N-端scFv多特异性结合分子的制作方法

n-端scfv多特异性结合分子
1.1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年11月5日提交的美国临时申请第62/930,916号的优先权，其内容通过整体引用并入本发明。
3.2.序列表
4.本技术案含有以ascii的格式电子提交的序列表并通过整体引用并入本发明。所述ascii副本制作于2020年11月2日，命名为rgn-003wo_sl.txt且大小为62,300字节。
3.

背景技术：

5.大部分天然存在的抗体分子通常包含两条所谓的轻链多肽(轻链)和两条所谓的重链多肽(重链)。各重链多肽和轻链多肽含有包含能与抗原相互作用的结合区的可变结构域(可变区)(通常为多肽链的氨基端部分)。各重链多肽和轻链多肽包含恒定区(通常为羧基端部分)。
6.在过去的20年间，由细胞或细胞系的单克隆产生的重组单克隆抗体，已成为用于治疗各种不同疾病的非常成功的生物药物类别。以抗体为基础的治疗剂已成功地用于治疗包括癌症和自身免疫/炎性病症的各种疾病。
7.由于某些疾病的生物复杂性，以多于一个的抗原或表位为靶标的抗体在治疗特定症状上可能比单一抗体更为有效。参见，例如，lindzen等人.,2010,proc.natl.acad.sci.107(28):12550-12563；nagorsen和baeuerle,2011,exp.cell res.317(9):1255-60。这些抗体为更佳的治疗控制提供了保证。例如，存在提升靶标特异性以降低与多种抗体疗法，特别在基于抗体的免疫疗法的情况相关的脱靶效应的需要。此外，多特异性抗体提供了新颖的治疗策略，例如特别是在免疫疗法的情况下的多个细胞受体的协同靶向。
8.4.发明概述
9.本公开提供了含有至少三个抗原结合位点(“abs”)的多特异性结合分子(“mbm”)，其中两个抗原结合位点为fab而第三个为位于vh结构域n-端的与其中一个fab相连接的scfv。本公开的mbm含有由两个彼此相互结合的重链fc结构域组成的fc区。包含fc结构域的各多肽链以及任何结合的多肽链在本文中称为“半抗体”。
10.本公开的示例性mbm如图1中所示，其变体如图2和图3所示。
11.本公开的典型的mbm包含两个经由其fc结构域结合的半抗体。图1至3左侧所示的半抗体从n-端至c-端的方向包含：
12.·
由通过任选的接头(2)连接的vh(1)和vl(3)(以任一顺序)组成的scfv；
13.·
任选的接头(4)；
14.·
由以下组成的第一fab(“fab1”)：
15.οvh(5)和恒定区(6)，恒定区(6)在图1的实例中为ch1结构域，但如图2a和图2c所示可为例如促进fab异二聚化的cl或ch3的不同类型的恒定区，所述vh(5)和恒定区(6)与以下结合：
16.οvl(10)和恒定区(11)，恒定区(11)在图1的实例中为cl，但如图2a和图3c所示可为例如ch1或ch3的不同类型的恒定区；
17.·
任选的绞链结构域(7)；
18.·
由ch2结构域(8)和ch3结构域(9)组成的fc结构域，ch2结构(8)和ch3结构域(9)如图3所示可含有一个或多个突变(例如星形突变(star mutation)或杵臼(knob-in-hole)突变)以促进异二聚化。
19.左侧半抗体由两条多肽链组成，第一多肽链包含vl(10)和恒定区(11)并与包含如图1至3中所示的其余区域的第二多肽链结合。
20.图1右侧所示的半抗体从n-端至c-端的方向包含：
21.·
由以下组成的第二fab(“fab2”)：
22.οvh(12)和恒定区(13)，恒定区(13)在图1的实例中为ch1结构域，但如图2b和图2d所示可为例如促进fab异二聚化的cl或ch3的不同类型的恒定区，所述vh(12)和恒定区(13)与以下结合：
23.οvl(17)和恒定区(18)，恒定区(18)在图1的实例中为cl，但如图2b和图2d所示可为例如ch1或ch3的不同类型的恒定区；
24.·
任选的绞链区(14)；
25.·
由ch2结构域(15)和ch3结构域(16)组成的fc结构域，ch2结构域(15)和ch3结构域(16)如图3中所示可含有一个或多个突变(例如星形突变或杵臼突变)以促进异二聚体的纯化和/或组装。
26.右侧半抗体由两条多肽链组成，第一多肽链包含vl(17)和恒定区(18)并与包含如图1至3所示的其余区域的第二多肽链结合。
27.完整的mbm通过经由形成fc区的两个fc结构域而导致的两个半抗体的结合而形成，从而生成含有具有第一抗原结合位点(“abs1”)的scfv、具有第二抗原结合位点(“abs2”)的fab1和具有第三抗原结合位点(“abs3”)的fab3的mbm。
28.图1至3中所示的本公开mbm的变体并非意在限制；本公开的mbm可包括图1至3和下文6.2节中所阐述的修饰的任何组合。再者，提及第一或第二多肽链或左侧或右侧半抗体仅为方便起见并非意在表示多肽链或半抗体以任何特定顺序产生或组装。
29.本公开的mbm的abs1、abs2和abs3各自与例如细胞表面表达的抗原的靶分子结合。优选地，mbm的scfv、fab1和fab2经选择以使得abs1、abs2和abs3能同时各自结合其靶标。在一些实施方案中，mbm的abs1、abs2和abs3可以各自结合不同的靶分子，或可替代地，abs1、abs2和abs3中的两个可以与相同靶分子的不同区域结合。
30.有利地，可以使用结合至少两个或更多个不同靶分子的mbm，例如，以优先靶向表达这两个或更多个靶分子的特定组织类型。
31.可用于本公开的mbm的scfv描述于下文6.2.1节及具体实施方案1至12、19至20、31至35和55至60中。可用于本公开的mbm的fab描述于下文6.2.2节及具体实施方案1至12、19至20、22至23、28至30和36至54中。scfv可例如通过肽接头与fab1相连接。可用于连接scfv与fab1的接头描述于下文6.2.3节和具体实施方案13至18中。可用于本公开的mbm的fc结构域描述于下文6.2.4节和具体实施方案24至26中。
32.本公开进一步提供了包括本公开的mbm的药物缀合物(为了方便起见，在本文中称
为“抗体药物缀合物”或“adc”)。adc的示例性特征描述于下文6.3节和具体实施方案61中。
33.本公开进一步提供了编码本公开的mbm的核酸。编码mbm的核酸可为单个核酸(例如编码mbm的所有多肽链的载体)或多个核酸(例如，编码mbm的不同多肽链的两个或更多个载体)。本公开进一步提供了经工程化以表达本公开的核酸和mbm的宿主细胞和细胞系。本公开进一步提供了产生本公开的mbm的方法。示例的核酸、宿主细胞、细胞系和产生mbm的方法描述于下文6.5节和具体实施方案78至83中。
34.本公开进一步提供了包括本公开的mbm和adc的药物组合物。示例的药物组合物描述于下文6.6节和具体实施方案62中。
35.本文进一步提供了使用本公开的mbm、adc和药物组合物例如用于治疗癌症的方法。示例的方法描述于下文6.7节和具体实施方案63至77中。
5.附图说明
36.图1：本公开的示例性mbm的示意图。
37.图2a至2e：本公开的示例性mbm的示意图，其中fab含有促进适当vh和vl配对的修饰。另外的策略陈述于下文6.2.2节中。
38.图3a至3d：本公开的示例性mbm的示意图，其中fc结构域含有促进适当配对的异二聚体的异二聚化或纯化的修饰。图3a和图3b将具有星形突变的ch3(具有h435r y436f修饰的ch3)描述为ch3(*)及图3c和图3d描述了分别以(k)和(h)表示的杵(knob)和臼(hole)突变。在图示的其它地方，星形突变以星号(*)描绘而杵臼突变以三角形描绘(例如，或)。这两种策略(例如星形突变和杵臼突变)可组合于单一mbm中。另外的异二聚化策略陈述于下文6.2.4节中。
39.图4a1至4b2：与本公开的mbm特异性结合的示例性靶分子对的表达图谱：klb和fgfr1c，根据基因型组织表达(gtex)计划(图4a1至图4a2)和人类蛋白图谱(图4b1至图4b2)。其中存在重叠表达的组织以粗体字表示。
40.图5：由fgf21信号传导调节的代谢途径。
41.图6a至6c：facs结合测定结果(实施例1)。图6a：hek293/cas90hfgfr1/hklb细胞；fig.6b：hek293/hfgfr1c细胞；图6c：hek293/hfgfr1c/hklb细胞。mfi：平均荧光强度；apc：别藻蓝蛋白。
42.图7：说明了相较于fgfr21，双特异性结合分子(bbm)regn4366，fgfr1c x klb双特异性对照和对比物fgfr1c x klb双特异性regn4304在hek293/sre-luc/hfgfr1c/hklb细胞中引起的适度活化的图。
43.图8：相较于二价regn4366，三价f1k-scfv6在hek293.sreluc.hfgfr1chs/hklb细胞中引起的增强的报告基因活化(rlu：相对光单位)(实施例1)。
44.图9：显示了评估命名为scfv6的分子的6种接头长度变体(在(1)位置含有命名为22393或393的klb结合剂，在(2)位置含有命名为adi-19842或842的fgfr1结合剂，在(3)位置含有命名为22532或532的klb结合剂，其不会阻断klb结合剂22393以scfv形式的结合)的研究结果的图。比较了在fgfr1结合结构域和n-端532scfv结构域之间含有7至45个氨基酸的接头的分子。所有接头长度的三特异性结合分子展现出高于对比物双特异性结合分子regn4304的活性。
45.图10a至10b：展现了命名为f1k_scfv6和scfv6 lk7(含有7个氨基酸的接头)的三特异性结合剂在稳定表达hfgfr1c和hklb的hek293细胞中强烈激活fgfr1c信号传导的图。图10a：说明在血清饥饿16小时后跟以浓度1nm和10nm的药物处理15分钟后，通过erk和plcγ磷酸化观察到的药物浓度依赖性fgfr1c信号传导的蛋白质印迹。图10b：说明在血清饥饿16小时后跟以浓度10nm的药物处理15、30分钟以及1、2、4和6小时培养时间后，通过erk和plcγ磷酸化观察到的时间依赖性fgfr1c信号传导的蛋白质印迹。
46.图11a至11c：相较于三特异性mab(f1k.scfv6 igg1和f1k-fab6 igg1)，单特异性结合分子(抗-klb；regn4661)和双特异性结合分子(抗-klbxfgfr1c；regn4304)以不同的化学计量数结合klb(串联实心圆)/fgfr1c(空心矩形)。图11a：通过不对称流场流分级结合多角度光散射(a4f-mals)分析regn4661:klb复合物(实线)。还叠加了来自regn4661(虚线)和klb(点虚线)的个体样品的分形图。显示了各样品随保留时间变化的在215nm的相对uv吸收度并指出了分辨峰的实测摩尔质量。图11b：通过不对称流场流分级结合多角度光散射(a4f-mals)分析regn4304:klb复合物(粗实线)和regn4304:klb:fgfr1c复合物(细实线)。还叠加了来自regn4304(虚线)、klb(点虚线)和fgfr1c(灰色点虚线)的个体样品的分形图。显示了各样品随保留时间变化的在215nm的相对uv吸收度并指出了分辨峰的实测摩尔质量。图11c：通过不对称流场流分级结合多角度光散射(a4f-mals)分析f1k-scfv6 igg1:klb复合物(粗实线)和f1k-scfv6 igg1:klb:fgfr1c复合物(0.2μm:0.2μm:0.2μm，细实线)。显示了各样品随保留时间变化的在215nm的相对uv吸收度并指出了分辨峰的实测摩尔质量。
47.图12a至12b：fgfr1c、klb和fgf21簇如何形成活性复合物(图12a)以及相较于双特异性分子和单特异性对照，在fgfr1c和klb受体与例如f1k-scfv6的2 1 n-scfv三特异性结合分子之间形成的潜在化学计量复合物(图12b)的示意图。
