含量测定步骤中所述比值为哈巴俄苷esi离子源内裂解加合形成的准分子-离子761离子簇强度和770离子簇强度之和与哈巴俄苷在esi离子源内加na

离子形成517[m na]

离子簇强度的相对比值；
[0040]
所述哈巴俄苷esi离子源内加na 离子形成517[m na]

离子簇强度为512-541道尔顿范围内所有离子强度之和；
[0041]
所述哈巴俄苷esi离子源内裂解加合形成的准分子-离子761离子簇强度和770离
子簇强度之和为753-774道尔顿范围内所有离子强度之和。
[0042]
优选的，在含量测定步骤中所述标准曲线以相对比值为纵坐标、对照品的注入量(ng)为横坐标进行绘制。
[0043]
本发明的有益技术效果：
[0044]
本发明提供的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法，配制标准品溶液，采用超高压液相色谱串联单四级杆质谱检测器进行检测，记录质谱图，测定主离子与加合离子峰强度，计算强度间比值，绘制比值与含量的标准曲线；在同样的条件下，对供试品溶液进行检测，根据上述标准曲线，得到药材中哈巴俄苷的含量。
[0045]
本发明主要采用的是一种单四级杆质谱检测器上成分自身的离子强度间比值替代仪器数值型检测信号的定量方法。
[0046]
该方法与单纯采用检测器上主离子强度、主离子峰簇强度、各源内裂解峰簇强度的定量方法相比，通过增加色谱柱后管线长度来延长待测成分在仪器上的离子化过程，并利用离子簇强度间比值进行定量，结果更为标准客观，可以满足标准曲线的线性要求。
[0047]
本发明完善了药材含量测定方式和范围，适用于含哈巴俄苷的玄参原材料、饮片以及中药生产过程中的质量控制。
附图说明
[0048]
图1为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的单四级杆质谱检测器qda与二极管阵列检测器pda通过非最小死体积管线连接示意图；
[0049]
图2为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的对照品哈巴俄苷多离子监测扫描模式(full scan)500-800道尔顿轮廓图；
[0050]
图3为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的玄参药材多离子监测扫描模式(full scan)500-800道尔顿轮廓图；
[0051]
图4为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的对照品哈巴俄苷总离子流(tic)图；
[0052]
图5为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的玄参药材中哈巴俄苷总离子流(tic)图；
[0053]
图6为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的对照品哈巴俄苷517离子簇、761离子簇和770离子簇光谱图；
[0054]
图7为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的玄参药材中哈巴俄苷517离子簇、761离子簇和770离子簇光谱图；
[0055]
图8为按照本发明的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法的一优选实施例的比值与注入量的标准曲线图。
具体实施方式
[0056]
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0057]
下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商品渠道获得。
[0058]
对照品哈巴俄苷(harpagoside，批号：must-12071801，成都曼斯特)；色谱级乙腈、甲醇(fisher，美国)；质谱级甲酸(clamar，中国)；屈臣氏蒸馏饮用水。
[0059]
八批次玄参药材采购于河北安国药材市场、玄参gap基地、网络药材平台及药材公司。
[0060]
如图1-图8所示，本实施例提供的一种用于玄参药材中哈巴俄苷的含量测定方法，包括如下步骤：
[0061]
供试品溶液制备步骤：
[0062]
取0.5g玄参药材，研磨粉碎，取出粉碎后的玄参药材放置于烧杯内；
[0063]
将50ml甲醇水溶液倒入至烧杯内浸泡玄参药材1h；
[0064]
对浸泡1h后的溶液进行超声提取30min，提取液过滤即得到供试品溶液；
[0065]
对照品溶液配制步骤：
[0066]
取哈巴俄苷对照品适量，精密称定；
[0067]
加甲醇水溶液稀释制成系列质量浓度的溶液，得到对照品溶液；
[0068]
含量测定步骤：
[0069]
精密吸取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定；
[0070]
记录质谱图，测定离子峰强度，计算比值，绘制标准曲线；
[0071]
在同样的条件下，对供试品溶液进行检测，根据上述标准曲线，得到玄参药材中哈巴俄苷的含量。
[0072]
在本实施例中，液相色谱仪采用超高效液相色谱仪联用单四级杆质谱检测器。
[0073]
在本实施例中，色谱柱为behc18色谱柱，2.1
×
50mm,1.7μm，流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.39min，3％a；1.39～1.67min，3％～15％a；1.67～4.86min，15％～35％a；4.86～6.25min，35％～60％a；6.25～7.64min，60％～80％a；7.64～9.03min，80％a；9.03～9.33min，80％～3％a；9.33～10.00min，3％a；检测波长为278nm；流速为0.3ml/min，进样量为10μl。
[0074]
在本实施例中，质谱条件：使用电喷雾电离源(esi)，正离子模式；
[0075]
毛细管电压为1.5kv；探针温度为600℃；
[0076]
采样速率为10点/秒；
[0077]
采用多离子监测扫描模式。
[0078]
在本实施例中，在供试品溶液制备步骤中甲醇水溶液为体积浓度50％的甲醇水溶液。
[0079]
在本实施例中，在对照品溶液配制步骤中所述甲醇水溶液为体积浓度50％的甲醇水溶液；
[0080]
在对照品溶液配制步骤中所述哈巴俄苷系列质量浓度的溶液依次为50、39、30、21、9、6、3μg
·
ml-1
。
[0081]
在本实施例中，超高效液相色谱仪为二元溶剂管理器binary solvent manager(bsm)，样品管理器sample manager(ftn)，二极管阵列检测器eλdetector(pda)，柱温箱column heater(ch-a)；
[0082]
所用单四级杆质谱检测器为waters qda配有电喷雾电离源(esi)；
[0083]
单四级杆质谱检测器qda与二极管阵列检测器pda是通过非最小死体积管线进行
连接的；
[0084]
所述非最小死体积管线为管线内径和总长度共同作用下可以延长哈巴俄苷离子化时间大于0.2min；
[0085]
所述非最小死体积管线为选自peek材质管线、不锈钢材质管线、ptfe橡胶材质管线的一种或者几种；
[0086]
所述非最小死体积管线为管线中间任意位置可以连接有阻尼装置；
[0087]
优选的非最小死体积管线为peek材质的regulator,back pressure,250psi(#700010006)(waters)背压管线。
[0088]
在本实施例中，液相色谱-质谱条件中采用多离子监测扫描模式(full scan)，质量扫描范围为500-800道尔顿，扫描时间4-7min；
[0089]
所述配制流动相用水为屈臣氏商品蒸馏饮用水。
[0090]
在本实施例中，在含量测定步骤中所述比值为哈巴俄苷esi离子源内裂解加合形成的准分子-离子761离子簇强度和770离子簇强度之和与哈巴俄苷在esi离子源内加na