48.图13a至13b：表达fgfr3 s249c突变(图13a)或fgfr3-tacc3融合突变(图13b)的umuc14细胞的增殖测定。
49.图14在umuc14细胞中fgfr3受体降解测定的结果。
50.6.发明详述
51.6.1.定义
52.如本文所用，下列术语旨在具有下列意义：
53.抗原结合位点或abs：术语“抗原结合位点”或“abs”如本文所用，指能特异性、非共价和可逆性结合靶分子的mbm部分。本公开的mbm包含为scfv的部分的第一abs“(abs1”)，为fab的部分的第二abs“(abs2”)和为fab的部分的第三abs(“abs3”)。
54.结合：术语“结合”在mbm的上下文中指在两条或更多条多肽链之间的功能关系。特别地，术语“结合”指两条或更多条多肽例如通过分子间相互作用非共价地或通过一个或多个二硫桥或化学交联共价地彼此结合，以产生abs1、abs2和abs3可以结合各自靶标的功能性mbm。可存在本公开mbm中的结合的实例包括(但不限于)在fc区中同二聚体或异二聚体fc结构域之间的结合，fab或scfv中vh和vl区之间的结合，fab中ch1和cl之间的结合，结构域取代的fab中ch3和ch3之间的结合。
55.互补决定区或cdr：术语“互补决定区”或“cdr”如本文所用，指在抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。一般而言，在每个重链可变区中存在三个cdr
(cdr-h1、cdr-h2、hcdr-h3)以及在每个轻链可变区中存在三个cdr(cdr1-l1、cdr-l2、cdr-l3)。可用于鉴别cdr边界的示例性界定方式包括例如kabat定义、chothia定义、abs定义和imgt定义。参见，例如kabat,1991,“sequences of proteins of immunological interest,”national institutes of health,bethesda,md.(kabat编号方案)；al-lazikani等人,1997,j.mol.biol.273：927-948(chothia编号方案)；martin等人,1989,proc.natl.acad.sci.usa 86：9268-9272(abs编号方案)；和lefranc等人,2003,dev.comp.immunol.27：55-77(imgt编号方案)。公开数据库也用于鉴别抗体内的cdr序列。
56.衍生自：如本文所用，术语“衍生自”表明第一和第二分子间的关系。通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性但并非意味着或包括对衍生自第二分子的第一分子的方法或来源的限制。
57.ec50：术语“ec50”指在特定的暴露时间后引发介于基线和最大值之间一半反应的抗体或mbm的半数最大效应浓度。ec50基本上代表观察到其最大效应的50％时抗体或mbm的浓度。在某些实施方案中，ec50值，例如通过facs结合测定所确定的，等同于给出与表达靶分子的细胞半数最大结合的抗体或mbm浓度，该靶分子可由抗体或mbm特异性结合。因此，随着ec50或半数最大有效浓度值增加，观察到降低或更弱的结合。在一些实施方案中，本公开mbm的ec50值可由约10-5
m或更低(例如低于10-5
m、低于10-6
m、低于10-7
m、低于10-8
m、或低于10-9
m)的ec50值表征。
58.表位：表位或抗原决定簇为如本文所述的抗体或其他抗原结合部分识别的抗原(例如，靶分子)的一部分。表位可为线性的或构象的。
59.fab：术语“fab”在本公开mbm的上下文指一对多肽链，第一多肽链包含抗体n-端的可变重链(vh)结构域至第一恒定结构域(在本文中称为c1)，并且第二多肽链包含抗体n-端的可变轻链(vl)结构域至能和第一恒定区配对的第二恒定区(在本文中称为c2)。在天然抗体中，vh在重链的第一恒定区(ch1)的n-端，并且vl在轻链的恒定区(cl)的n-端。本公开的fab可根据天然方向排列或包括促进正确的vh和vl配对的结构域取代或交换，尤其是当本公开的mbm包含不相同的fab时。例如，可以用ch3结构域对替换fab中的ch1和cl结构域对，以促进异二聚体mbm中正确的修饰fab-链配对。也可以颠倒ch1和cl使得ch1与vl连接而cl与vh连接，即通常称为crossmab的构型。或者或除了使用取代或交换的恒定结构域之外，可以通过使用可与本公开的异二聚体mbm的两个可变区配对的通用轻链来实现正确的链配对。
60.fc结构域和fc区：术语“fc结构域”指与另一重链的对应部分配对的重链的部分。术语“fc区”指通过两个重链fc结构域结合形成的基于抗体的结合分子的区域。fc区内的两个fc结构域彼此可以是相同的或不同的。在天然的抗体中，fc结构域典型地为相同的，但就产生本公开的mbm的目的而言，一个或两个fc结构域可以有利地经修饰以允许异二聚化。
61.半抗体：术语“半抗体”指包含至少一个abs或一条abs链(例如，fab的一条链)并可与包含abs或abs链的另一分子通过例如二硫桥或分子相互作用(例如，fc异二聚体间的相互作用)相结合的分子。半抗体可由一条多肽链或一条以上的多肽链组成(例如，fab的两条多肽链)。在优选实施方案中，半抗体包含fc结构域。
62.宿主细胞：术语“宿主细胞”如本文所用，指本公开的核酸已导入其中的细胞。术语“宿主细胞”和“重组的宿主细胞”在本文可交换使用。应当理解，此术语是指特定的对象细
胞和此细胞的子代或潜在的子代。因为在传代中由于突变或环境影响可能发生的某些修饰，此子代事实上可以与亲代细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内。典型的宿主细胞为真核宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞。示例真核宿主细胞包括酵母菌和哺乳动物细胞，例如，如小鼠、大鼠、猴子或人细胞系的脊椎动物细胞，例如，hkb11细胞、per.c6细胞、hek细胞或cho细胞。
63.多特异性结合分子或mbm：术语“多特异性结合分子”或“mbm”如本文所用，指包括两个半抗体的分子(例如，多条多肽链的组合)，且其与至少两个不同的表位(及在某些情况下为三个或更多个表位)特异性结合并包含abs1和abs2和abs3。
64.可操作地连接：术语“可操作地连接”如本文所用，指多肽链的两个或更多个区域之间的功能关系，其中两个或更多个区域连接以产生功能性多肽。
65.亲代抗体：术语“亲代抗体”指由其衍生出本发明的mbm的抗体(如本文所定义的术语)，例如，缺乏存在于本公开的mbm中的n-端scfv结构域的亲代单特异性或双特异性抗体。本公开的mbm，例如在其一个或多个abs中，可与“亲代抗体”共享例如cdr、vh和/或vl序列的结合序列，但不必须通过修饰亲代抗体或其编码序列来制备。
66.单链fv或scfv：术语“单链fv”或“scfv”如本文所用，指包含抗体的vh和vl结构域的多肽链，其中这些结构域存在于单一多肽链中。
67.特异性(或选择性)结合：术语“特异性(或选择性)结合”如本文所用，指mbm或其抗原结合位点(“abs”)与靶分子形成在生理状况下较为稳定的复合物。特异性结合可以通过约5x10-2
m或更低(例如，低于5x10-2
m、低于10-2
m、低于5x10-3
m、低于10-3
m、低于5x10-4
m、低于10-4
m、低于5x10-5
m、低于10-5
m、低于5x10-6
m、低于10-6
m、低于5x10-7
m、低于10-7
m、低于5x10-8
m、低于10-8
m、低于5x10-9
m、低于10-9
m、或低于10-10
m)的kd表征。测定抗体或抗体片段例如mbm或abs与靶分子的结合亲和力的方法已为本领域所熟知并包括，例如平衡透析、表面等离子共振(例如biacore测定)、荧光激活细胞分选(facs)结合测定等。然而，与来自一物种的靶分子特异性结合的mbm或其abs对于来自一种或多种其他物种的靶分子可以具有交叉反应性。
68.靶分子：术语“靶分子”如本文所用，指可由mbm的抗原结合位点特异性结合的在细胞表面表达的任何生物分子(例如，蛋白质、醣类、脂质或其组合物)。
69.组织：术语“组织”如本文所用，指特定种类细胞的集合或聚合。组织可衍生自中胚层(例如，骨骼、肌肉、结缔组织、肾和相关结构)，内胚层(例如，肺、其他呼吸结构和消化器官)或外胚层(例如，神经系统、感觉器官、皮肤和相关结构)。可用于由本公开的mbm靶向的组织的实例包括但不限于，结缔组织(包括纤维结缔组织、骨骼结缔组织和体液结缔组织、血液、骨、肌腱、韧带、脂肪和蜂窝组织等)，肌肉组织(包括内脏肌或平滑肌、骨骼肌和心肌等)，周围神经组织(脑神经、脊神经、运动神经元等)，上皮组织(包括皮肤、气管、生殖道、消化道、单层鳞状上皮、复层鳞状上皮、单层立方上皮、移形上皮、伪复层柱状上皮、柱状上皮、腺体上皮、纤毛柱状上皮等)，内皮组织(血管、淋巴管等)，以及任何细胞或其任何组份(例如，细胞外基质)。本公开的mbm靶向的组织可为(a)固体组织或液体组织(例如，血液或单独的血细胞类型)；(b)正常组织或疾病组织(例如癌细胞)；和/或(c)存在于相同器官(例如，肾脏或肝脏)或其他身体结构(例如，肿瘤)或存在于不同器官或其他身体结构。
70.组织表达图谱：术语“组织表达图谱“如本文所用，就靶分子而言是指在人体中靶
分子的表达模式，例如，如通过人类蛋白图谱(hpa)和/或基因型-组织表达(gtex)计划所确定的。组织表达图谱可为蛋白质表达图谱和/或mrna表达图谱。
71.三价：术语“三价”如本文所用，指具有三个抗原结合位点的mbm。在一些实施方案中，其中两个抗原结合位点与相同靶标的相同表位结合。在其他实施方案中，其中两个抗原结合位与相同靶分子的不同表位特异性结合。
72.通用轻链：术语“通用轻链”如本文所用，在mbm的上下文中指能与fab1的重链区配对以形成fab1并能与fab2的重链区配对以形成fab2的轻链多肽。通用轻链也称为“普通轻链”。
73.vh：术语“vh”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括scfv或fab的重链。
74.vl：术语“vl”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括scfv或fab的轻链。
75.6.2.多特异性结合分子(mbm)
76.本公开的mbm包含两个半抗体，其中一个包含至少一个抗原结合位点(例如，fab)且另一个包含至少两个抗原结合位点(例如具有与其vh的n端可操作地连接的scfv的fab)。
77.本公开的mbm与至少两个不同表位特异性结合(在某些情况为三个或更多个不同的表位)。至少两个不同表位可在相同的靶分子上或在不同的靶分子上。一般而言，本公开的mbm与两个或更多个不同的靶分子(有时在本文中称为“抗原”)特异性结合。
78.6.2.1.scfv
79.单链fv或“scfv”抗体片段包含在单一多肽链中的抗体的vh和vl结构域，能作为单链多肽表达且保留其衍生自的完整抗体的特异性。一般而言，scfv多肽进一步包含vh和vl结构域之间的多肽接头，使得scfv形成用于靶标结合的期望结构。适合连接scfv的vh和vl链的接头的实例为6.2.3节中所确认的接头。
80.除非另有规定，否则如本文所用，scfv可具有任何顺序的vl和vh可变区，例如就多肽的n-端和c-端而言，scfv可包含vl-接头-vh或可包含vh-接头-vl。
81.scfv可包含来自任何适合物种的vh和vl序列，例如鼠、人或人源化vh和vl序列。
82.为产生编码scfv的核酸，将编码vh和vl的dna片段可操作地连接至编码接头的另一片段，例如编码6.2.3节中所述的任何接头(典型地含有氨基酸甘氨酸和丝氨酸的重复序列，例如氨基酸序列(gly4～ser)3(seq id no：4)，使得vh和vl序列可以作为连续的单链蛋白表达，其中vl和vh区通过接头连接(参见，例如bird等人,1988,science 242：423-426；huston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；mccafferty等人,1990,nature 348：552-554)。
83.6.2.2.fab1和fab2
84.本公开的mbm在各半抗体中包含至少一个fab结构域。fab结构域传统上通过使用例如木瓜蛋白酶的酶来溶蛋白性裂解免疫球蛋白分子而产生。在本公开的mbm中，fab结构域重组表达为较大分子的部分。
85.fab结构域可包含来自任何适合物种的恒定区和可变区序列，且因此可以是鼠源的、嵌合的、人源的或人源化的。
86.fab结构域典型地包含与vh结构域连接的ch1结构域，该ch1结构域与连接至vl结构域的cl结构域配对。在野生型的免疫球蛋白中，vh结构域与vl结构域配对以构建fv区，而ch1结构域与cl结构域配对以进一步稳定该结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可进
一步稳定该fab结构域。
87.对于本公开的mbm，尤其是当轻链并非普通或通用轻链时，使用fab异二聚化策略以允许属于相同abs的fab结构域正确结合并使属于不同abs的fab结构域的异常配对最小化是有利的。例如，可使用下表1中所示的fab异二聚化策略：
[0088][0089][0090]
因此，在某些实施方案中，可通过相互交换fab的vl和vh结构域或相互交换ch1和cl结构域来促进fab的两条多肽间的正确结合，例如，如wo 2009/080251中所述。
[0091]
也可以通过在fab的ch1结构域中引入一个或多个氨基酸修饰或在fab的cl结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和/或在vh结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和在vl结构域中引入一个或多个氨基酸修饰来促进正确的fab配对。经修饰的氨基酸典型地为vh:vl和ch1:cl界面的部分，使得fab组分优选地彼此配对，而不是与其他fab的组分配对。
[0092]
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰限于如残基的kabat编号所示的可变
结构域(vh、vl)和恒定结构域(ch1、cl)的保守性框架残基。almagro,2008,frontiers in bioscience 13：1619-1633提供了以kaba、chothia和imgt编号方案为基础的框架残基的定义。
[0093]
在一个实施方案中，引入vh和ch1结构域和/或vl和cl结构域中的修饰彼此互补。在重链和轻链界面的互补性可以基于空间和疏水接触、静电/电荷相互作用或多种相互作用的组合来实现。蛋白界面间的互补性在文献中广泛地描述为锁钥配合、杵臼结构、突出和空腔、供体和受体等，所有这些都暗示了两个相互作用的表面间的结构和化学匹配的本质。
[0094]
在一个实施方案中，一个或多个引入的修饰引入了跨越fab组分的界面的新氢键。在一个实施方案中，一个或多个引入的修饰引入了跨越fab组分的界面的新盐桥。示例性取代描述于wo 2014/150973和wo 2014/082179中，其内容通过引用并入本发明。
[0095]
在一些实施方案中，fab结构域包含ch1结构域中的192e取代和cl结构域中的114a和137k取代，其在ch1结构域和cl结构域之间引入盐桥(参见，例如golay等人,2016,j immunol 196：3199-211)。
[0096]
在一些实施方案中，fab结构域包含ch1结构域中的143q和188v取代和cl结构域中的113t和176v取代，其用于交换ch1结构域和cl结构域之间接触的疏水和极性区(参见，例如golay等人,2016,j immunol 196：3199-211)。
[0097]
在一些实施方案中，fab结构域可在vh、ch1、vl、cl结构域中的一些或全部中包括修饰以引入正交fab界面，以促进fab结构域的正确组装(lewis等人,2014 nature biotechnology 32：191-198)。在一个实施方案中，在vh结构域中引入39k、62e修饰，在ch1结构域中引入h172a、f174g修饰，在vl结构域中引入1r、38d、(36f)修饰，以及在cl结构域中引入l135y、s176w修饰。在另一个实施方案中，在vh结构域中引入39y修饰以及在vl结构域中引入38r修饰。
[0098]
fab结构域也可以以工程化的二硫键置换原本的ch1:cl二硫键来修饰，从而增加fab组分配对的效率。例如，工程化的二硫键可通过在ch1结构域中引入126c以及在cl结构域中引入121c来引入(参见，例如mazor等人,2015,mabs 7：377-89)。
[0099]
fab结构域也可以通过用促进正确组装的替代结构域置换ch1结构域和cl结构域来修饰。例如，wu等人,2015,mabs 7：364-76，描述了用t细胞受体的恒定结构域替换ch1结构域以及用t细胞受体的b结构域替换cl结构域，并通过在vl结构域中引入38d修饰和在vh结构域中引入39k修饰，使vl结构域和vh结构域之间另外的电荷-电荷相互作用与这些区域替换配对。
[0100]
或者或除了使用fab异二聚化策略以促进正确的vh
–
vl配对之外，普通轻链(也称为通用氢链)的vl可用于本发明mbm的各fab vl区。在各种实施方案中，相较于应用原本的同源vl，应用如本文所述的普通氢链降低了mbm的不适当种类的数目。在各种实施方案中，mbm的vl结构域鉴定自包含普通氢链的单特异性抗体。在各种实施方案中，mbm的vh区包含在预先工程化以表达限制的人轻链组库或与人重链同源的单一人轻链的小鼠b细胞内重排的人重链可变基因片段，响应于目标抗原暴露，产生含有多个与可能的人vl的一个或两个中的一个同源的人vh的抗体组库，其中该抗体组库对目标抗原具有特异性。普通轻链为衍生自重排的人vκ1-39jκ5序列或重排的人vκ3-20jκ1序列的那些，并包括体细胞突变的(例如亲和力成熟的)版本。参见，例如，美国专利第10,412,940号。
[0101]
6.2.3.接头
[0102]
在某些方面，本公开提供了mbm，其中abs的两个或更多个组分(例如，scfv的vh和vl)，两个或更多个abs(例如，半抗体的scfv和fab)，或abs和非-abs组分(例如，fc区)通过肽接头彼此相连。与用于连接药物与例如6.4节中所述的mbm的adc接头相对，此类接头在本文中称为“abs接头”。
[0103]
肽接头长度范围可从2个氨基酸至60个或更多个氨基酸，且在某些方面，肽接头长度范围从3个氨基酸至50个氨基酸，从4个至30个氨基酸，从5个至25个氨基酸，从10个至25个氨基酸，10个氨基酸至60个氨基酸，从12个氨基酸至20个氨基酸，从20个氨基酸至50个氨基酸，或从25个氨基酸至35个氨基酸。
[0104]
在特定方面，肽接头(例如隔开scfv结构域和重链，如abs1的scfv结构域和abs2的重链可变区的肽接头)的长度为至少5个氨基酸，至少6个氨基酸或至少7个氨基酸及可选地长度最高达30个氨基酸，最高达40个氨基酸，最高达50个氨基酸或最高达60个氨基酸。
[0105]
在前述的一些实施方案中，接头长度范围从5个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围从5至50个，从5至45个，从5至40个，从5至35个，从5至30个，从5至25个，或从5至20个氨基酸。在前述的其他实施方案中，接头长度范围从6个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围从6至50个，从6至45个，从6至40个，从6至35个，从6至30个，从6至25个，或从6至20个氨基酸。又在前述的其他实施方案中，接头长度范围从7个氨基酸至50个氨基酸，例如长度范围从7至50个，从7至45个，从7至40个，从7至35个，从7至30个，从7至25个，或从7至20个氨基酸。
[0106]
带电荷(例如，带电荷亲水性接头)和/或柔性接头为特别优选的。
[0107]
可用于本公开mbm的柔性abs接头的实例包括由chen等人,2013,adv drug deliv rev.65(10)：1357-1369和klein等人,2014,protein engineering,design&selection 27(10)：325-330公开的那些。特别有用的柔性接头为或包含重复的甘氨酸和丝氨酸，例如gns(seq id no：2)或sgn(seq id no：3)的单体或多聚体，其中n为1至10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，接头为或包含重复的g4s(seq id no：4)例如(ggggs)n的单体或多聚体。
[0108]
聚甘氨酸接头可适用于本公开的mbm。在一些实施方案中，肽接头(例如隔开scfv结构域和重链，如abs1的scfv结构域和abs2的重链可变区的肽接头)包含两个连续的甘氨酸(2gly)，三个连续的甘氨酸(3gly)，四个连续的甘氨酸(4gly(seq id no：5))，五个连续的甘氨酸(5gly(seq id no：6))，六个连续的甘氨酸(6gly(seq id no：7))，七个连续的甘氨酸(7gly(seq id no：8))，八个连续的甘氨酸(8gly(seq id no：9))或九个连续的甘氨酸(9gly(seq id no：10))。
[0109]
在特定实施方案中，abs接头(例如隔开scfv结构域和重链，如abs1的scfv结构域和abs2的重链可变区的肽接头)由g4s(seq id no：4)或其多聚体和一个或多个另外的甘氨酸例如2gly、3gly或4gly(seq id no：5)组成。此类接头的实例包括g4s gg(seq id no：63)、4xg4s gg(seq id no：64)和7xg4s gg(seq id no：65)。
[0110]
6.2.4.绞链区
[0111]
本公开的mbm也可包含例如连接abs模块和fc区的绞链区。绞链区可为天然的或修饰的绞链区。绞链区典型地存在于fc区的n-端。
[0112]
天然的绞链区为一般可在天然存在的抗体中的fab和fc结构域之间发现的绞链
区。修饰的绞链区为长度和/或组成与天然绞链区不相同的任何绞链。此类绞链可包括来自其他物种的绞链区，例如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、大羊驼或山羊绞链区。其他修饰的绞链区可包含衍生自不同类型或亚型抗体的重链fc区的完整绞链区。或者，修饰的绞链区可包含天然绞链的部分或其中重复的单元衍生自天然绞链区的重复单元。在其他的选择中，天然绞链区可通过将一个或多个半胱氨酸或其他残基转换为例如丝氨酸或丙氨酸的中性残基来改变，或通过将适当位置的残基转换为半胱氨酸残基来改变。通过这种方法，绞链区中的半胱氨酸残基数目可增加或减少。其他修饰的绞链区可以是完全合成的或经设计具有例如长度、半胱氨酸组成和柔性的期望特性的。
[0113]
许多修饰的绞链区已描述于，例如美国专利第5,677,425号、wo 99/15549、wo 2005/003170、wo 2005/003169、wo 2005/003170、wo 98/25971和wo 2005/003171中且这些专利通过引用并入本发明。
[0114]
在一个实施方案中，一个或两个本公开的半抗体的fc区在其n-端具有完整的绞链区，例如绞链结构域。在一些实施方案中，“绞链结构域”指人igg1的约glu216或约cys226至约pro230的序列(burton,1985 molec.immunol.22：161-206)，或其他抗体类型或同种型中的对应序列。