离子形成517[m na]

离子簇强度的相对比值；
[0091]
所述哈巴俄苷esi离子源内加na 离子形成517[m na]

离子簇强度为512-541道尔顿范围内所有离子强度之和；
[0092]
所述哈巴俄苷esi离子源内裂解加合形成的准分子-离子761离子簇强度和770离子簇强度之和为753-774道尔顿范围内所有离子强度之和。
[0093]
在本实施例中，在含量测定步骤中所述标准曲线以相对比值为纵坐标、对照品的注入量(ng)为横坐标进行绘制。
[0094]
在具体操作方法中如下操作步骤所示：
[0095]
对照品溶液配制：
[0096]
精密称取对照品适量，加50％甲醇水溶液稀释制成每1ml含哈巴俄苷50、39、30、21、9、6、3μg
·
ml-1的系列浓度溶液，即得。
[0097]
供试品溶液制备：
[0098]
取玄参药材去除表面泥沙，粉碎，过三号筛，精密称定约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时，超声处理(500w，40hz)30分钟，放冷，补足减失重量，摇匀，滤过，续滤液过0.45μm注射式滤器，即得。
[0099]
色谱条件：
[0100]
在25℃下，在beh c18色谱柱(2.1
×
50mm,1.7μm)(waters)上进行色谱分离；以乙腈(a)和0.1％甲酸
·
水溶液(b)为洗脱流动相，进行梯度洗脱：0～1.39min(3％a)，1.39～1.67min(3％～15％a)，1.67～4.86min(15％～35％a)，4.86～6.25min(35％～60％a)，6.25～7.64min(60％～80％a)，7.64～9.03min(80％a)，9.03～9.33min(80％～3％a)，9.33～10.00min(3％a；检测波长：278nm；流速：0.3ml/min；进样量：10μl；ms参数：电喷雾电离源(esi)为正离子模式，full scan扫描范围500-800道尔顿；毛细管电压为1.5kv，探针温度为600℃，采样频率为10hz。
[0101]
测定：
[0102]
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录质谱图，测定离子峰强度。
[0103]
empower 3工作站进行色谱峰数据处理，导出保留时间内所有离子峰数据。
[0104]
合计512-541道尔顿范围内所有离子强度作为哈巴俄苷加na

形成的主离子峰簇的总强度；
[0105]
合计753-774道尔顿范围内所有离子强度作为哈巴俄苷源内裂解加合形成的准分子-离子761离子簇和770离子簇的总强度；
[0106]
计算753-774道尔顿范围内离子总强度和512-541道尔顿范围内离子总强度相对比值；
[0107]
以相对比值为纵坐标，对照品的注入量为横坐标进行绘制绘制标准曲线；根据上述标准曲线，计算得到玄参药材中哈巴俄苷的含量。
[0108]
结果如表1所示：
[0109]
表1
[0110]
[0111][0112]
以上，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。