[0115]
在各种实施方案中，绞链结构域内的位置233-236可为g、g、g和空位；g、g、空位和空位；g、空位、空位和空位；或全部为空位，其中位置号码以eu编号。
[0116]
在一些实施方案中，本公开的mbm包含修饰的绞链结构域，其相对于相同同种型(例如，人igg1或人igg4)的野生型绞链结构域降低了对fcγ受体的结合亲和力。
[0117]
在一个实施方案中，本公开mbm的一条或两条链的fc区在其n-端具有完整的绞链结构域。
[0118]
在一个实施方案中本公开mbm的fc区和绞链区衍生自lgg4且该绞链区包含修饰的序列cppc(seq id no：11)。相较于含有序列cppc(seq id no：11)的lgg1，人lgg4的核心绞链区含有序列cpsc(seq id no：12)。存在于lgg4序列中的丝氨酸残基导致该区的柔性增加，且因此一定比例的分子在相同蛋白链内形成二硫键(链内二硫键)，而不是与igg分子中的另一重链桥连以形成链间二硫键(angel等人.,1993,mol immunol 30(1)：105-108)。将丝氨酸残基换成脯氨酸得到与lgg1相同的核心序列，得以在lgg4绞链区中形成链间二硫键，因此降低纯化产物的异质性。这种经改变的同种型称为lgg4p。
[0119]
6.2.4.1.嵌合绞链序列
[0120]
绞链区可为嵌合绞链区。
[0121]
例如，嵌合绞链可包含衍生自人igg1、人igg2或人igg4绞链区的“上绞链”序列，其与衍生自人igg1、人igg2或人igg4绞链区的“下绞链”序列组合。
[0122]
在特定的实施方案中，嵌合绞链区包含氨基酸序列epkscdkthtcppcpappva(seq id no：13)(在先公开为wo2014/121087的seq id no：8，其通过整体引用并入本发明)或eskygppcppcpappva(seq id no：14)(在先公开为wo2014/121087的seq id no：9)。此类嵌合绞链序列可适当与igg4 ch2区连接(例如，通过引入igg4 fc结构域例如人或鼠fc结构域，其可进一步在ch2和/或ch3结构域中被修饰以降低效应子功能，例如，如6.2.5.1节中所述)。
[0123]
6.2.4.2.具有降低的效应子功能的绞链序列
[0124]
在进一步的实施方案中，绞链区可经修饰以降低效应子功能，例如，如
wo2016161010a2中所述(其通过整体引用并入本发明)。在各种实施方案中，此修饰绞链区的位置233-236为g、g、g和空位；g、g、空位和空位；g、空位、空位和空位；或全部为空位，其中位置号码以eu编号(如wo2016161010a2的图1中所示)。这些片段可以ggg-、gg
‑‑
、g
‑‑‑
或
‑‑‑‑
表示，其中
“‑”
代表空位。
[0125]
位置236在典型人igg2中为空位，但在其他典型的人igg同种型中则为占用的。在全部四种人同种型中，位置233至235由g以外的残基占据(如wo2016161010a2的图1中所示)。
[0126]
位置233至236内的绞链修饰可与位置228被p占据相组合。位置228在人igg1和igg2中由p天然占据，但在人igg4中由s占据及在人igg3中由r占据。igg4抗体中的s228p突变对稳定igg4抗体和降低外源和内源抗体间的重链轻链对的交换是有利的。优选地位置226至229分别由c、p、p和c占据。
[0127]
示例性绞链区具有残基226至236，有时候称为中(或核心)和下绞链，由命名为ggg-(233-236)、gg
‑‑
(233-236)、g
‑‑‑
(233-236)和无g(233-236)的修饰绞链序列所占据。可选地，绞链结构域氨基酸序列包含cppcpapggg-gpsvf(seq id no：15)(在先公开为wo2016161010a2的seq id no：1)，cppcpapgg
‑‑
gpsvf(seq id no：16)(在先公开为wo2016161010a2的seq id no：2)，cppcpapg
‑‑‑
gpsvf(seq id no：17)(在先公开为wo2016161010a2的seq id no：3)，或cppcpap
‑‑‑‑
gpsvf(seq id no：18)(在先公开为wo2016161010a2的seq id no：4)。
[0128]
上述的修饰绞链区可引入重链恒定区，该重链恒定区典型地包括ch2和ch3结构域，且可具有位于指定区两侧的其他绞链片段(例如，上绞链)。虽然此类存在的其他恒定区片段可为不同的同种型的杂交体，但典型地为相同的同种型，优选地人同种型。此类其他的人恒定区的同种型，优选地为人igg4，也可以为人igg1、igg2或igg3或其结构域来自不同的同种型的杂交体。人igg1、igg2和igg4的示例性序列如wo2016161010a2的图2-4中所示。
[0129]
在具体的实施方案中，修饰的绞链序列可与igg4 ch2区连接(例如通过引入igg4 fc结构域例如人或鼠fc结构域，其可进一步在ch2和/或ch3结构域中被修饰以降低效应子功能，例如，如6.2.5.1节中所述)。
[0130]
6.2.5.fc结构域
[0131]
本公开的mbm可包括衍生自任何适合物种的fc区。在一个实施方案中，fc区衍生自人fc结构域。
[0132]
fc结构域可衍生自任何适合种类的抗体，包括iga(包括lga1和lga2亚型)、igd、ige、igg(包括lgg1、lgg2、lgg3和lgg4亚型)和igm。在一个实施方案中，fc结构域衍生自lgg1、lgg2、lgg3或lgg4。在一个实施方案中，fc结构域衍生自lgg1。在一个实施方案中，fc结构域衍生自lgg4。
[0133]
fc区内的两个fc结构域彼此可为相同或不同的。在天然抗体中，fc结构域典型地为相同的，但就产生例如本公开mbm的多特异性结合分子的目的而言，fc结构域有利地可以不同以允许异二聚化，如下6.2.5.2节中所述。
[0134]
在天然抗体中，iga、igd和igg的重链fc结构域由两个重链恒定结构域(ch2和ch3)组成，而ige和igm的重链fc结构域由三个重链恒定结构域(ch2、ch3和ch4)组成。这些结构域经二聚化而产生fc区。
[0135]
在本公开的mbm中，fc区和/或其内的fc结构域，可包含来自一种或多种不同类型，
例如一种、两种或三种不同类型的抗体的重链恒定结构域。
[0136]
在一个实施方案中，fc区包含衍生自lgg1的ch2和ch3结构域。
[0137]
在一个实施方案中，fc区包含衍生自lgg2的ch2和ch3结构域。
[0138]
在一个实施方案中，fc区包含衍生自lgg3的ch2和ch3结构域。
[0139]
在一个实施方案中，fc区包含衍生自lgg4的ch2和ch3结构域。
[0140]
在一个实施方案中，fc区包含来自igm的ch4结构域。igm ch4结构域典型地位于ch3结构域的c-端。
[0141]
在一个实施方案中，fc区包含衍生自igg的ch2和ch3结构域和衍生自igm的ch4结构域。
[0142]
应当理解，用于产生本公开mbm的fc区的重链恒定结构域可包括如上所述的天然存在的恒定结构域的变体。相较于野生型的恒定结构域，此类变体可包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中，本公开的fc区包括至少一个在序列上不同于野生型恒定结构域的恒定结构域。应当理解，变体恒定结构域可比野生型恒定结构域更长或更短。优选地变体恒定结构域与野生型恒定结构域为至少60％相同或类似。在另一个实例中，变体恒定结构域为至少70％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域为至少80％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域为至少90％相同或相似。在另一个实例中，变体恒定结构域为至少95％相同或相似。
[0143]
igm和iga在人类中作为普通h2l2抗体单元的共价多聚体天然产生。当其引入j-链时，igm生成为五聚物，或当其缺乏j-链时，则为六聚物。iga以单体或二聚体形式生成。igm和iga的重链具有延伸至c-端恒定结构域的18个氨基酸，称为尾板(tailpiece)。尾板包括在多聚体的重链间形成二硫键的半胱氨酸残基，且据信在多聚化中扮演着重要角色。尾板也含有糖基化位点。在某些实施方案中，本公开的mbm不包含尾板。
[0144]
引入本公开的mbm的fc结构域可包含一个或多个改变蛋白功能性质的修饰，例如与fc-受体例如fcrn或白细胞受体结合、与补体结合、修饰的二硫键结构、或改变的糖基化模式。改变效应子功能的示例性fc修饰描述于6.2.5.1节中。
[0145]
fc结构域也可经改变以包括，例如通过允许异二聚化以促进不对称mbm的可制造性的修饰，该异二聚化为不相同的fc结构域相对于相同的fc结构域的优选配对。异二聚化允许mbm的产生，其中不同的abs通过含有序列上不同的fc结构域的fc区彼此相互连接。异二聚化策略的实例在6.2.5.2节中举例说明。
[0146]
应当理解，任何上文所提及的修饰可以任何适合的方式组合以实现期望的功能特性，和/或与其他的修饰组合用以改变mbm的性质。
[0147]
6.2.5.1.具有改变的效应子功能的fc结构域
[0148]
在一些实施方案中，fc结构域包含一个或多个降低与fc受体结合和/或效应子功能的氨基酸取代。
[0149]
在特定的实施方案中，fc受体为fcγ受体。在一个实施方案中，fc受体为人fc受体。在一个实施方案中，fc受体为活化的fc受体。在具体的实施方案中，fc受体为活化的人fcγ受体，更具体地为人fcγriiia、fcγri或fcγriia，最具体地为人fcγriiia。在一个实施方案中，效应子功能选自以下的一种或多种：补体依赖的细胞毒性作用(cdc)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc)、抗体依赖的细胞吞噬作用(adcp)、以及细胞因子分
泌作用。在特定的实施方案中，效应子功能为adcc。
[0150]
在一个实施方案中，fc区包含在选自e233、l234、l235、n297、p331和p329(根据kabat eu索引编号)的位点的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，fc区包含在选自l234、l235和p329(根据kabat eu索引编号)的位点的氨基酸取代。在一些实施方案中，fc区包含l234a和l235a氨基酸取代(根据kabat eu索引编号)。在一个此类实施方案中，fc区是igd fc区，尤其是人igd fc区。在一个实施方案中，fc区包含在位点p329的氨基酸取代。在更具体的实施方案中，氨基酸取代是p329a或p329g，尤其是p329g(根据kabat eu索引编号)。在一个实施方案中，fc区包含在位点p329的氨基酸取代和在选自e233、l234、l235、n297和p331(根据kabat eu索引编号)的位点的其他氨基酸取代。在更具体的实施方案中，其他的氨基酸取代是e233p、l234a、l235a、l235e、n297a、n297d或p331s。在特定的实施方案中，fc区包含在位点p329、l234和l235的氨基酸取代(根据kabat eu索引编号)。在更特定的实施方案中，fc区包含氨基酸突变l234a、l235a和p329g(“p329g lala”、“pglala”或“lalapg”)。
[0151]
典型地，在fc区的两个fc结构域中各自存在相同的一个或多个氨基酸取代。因此，在特定的实施方案中，fc区的各fc结构域包含l234a、l235a和p329g氨基酸取代(kabat eu索引编号)，即在fc区的第一和第二fc结构域的每个中，位点234的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(l234a)，位点235的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(l235a)及位点329的脯氨酸残基由甘氨酸残基取代(p329g)(根据kabat eu索引编号)。
[0152]
在一个实施方案中，fc结构域是igg1 fc结构域，尤其是人igg1 fc结构域。
[0153]
典型地，在fc区的两个fc结构域中各自存在相同的一个或多个氨基酸取代。因此，在特定的实施方案中，fc区的各fc结构域包含l234a、l235a和p329g氨基酸取代(kabat eu索引编号)，即在fc区的第一和第二fc结构域的每个中，位点234的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(l234a)，位点235的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(l235a)及位点329的脯氨酸残基由甘氨酸残基取代(p329g)(根据kabat eu索引编号)。
[0154]
在一个实施方案中，fc结构域是igg1 fc结构域，尤其是人igg1 fc结构域。在一些实施方案中，igg1 fc结构域是包含d265a、n297a突变(eu编号)以降低效应子功能的变体igg1。
[0155]
在另一个实施方案中，fc结构域是具有降低的fc受体结合的igg4 fc结构域。具有降低的fc受体结合的示例性igg4 fc结构域可包含选自下表a的氨基酸序列。在一些实施方案中，fc结构域仅包括下列所示序列的粗体字部分：
[0156]
[0157]
[0158]
meth 248：7-15中。一般而言，该方法涉及在第一多肽的界面引入突出(“杵”)和在第二多肽的界面引入对应空腔(“臼”)，使得突出可定位于空腔内，以便促进异二聚体的形成和阻碍同二聚体形成。突出通过以较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽界面的小氨基酸侧链来导入。通过以较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面制造与突出相同或类似大小的互补空腔。
[0167]
因此，在一些实施方案中，fc结构域的第一亚基的ch3结构域中的氨基酸残基由具有较大侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第一亚基的ch3结构域内产生突出，其可定位在第二亚基的ch3结构域内的空腔中，且fc结构域的第二亚基的ch3结构域中的氨基酸残基由具有较小侧链体积的氨基酸残基取代，从而在第二亚基的ch3区内产生空腔，第一亚基的ch3结构域内的突出可定位至该空腔。优选地所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w)。优选地所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)和缬氨酸(v)。突出和空腔可通过改变编码此多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性突变或通过肽合成。示例性的取代为y470t。
[0168]
在具体的此类实施方案中，在第一fc结构域中，位置366处的苏氨酸由色氨酸残基取代(t366w)，且在该fc结构域中，位置407处的酪氨酸残基由缬氨酸残基取代(y407v)，并且任选地位置366处的苏氨酸残基由丝氨酸残基取代(t366s)及位置368处的亮氨酸残基由丙氨酸残基取代(l368a)(根据kabat eu索引编号)。在进一步的实施方案中，另外地在第一fc结构域中位置354处的丝氨酸残基由半胱氨酸残基取代(s354c)或位置356处的谷氨酸由半胱氨酸残基取代(e356c)(尤其是位置354处的丝氨酸残基由半胱氨酸残基取代)，及另外地在第二fc结构域中位置349处的酪氨酸残基由半胱氨酸残基取代(y349c)(根据kabat eu索引编号)。在特定的实施方案中，第一fc结构域包含氨基酸取代s354c和t366w，及第二fc结构域包含氨基酸取代y349c、t366s、l368a和y407v(根据kabat eu索引编号)。
[0169]
在一些实施方案中，静电转向(例如，如gunasekaran等人,2010,j biol chem 285(25)：19637-46中所述)可用于促进fc结构域的第一和第二亚基的结合。
[0170]
或者或除了使用经修饰以促进异二聚化的fc结构域之外，fc结构域可经修饰以允许能选择fc异二聚体的纯化策略。在一个此类实施方案中，半抗体包含消除其与蛋白a结合的修饰的fc结构域，从而能进行产生异二聚化蛋白的纯化方法。参见，例如美国专利第8,586,713号。因此，mbm包含第一ch3结构域和第二ig ch3结构域，其中该第一和第二ig ch3结构域彼此有至少一个氨基酸不同，且相较于缺乏氨基酸差异的对应mbm，其中该至少一个氨基酸差异降低了mbm与蛋白a的结合。在一个实施方案中，第一ch3结构域与蛋白a结合而第二ch3结构域含有降低或消除蛋白a结合的突变/修饰，例如h95r修饰(imgt外显子编号；eu编号为h435r)。第二ch3可进一步包含y96f修饰(imgt；eu为y436f)。此类修饰在本文中称为“星形(star)”突变。
[0171]
6.3.靶分子
[0172]
本公开mbm的abs1、abs2和abs3各自特异性结合靶分子，靶分子例如为细胞表面表达的抗原，如蛋白质、醣类或脂质。在一些实施方案中，由abs1、abs2和abs3结合的靶分子为蛋白分子。示例性靶分子包括人克洛索β(human klotho beta)(“klb”)、人纤维母细胞生长因子受体1c同种型(“fgfr1c”)、人纤维母细胞生长因子受体3(“fgfr3”)、人cd63和人淀粉样蛋白前体样蛋白2(aplp2)。
[0173]
优选地，选择scfv、fab1和fab2以使各abs1、abs2和abs3能同时与其各自的靶标特异性结合。在一些实施方案中，abs1、abs2和abs3各自与不同的靶分子特异性结合。在其他的实施方案中，abs1、abs2和abs3中的两个可与相同靶分子上的不同表位结合。
[0174]
当abs1、abs2和abs3中的两个与相同靶分子上的不同表位结合时，与靶分子的结合优选地为非竞争性的，即abs不会竞争以结合靶分子(其可能会发生在例如当表位重叠时)。用于测量抗体和抗体片段间的结合竞争的测定已为本领域所知并包括，例如酶联免疫吸附测定(elisa)、荧光激活细胞分选(facs)测定和表面等离子共振测定。
[0175]
举例来说，靶分子结合的竞争可使用实时、非标记生物膜干涉测定在octet htx生物传感器平台上(pall fortebio corp.)确定。在测定的具体实施方案中，整个测定在25℃于10mm hepes、150mm nacl、3mm edta、1mg/ml bsa、0.05％v/v表面活性剂tween-20、ph 7.4的缓冲液(hbs-ebt缓冲液)中以1000rpm速度震荡的测定盘中进行。为分析两种抗体或其抗原结合片段是否能彼此相互竞争与其特定靶抗原上的各自表位结合，首先通过将传感器尖端浸入含有5-his标记的靶抗原(“5-his”如seq id no：25所公开)的孔中，将5-his标记的靶抗原(“5-his”如seq id no：25所公开)捕获至包被有抗-5-his抗体(“5-his”如seq id no：25所公开)的octet传感器尖端(fortebio inc,#18-5122)。然后通过浸入含有ab-1的溶液(例如，50μg/ml溶液)的孔中用第一抗体或其抗原-结合片段(后称为ab-1)使捕捉至传感器尖端的抗原饱和。然后将传感器尖端浸入含有第二抗体或其抗原-结合片段(后称为ab-2)的溶液(例如，50μg/ml溶液)的孔中。在测定的每个步骤之间以hbs-ebt缓冲液清洗传感器尖端。在整个测定期间可监测实时结合反应并可在每个步骤结束时记录结合反应。可比较ab-2与预先和ab-1复合的靶抗原的结合反应并确定不同抗体/抗原-结合片段对相同靶抗原的竞争/非竞争行为。
[0176]
可使用结合至少两个或更多个不同靶分子的mbm，以例如优选地靶向表达两个或更多个靶分子的特定组织，同时最小化与非期望结合的其他组织类型的结合。例如，当abs1、abs2和abs3中的一个或两个与具有第一组织表达图谱的第一靶分子结合且abs1、abs2和abs3中的至少一个与具有重叠于但不同于第一表达图谱的第二组织表达图谱的第二不同靶分子结合时，该mbm可靶向第一和第二表达图谱的正常组织。
[0177]
与相同靶分子结合(无论在相同表位或不同表位)的具有一个以上abs的mbm可用于聚集和活化细胞表面受体。
[0178]
表达图谱可根据经验来确定或由公开数据库取得，例如基因型组织表达(gtex)计划和人类蛋白图谱。靶标选择可基于蛋白表达图谱、mrna表达图谱或两者。为最小化非期望组织位点的mbm活性，在abs1、abs2和abs3的任意两个或全部三个间表达重叠的组织优选地少于10个组织，例如9个组织，8个组织，7个组织，6个组织，5个组织，4个组织，3个组织，2个组织或1个组织。图4a(以gtex数据库为基础)和图4b(以hpa数据库为基础)显示了与本公开的mbm结合的示例性靶标对klb和fgfr1c的示例性组织图谱分析。
[0179]
在各种实施方案中：
[0180]
·
abs1和abs2与相同靶分子上的相同或不同表位结合而abs3与不同靶分子结合；
[0181]
·
abs1和abs3与相同靶分子上的相同或不同表位结合而abs2与不同靶分子结合；
[0182]
·
abs2和abs3与相同靶分子上的相同或不同表位结合而abs1与不同靶分子结合；
[0183]
·
abs1、abs2和abs3与不同靶分子结合；或
[0184]
·
abs1、abs2和abs3与相同靶分子上的相同或不同表位结合。
[0185]
当abs1、abs2和abs3中的两个或更多个与靶分子上的相同表位结合时，该abs可具有相同或不同的vh序列和/或vl序列。
[0186]
不受限于理论，据信本公开的mbm具有以大于缺乏全部三种abs的亲代单特异性抗体或双特异性抗体的亲和力与靶分子(或表达靶分子的细胞)结合的优点。因此，本公开的mbm在一些实施方案可以大于缺乏全部三种abs的亲代单特异性抗体或双特异性抗体，例如缺乏abs1的scfv的双特异性抗体的亲和力与一个或多个靶分子和/或表达一个或多个靶分子的细胞结合。例如，mbm在一些实施方案中可具有比对应的亲代单特异性抗体或双特异性抗体更低的结合靶分子的kd和/或在基于细胞的结合测定中具有比对应的亲代单特异性抗体或双特异性抗体更强力的ec50值(例如，如7节中所述)。
[0187]
给定抗体或mbm的激动剂或拮抗剂活性取决于靶标选择、表位覆盖和形式选择。激动性和拮抗性抗体的鉴定可例如通过基于功能的筛选来实现。当亲代抗体或亲代双特异性抗体在scfv融合前分别具有激动剂或拮抗剂活性，则本公开中n-端scfv mbm具有激活剂或拮抗剂活性。不受限于理论，据信当相较于传统的双特异性分子(例如，含有两个fab但缺乏n-端scfv区的亲代双特异性分子)，本公开的mbm，例如由于额外的n-端scfv区所赋予的新的结合化学计量数，其特征在于增强的活性(例如激动剂或拮抗剂活性)。
[0188]
6.3.1.klb
–
fgfr1c结合剂
[0189]
本公开的mbm在一些实施方案中可含有一个或多个与人klb结合的abs和一个或多个与人fgfr1c(例如，d2或d3环)结合的abs。表达klb和fgfr1c二者的人组织包括脂肪组织、乳房组织、肝、肺、胰脏、胃和睾丸(参见，图4a至4b)。因此，具有一个或多个与人klb结合的abs和一个或多个与人fgfr1c结合的abs的本公开mbm可以优选地靶向这些组织类型。fgf家族的成员fgf21，通过由fgfr1c和klb组成的受体复合物传递信号且因此作为内分泌激素。在该靶标对的一个示例性构型中，abs1和abs3与klb的不同表位结合而abs2与fgfr1c结合。不受限于理论，据信结合具有此构型的mbm激化(agonize)受体复合物并导致如图5中所示的代谢益处。
[0190]
示例性的抗-klb抗体提供于表2a中并且可用于本公开mbm的示例性的抗-klb抗体的vh和vl序列提供于表2b中。本公开的mbm可包括例如提供于表2a或表2b中的任何抗-klb抗体的cdr或vh和/或vl序列。示例性抗-fgfr1c抗体提供于表3a中并且可用于本公开mbm的示例性抗-fgfr1c抗体的vh和vl序列提供于表3b中。本公开的mbm可包括例如提供于表3a或表3b中的任何抗-fgfr1c抗体的cdr或vh和/或vl序列。
[0191][0192][0193]
[0194][0195][0196]
6.3.2.fgfr3
–
aplp2结合剂
[0197]
本公开的mbm在一些实施方案中可含有一个或多个与人fgfr3结合的abs和一个或多个与人aplp2结合的abs。fgfr3为经临床验证的膀胱癌的致癌驱动因子。aplp2鉴定为可经历快速内化和降解的细胞表面受体。本公开的mbm可具有一个或多个与人fgfr3结合的abs和一个或多个与人aplp2结合的abs，用以诱导经由aplp2的fgfr3阻断和增强的fgfr3下调。在该靶标对的一个示例性构型中，abs2和abs3与fgfr3的相同表位结合而abs1与aplp2结合。不受限于理论，据信结合具有此构型的mbm导致fgfr3受体复合物的阻断和/或降解。
[0198]
示例性抗-fgfr3抗体序列提供于表4中。本公开的mbm可包括例如提供于表4中的任何抗-fgfr3抗体的cdr或vh和/或vl序列。示例性抗-aplp2抗体提供于表5中。本公开的
mbm可包括例如提供于表5中的任何抗-aplp2抗体的cdr或vh和/或vl序列。
[0199][0200]
[0201]
6.3.3.fgfr3
–
cd63结合剂
[0202]
本公开的mbm在一些实施方案中可含有一个或多个与人fgfr3结合的abs和一个或多个与人cd63结合的abs。fgfr3为经临床验证的膀胱癌的致癌驱动因子。cd63为可调节结合伴侣运输的普遍表达的细胞表面四跨膜蛋白。本公开的mbm可具有一个或多个与人fgfr3结合的abs和一个或多个与人cd63结合的abs，用以诱导经由cd63的fgfr3阻断和增强的fgfr3下调或表面保留。在该靶标对的一个示例性构型中，abs2和abs3与fgfr3的相同表位结合而abs1与cd63结合。不受限于理论，据信结合具有此构型的mbm导致fgfr3受体复合物的阻断和/或降解。
[0203]
示例性抗-fgfr3抗体序列提供于上表4中。本公开的mbm可包括，例如提供于表4中的任何抗-fgfr3抗体的cdr或vh和/或vl序列。可用于本公开mbm的示例性抗-cd63抗体的vh和vl序列提供于表6中。本公开的mbm可包括，例如提供于表6中的任何抗-cd63抗体的cdr或vh和/或vl序列。
[0204][0205]
6.4.抗体药物缀合物
[0206]
本公开的mbm可例如通过接头与药物部分缀合，尤其是当该mbm旨在用作癌症治疗剂时。为了方便起见，此类缀合物在本文中称为抗体药物缀合物(或“adc”)。
[0207]
在某些方面，药物部分发挥细胞毒性或细胞抑制活性。在一个实施方案中，药物部
分选自类美登素(maytansinoid)、类驱动蛋白kif11抑制剂(kinesin-like protein kif11 inhibitor)、v-atpase(液泡-型h -atpase)抑制剂、促细胞凋亡剂、bcl2(b-细胞淋巴瘤2)抑制剂、mcl1(骨髓细胞白血病1)抑制剂、hsp90(热休克蛋白90)抑制剂、iap(细胞凋亡的抑制剂)抑制剂、mtor(雷帕霉素的机制靶标)抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、metap(甲硫氨酸氨基肽酶)、crm1(染色体维持蛋白1)抑制剂、dppiv(二肽基肽酶iv)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白合成抑制剂、激酶抑制剂、cdk2(细胞周期蛋白依赖激酶2)抑制剂、cdk9(细胞周期蛋白依赖激酶9)抑制剂、驱动蛋白抑制剂、hdac(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、dna损伤剂、dna烷化剂、dna嵌入剂、dna小沟结合剂、rna聚合酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或dhfr(二氢叶酸还原酶)抑制剂。
[0208]
在一些实施方案中，细胞毒剂为具有下列结构的类美登素：
[0209][0210]
在一些实施方案中，细胞毒剂为具有下列结构的类美登素：
[0211][0212]
在一些实施方案中，adc包含本公开的mbm和
[0213][0214]
其中为连接至mbm的键。
[0215]
在一些实施方案中，抗体药物缀合物包含本公开的mbm和
[0216][0217]
其中为连接至mbm的键。
[0218]
在一些实施方案中，adc包含本公开的mbm和
[0219]
或
[0220]
或
[0221]
其混合物，
[0222]
其中为连接至本公开mbm的键。
[0223]
在一些实施方案中，所述键通过半胱氨酸残基的硫组分与mbm相连接。
[0224]
在一些实施方案中，所述键通过赖氨酸残基的氮组分与mbm相连接。
[0225]
在本公开的adc中，细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂通过adc接头与mbm相连接。连接细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂与adc的mbm的adc接头可为短的、长的、疏水性、亲水性、柔性或刚性，或可由各自独立地具有一种或多种上述性质的片段组成，使得此接头可包括具有不同性质的片段。接头可为多价的，使其将一种以上的药剂与mbm上的单一位点共价连接，或为单价的，使其将单一药剂与mbm上的单一位点共价连接。
[0226]
在某些方面，接头选自可裂解的接头、不可裂解的接头、亲水性接头、预带电荷接头或基于二羧酸的接头。
[0227]
技术人员应当理解，adc接头通过在一个位置形成与细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂的共价键和在另一位置形成与mbm的共价键来连接细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂与mbm。共价键通过adc接头上的官能团及药剂和mbm上的官能团之间的反应而形成。
[0228]
adc接头优选地，但非必要，为化学上稳定的以适应细胞外部，且可经设计以在细胞内裂解、破坏和/或另外特别是降解。或者，可使用并非设计用于特别地在细胞内裂解或降解的adc接头。稳定与不稳定的adc接头的选择可取决于细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂的毒性。就对正常细胞有毒的试剂，优选稳定的接头。可利用具有选择性或靶向性且对正常细胞毒性较低的药剂，adc接头对胞外环境的化学稳定性较不重要。可用于连接药物与mbm的各种adc接头已为本领域所知。任何这些adc接头，以及其他adc接头可用于连接细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂与本公开的adc的mbm。
[0229]
可用于连接许多细胞毒剂和/或细胞生长抑制剂与单一mbm分子的示例性多价adc接头描述于，例如wo 2009/073445；wo 2010/068795；wo 2010/138719；wo 2011/120053；wo 2011/171020；wo 2013/096901；wo 2014/008375；wo 2014/093379；wo 2014/093394；wo 2014/093640中，其内容通过整体引用并入本发明。例如，由mersana等人所开发的fleximer接头技术具有得到具有良好物化性质的高dar adc的潜力。mersana技术基于通过一系列的酯键将药物分子引入溶解的聚缩醛骨架。此方法提供高负载的adc(dar最高达20)同时维持良好的物化性质。
[0230]
可使用的示例性单价adc接头描述于，例如nolting,2013,antibody-drug conjugates,methods in molecular biology 1045：71-100；ducry等人,2010,bioconjugate chem.21：5-13；zhao等人,2011,j.med.chem.54：3606-3623；美国专利第7,223,837号；美国专利第8,568,728号；美国专利第8,535,678号；及w02004010957中，其各自通过引用并入本发明。
[0231]
举例而言且不限于此，可包括在本公开adc中的某些可裂解和不可裂解adc接头描述于下文中。
[0232]
在某些实施方案中，所选的adc接头在体内为可裂解的。可裂解adc接头可包括化学上或酶促中不稳定或可降解的键。可裂解adc接头一般依赖细胞内过程以释放药物，例如在细胞质中还原、暴露于溶酶体的酸性条件或通过特异性蛋白酶或细胞内的其他酶裂解。可裂解的adc接头一般引入一个或多个化学上或酶促中可裂解的化学键，而adc接头的其余部分为不可裂解的。在某些实施方案中，adc接头包含化学上不稳定基团，例如腙和/或二硫基团。包括化学上不稳定基团的接头利用血浆和一些细胞质区室之间的差异性质。对含腙的adc接头的促进药物释放的胞内条件为内体和溶酶体的酸性环境，而含二硫键的adc接头在含有高硫醇浓度，例如谷胱甘肽的细胞溶质中还原。在某些实施方案中，包括化学上不稳定基团的adc接头的血浆稳定性可通过使用靠近化学上不稳定基团的取代基引入空间位阻来增加。
[0233]
可裂解adc接头可包括不可裂解部分或片段，和/或可包括在其他不可裂解adc接头内以赋予其可裂解性的可裂解片段或部分。仅举例而言，聚乙二醇(peg)和相关的聚合物可将可裂解基团包括在聚合物的骨架中。例如，聚乙二醇或聚合物adc接头可包括一个或多个可裂解基团，例如二硫键、腙或二肽。
[0234]
可包括在adc接头中的其他可裂解键包括通过peg羧酸或活化的peg羧酸与在生物活性剂上的醇基团的反应所形成的酯键，其中此类酯基团一般在生理条件下水解以释放生物活性剂。水解可降解的键包括但不限于碳酸键；由胺和醛反应所产生的亚胺键；由醇与磷酸基团反应所形成的磷酸酯键；醛和醇的反应产物缩醛键；甲酸盐和醇的反应产物原酸酯
键；及由包括但不限于在聚合物末端的亚磷酰胺基团和寡核苷酸的5'羟基基团所形成的寡核苷酸键。
[0235]
在某些实施方案中，adc接头包含酶促可裂解的肽部分，例如三肽或二肽。在特定的实施方案中，二肽选自：val-cit；cit-val；ala-ala；ala-cit；cit-ala；asn-cit；cit-asn；cit-cit；val-glu；glu-val；ser-cit；cit-ser；lys-cit；cit-lys；asp-cit；cit-asp；ala-val；val-ala；phe-lys；val-lys；ala-lys；phe-cit；leu-cit；lle-cit；phe-arg；和trp-cit。在某些实施方案中，二肽选自：cit-val；和ala-val。
[0236]
在上文或本文中所论述的adc的多种实施方案中的任何一种，adc可具有1至20，更典型地2至10的药物：抗体比率(或在此情况下，药物：mbm比率)。
[0237]
6.5.核酸和宿主细胞
[0238]
在另一方面，本公开提供了编码本公开mbm的核酸。在一些实施方案中，mbm由单一核酸编码。在其他实施方案中，mbm由多个(例如两个、三个、四个或更多个)核酸编码。
[0239]
单一核酸可编码包含单一多肽链的mbm，包含两条或更多条多肽链的mbm，或包含两条以上多肽链的mbm的一部分(例如，单一核酸可编码包含三条、四条或更多条多肽链的mbm的两条多肽链，或包含四条或更多条多肽链的mbm的三条多肽链)。就表达的单独控制，编码两条或更多条多肽链的开放阅读框可在单独的转录调节元件(例如，启动子和/或增强子)的控制下。编码两条或更多条多肽链的开放阅读框也可通过相同的转录调节元件控制，并通过内部核糖体进入位点(ires)序列隔开以允许翻译成单独的多肽。
[0240]
在一些实施方案中，包含两条或更多条多肽链的mbm由两个或更多个核酸编码。编码mbm的核酸数目可等于或低于mbm中多肽链的数目(例如，当一条以上的多肽链由单一核酸所编码时)。
[0241]
本公开的核酸可为dna或rna(例如，mrna)。
[0242]
在另一方面，本公开提供了含有本公开核酸的宿主细胞和载体。核酸可存在于相同的宿主细胞或分开的宿主细胞中存在的单一载体或独立载体中，如下文更详细说明。
[0243]
6.5.1.载体
[0244]
本公开提供了包含编码本文所述的mbm或mbm组分，例如半抗体的一或两条多肽链的核苷酸序列的载体。载体包括但不限于病毒、质粒、黏粒、λ噬菌体或酵母菌人工染色体(yac)。
[0245]
可以使用多种载体系统。例如，一类载体利用衍生自动物病毒的dna元件，动物病毒例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)、mmtv或momlv)或sv40病毒。另一类载体利用衍生自rna病毒的rna元件，rna病毒例如塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、东方马脑炎病毒和黄热病毒。
[0246]
另外，可通过引入一个或多个允许选择转染宿主细胞的标志物来选择已稳定将dna整合至其染色体中的细胞。标志物可提供，例如，对营养缺陷型宿主的质子移变作用、抗微生物剂抗性(例如，抗生素)、或例如铜等重金属的抗性。可选择标志物基因可直接连接至待表达的dna序列，或通过共转化引入到相同的细胞。mrna的最佳合成也可能需要另外的元件。这些元件可包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
[0247]
一旦含有构建体的表达载体或dna序列已制备用于表达，则表达载体可转染或引
入到适当的宿主细胞。该目的可运用各种技术来实现，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。用于培养所产生的转染细胞和用于回收表达的多肽的方法和条件已为本领域技术人员所知，且可基于本说明书根据使用的特异性表达载体和哺乳动物细胞变化或优化。
[0248]
6.5.2.细胞
[0249]
本公开还提供了包含本公开的核酸的宿主细胞。
[0250]
在一个实施方案中，宿主细胞经基因工程化以包含一个或多个本文所述的核酸。
[0251]
在一个实施方案中，宿主细胞通过使用表达盒进行基因工程化。短语“表达盒”指能影响与此序列兼容的宿主基因表达的核苷酸序列。此类表达盒可包括启动子，有或无内含子的开放阅读框、和终止信号。也可使用必要的或有助于影响表达的其他因子，例如诱导型启动子。
[0252]
本公开还提供了包含本文所述的载体的宿主细胞。
[0253]
细胞可为但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人类细胞。适合的真核细胞包括但不限于vero细胞、hela细胞、cos细胞、cho细胞、hek293细胞、bhk细胞和mdckii细胞。适合的昆虫细胞包括但不限于sf9细胞。
[0254]
6.6.药物组合物
[0255]
本公开的mbm和/或adc可为包含mbm和/或adc及一种或多种载剂、赋形剂和/或稀释剂的组合物的形式。组合物可配制以用于特定用途，例如用于兽药用途或人体药物用途。组合物的形式(例如，干粉、液体制剂等)和所用的赋形剂、稀释剂和/或载剂取决于mbm和/或adc的期望用途、治疗用途、施用模式。
[0256]
对于治疗用途，组合物可以作为包括药学上可接受载剂的无菌药物组合物的部分来提供。组合物可为任何适合的形式(取决于其施用于患者的期望方法)。此药物组合物可通过多种途径施用于患者，例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌肉内、肿瘤内、鞘内、外用(topically)或局部(locally)。在任何给定案例中最适合的施用路径将取决于特定抗体和/或adc、受试者、和疾病性质及严重性、和受试者的身体状况。典型的，药物组合物将静脉内或皮下施用。
[0257]
药物组合物可以方便地存在于每剂量含有预定量的本公开的mbm和/或adc的单位剂型中。包括在单位剂量内的mbm和/或adc的量将取决于待治疗的疾病以及本领域中熟知的其他因素。此单位剂型可为含有适用于单次施用的mbm和/或adc的量的冻干粉末，或为液体形式。干粉单位剂型可包装成带有注射器、适合量的稀释剂和/或可用于施用的其他组分的试剂盒。液体形式的单位剂量可以方便地以预充填适用于单次施用的mbm和/或adc的量的注射器形式来提供。
[0258]
药物组合物也可以以含有适用于多次施用的adc的量的批量形式来提供。
[0259]
药物组合物可通过将具有期望纯度的mbm和/或adc与可选的药学上可接受载剂、赋形剂或稳定剂(其全部在本文中称为“载剂”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和其他的各种添加剂混合制备为冻干制剂或水溶液用于储存。参见，remington’s pharmaceutical sciences,16th edition(osol,ed.1980)。此类添加剂在所用的剂量和浓度上对于受试者应当没有毒性。
[0260]
缓冲剂有助于维持近似生理条件的范围内的ph。其可以以广泛的各种浓度存在，
但典型地将存在于约2mm至约50mm的浓度范围中。适合本公开使用的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐类，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸二氢钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸二氢钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)，延胡索酸盐缓冲剂(例如，延胡索酸-延胡索酸一钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸一钠-延胡索酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)及乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和例如tris的三甲基胺盐类。
[0261]
可加入防腐剂阻止微生物生长，且可以以约0.2％-1％(w/v)范围的量加入。适合本发明使用的防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵卤化物(benzalconium halide)(例如氯化物、溴化物和碘化物)、六甲铵氯化物(hexamethonium chloride)和对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开的液体组合物的等渗性，并包括多元糖醇，例如三元或更高糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。稳定剂指种类广泛的赋形剂，其功能范围从填充剂至溶解治疗剂或有助于防止变性或黏附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可为多元糖醇(列举于上)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括例如肌醇的环醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、a-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少残基的多肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单醣，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二醣，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；及三醣，例如棉子糖；及多醣，例如右旋糖酐。稳定剂可以以每重量adc 0.5至10重量％的量存在。
[0262]
可加入非离子表面活性剂或去污剂(也称为“湿化剂”)以帮助溶解糖蛋白以及保护糖蛋白免受搅动引发的聚集作用，其也允许制剂暴露于剪切表面应力而不会造成蛋白变性。适合的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184、188等)及pluronic多元醇。非离子表面活性剂可以存在于约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围内，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml。
[0263]
其他各种赋形剂包括填充剂(例如，淀粉)，螯合剂(例如，edta)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素e)和助溶剂。
[0264]
6.7.治疗适应症
[0265]
本公开的mbm、adc和药物组合物可用于治疗癌症，例如与abs1、abs2和abs3结合的靶分子的表达相关的癌症。
[0266]
因此，在一方面，本公开提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌症的受试者
施用有效量的本公开的mbm、缀合物或药物组合物。在特定的实施方案中，与fgfr3结合，及任选地与cd63结合或与aplp2结合的本公开的mbm，可用于治疗膀胱癌、胶质母细胞瘤和鳞状细胞肺癌。
[0267]
本公开的mbm、adc和药物组合物也可用于非癌症适应症，例如用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(“nash”)，治疗代谢疾病，降低循环hdl胆固醇，增加循环ldl胆固醇，降低血液甘油三酯，降低血糖，治疗肥胖症，和治疗糖尿病。对于此类非癌症适应症，在一些实施方案中，mbm靶向klb和/或fgfr1c。
[0268]
因此，在一方面，本公开提供了降低循环hdl胆固醇的方法，该方法包括向具有升高的hdl水平的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
[0269]
在另一方面，本公开提供了增加循环ldl胆固醇的方法，该方法包括向具有低ldl水平的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
[0270]
在另一方面，本公开提供了降低血液甘油三酯的方法，该方法包括向具有升高的甘油三酯水平的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
[0271]
在另一方面，本公开提供了降低血糖的方法，该方法包括向具有升高的血糖水平的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
[0272]
在另一方面，本公开提供了治疗肥胖症的方法，该方法包括向患有肥胖症的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
[0273]
在另一方面，本公开提供了治疗糖尿病的方法，该方法包括向患有糖尿病的受试者施用有效量的本公开mbm、缀合物或药物组合物。
7.实施例
[0274]
7.1.实施例1：fgfr1c x klb x klb 2 1 n-scfv mbm
[0275]
7.1.1.材料和方法
[0276]
7.1.1.1.mbm的生成
[0277]
将与klb表位1(ep1)或表位2(ep2)结合的各种klb scfv与来自靶向fgfr1c和klb的现有igg样双特异性分子regn4366的fgfr1c vh区的n-端融合(图1和表7)。
[0278]
通过integrated dna technologies,inc.(san diego,california)或genscript(piscataway,nj)合成编码以下的dna片段：(i)各种klb scfv，其以vl(带有100c突变，kabat编号)、接头(4xg4s(seq id no：57))和vh(带有44c突变，kabat编号)的方向，后跟用于连接scfv和结合fgfr1c的fab的不同长度的接头，(ii)结合fgfr1c的fab，及(iii)具有形成杵状突变(s354c、t366w，eu编号)、形成臼状突变(y349c、t366s、l368a、y407v，eu编号)和星形突变(h435r、y436f，eu编号)的igg1 fc结构域。
[0279]
依照new england biolabs inc.所提供的标准分子克隆方案，通过nebuilder hifi dna组装试剂盒(new england biolabs inc.)或限制性消化，随后通过连接，制备用于单独重链的哺乳动物表达载体。为表达fgfr1c/klb/klb 2 1 n-scfv mbm(f1k-scfv1-9)，将重链(“hc1-杵”和“hc2-臼*”)和通用轻链dna依照制造商的方案共转染至expi293细胞(thermofisher scientific)。收取50ml的细胞培养基并通过hitrap蛋白a ff柱(ge healthcare)进行纯化处理。对于功能确认，将选择的mbm放大至200ml并进行包括尺寸排阻色谱作为最终步骤的一系列纯化程序。制备和纯化具有与klb结合的fab和与fgfr1c结合的
fab的regn4366，作为igg样双特异性对照分子。
[0280]
7.1.1.2.基于hek293.sreluc.hfgfr1chs/hklb报告基因的测定
[0281]
使用稳定表达人fgfr1c和klb以及在含有血清反应元件(sre)的启动子的控制下的荧光酶报告基因的hek293.sreluc.hfgfr1chs/hklb细胞，检测mbm的激动剂活性。使用具有6xhis标签(seq id no：58)的重组人fgf21做为阳性对照，将得自fgf21的最大报告基因活性定义为100％活性。将细胞以各mbm或6xhis-fgf21处理6小时，然后进行荧光酶测定。针对fgf21的最大活性，将单独mbm所诱导的活性百分比进行归一化。进行剂量反应测定以确定ec50。
[0282]
7.1.1.3.hfgfr1c和hklb结合的biacore分析
[0283]
通过biacore分析确定f1k-scfv6结合作用的亲和力和机制。为了比较f1k-scfv6对klb的表观亲和力与亲代klb mab的单价亲和力，使用抗体捕获模式。简而言之，将fgfr1c亲代mab 19842、klb亲代mab 22532p2和22393p2、fgfr1c/klb亲代双特异性抗体regn4366和f1k-scfv6通过抗人fc抗体(regn2567)固定在cm5芯片上。将不同浓度的hfgfr1c_v5_6xhis(800
–
12.5nm，4倍稀释)或hklb.ha.6xhis(100
–
1.56nm，4倍稀释)以50μl/min进样2分钟并于25℃进行分析。使用1：1结合模型使用scrubber 2.0c通过拟合实时数据测量结合动力学参数。
[0284]
7.1.1.4.通过流式细胞术测定基于细胞的结合
[0285]
将hek293/cas9-hfgfr1/hklb(klb )、hek293/hfgfr1c(hfgfr1c )和hek293/hfgfr1c/hklb(hfgfr1c /hklb )细胞以1
×
106个细胞/ml悬浮于完全dulbecco's modified eagle medium(dmem)(10％胎牛血清(fbs)，1x青霉素链霉素-谷氨酰胺)并对1
×
105个细胞进行染色。加入mbm并于2至8℃将细胞染色30分钟。以facs清洗缓冲液(含有1％fbs和1mm edta的磷酸盐缓冲盐水(pbs))清洗细胞两次并于4℃以1800rpm离心4分钟。加入别藻蓝蛋白缀合的山羊抗人igg(jackson immuno research,109-136-098,1：400)并于2至8℃与细胞孵育30分钟。如前清洗细胞并悬浮于100μl的2％多聚甲醛。于2至8℃将细胞孵育30分钟并清洗两次。使用bd lsrfortessa
tm facs仪器分析染色的细胞。
[0286]
7.1.2.结果
[0287]
7.1.2.1.fgfr1c/klb/klb 2 1 n-scfv mbm的生成
[0288]
表达并纯化出九种具有表7中所示特征的fgfr1c/klb/klb 2 1 n-scfv mbm。
[0289][0290]
7.1.2.2.fgfr1c/klb/klb 2 1 n-scfv三特异性分子的表位依赖性活性
[0291]
使用hek293.sreluc.hfgfr1chs/hklb分析所纯化的fgfr1c/klb/klb 2 1 n-scfv mbm的激动剂活性的基于细胞的报告基因测定结果如表8中所示。基于％活性，发现f1k_scfv3、f1k_scfv6和f1k_scfv9为最佳活化剂。其全部共享相同的结合klb ep2区的klb靶向scfv，且在此测定中比如原始klb fab的具有靶向相同klb ep1区的scfv的mbm明显地更具活性。值得注意地，观察到具有30个氨基酸长度的scfv-fab接头的f1k_scfv6具有54.1％的最高活性及最佳效力(ec50＝9.80e-10m)。
[0292]
[0293][0294]
7.1.2.3.2 1 n-scfv三特异性f1k-scfv6可同时与相同klb上的两个不同表位结合
[0295]
f1k-scfv6的biacore分析结果如表9a至9b中所示。发现f1k-scfv6对hklb具有1.47e-11m的kd，其代表相较于亲代klb mab 22532p2和22393p2，亲和力分别增加55倍和1333倍。当与regn4366(具有针对hklb的22393p2臂)相比较时，也观察到f1k-scfv6对hklb增加的亲和力。此观察结果强力地支持以下结论：具有不同的针对klb的表位靶向臂的f1k-scfv6可同时结合相同hklb分子上的两个结合位点。对于hfgfr1c结合，相较于其亲代fgfr1c mab 19842或亲代双特异性抗体regn4366(具有针对hfgfr1c的19842臂)，f1k-scfv6对hfgfr1c具有稍微降低的亲和力(4倍)。
[0296]
[0297][0298]
7.1.2.4.2 1 n-scfv三特异性f1k-scfv6与过表达hklb和hfgfr1c/hklb的细胞结合更紧密
[0299]
为了进一步确认在基于细胞的环境下f1k-scfv6对hklb提升的亲和力的相关性，使用facs结合测定将三特异性f1k-scfv6(fgfr1c/klb/klb)与双特异性抗体regn4366(fgfr1c/klb 22393臂)和regn679(fgfr1c/klb 22532臂)、亲代抗体22393igg(klb)、22532igg(klb)和19842igg(fgfr1c)相比较。在hek293/cas9-hfgfr1/hklb(hfgfr1敲除和hklb过表达)和hek293/hfgfr1c/hklb(hfgfr1c和hklb过表达)两种细胞中，f1k-scfv6在结合上一致地展现出比所有其他对照组更强力的ec50(图6a和6c)。在针对hfgfr1c具有二价性的hek293/hfgfr1c细胞中，观察到19842 igg具有最强的结合，随后为regn4366和f1k-scfv6(图6b)。facs结合数据与biacore分析完全一致。不受限于理论，据信此实施例的数据显示了经由2 1 n-scfv三特异性设计的hklb的双表位结合提升了抗体介导的klb/fgfr1c受体复合物相互作用及潜在的细胞表面聚集。
[0300]
7.1.2.5.2 1 n-scfv mbm f1k-scfv6具有比双特异性regn436更优越的激动剂活性
[0301]
为了评估f1k-scfv6提升的亲和力是否能转化成相较于双特异性regn4366的提升效用，使用hek293.sreluc.hfgfr1chs/hklb进行体外基于报告基因的细胞测定。f1k-scfv6和regn4366均在亲和力纯化后通过尺寸排阻色谱作为最后步骤纯化，以移除任何可能扰乱数据解释的聚集物。相较于当针对可溶性fgf21进行归一化时仅有19％活化的亲代双特异性抗体regn4366，f1k-scfv6不仅使荧光酶基因表达效力(以ec50表示)提高了4至5倍，还使活化％显著提高至77％(图8)。
[0302]
还制备并评估了使用相同22532p2 scfv但与fc的c-端融合的类似的三价分子(称为2 1 c-scfv)。此对应的三特异性分子具有比f1k-scfv6更差的表达和纯化产量，以及更差的功能活性(结果未显示)。
[0303]
7.2.实施例2：接头长度对三特异性活性的影响的评估
[0304]
7.2.1.材料&方法
[0305]
通过以sre-荧光酶报高基因、全长人fgfr1c和全长人klb质粒顺序转染hek293细胞，产生hek293.sreluc.hfgfr1c.hklb稳定细胞系。
[0306]
产生称为scfv6的三特异性分子的接头长度变体并以荧光酶告基因测定进行检测，对照双特异性分子也同样进行。接头变体称为scfv6 lk7：g4s gg(seq id no：63)，scfv6 lk15：3xg4s(seq id no：1)，scfv6 lk22：4xg4s gg(seq id no：64)，scfv6：6xg4s(seq id no：59)，scfv6 lk37：7xg4s gg(seq id no：65)和scfv6 lk45：9xg4s(seq id no：60)。
[0307]
将细胞铺到384孔板中，并于含有10％胎牛血清(fbs)的完全培养基中培养过夜。将培养基换成添加有0.1％fbs的opti-mem减血清培养基(thermofisher,usa)。大约24小时后，以连续稀释的配体处理细胞6小时，然后使用one-glo
tm
荧光酶测定系统(promega,usa)，根据制造商说明书进行荧光酶测定。
[0308]
7.2.2.结果
[0309]
在一项研究中，将称为regn4304和regn4366的双特异性结合分子(bbm)的激动剂活性与hfgf21的激动剂活性进行比较。在此测定中，bbm显示出hfgf21激动剂活性的约30％(图7)。
[0310]
在另外的研究中，将接头长度变体(介于图9中所指出的2和3结构域间的肽接头)的激动剂活性与fgf21和称为regn4304的bbm的激动剂活性进行比较。结果如图9和下表10中所示：
[0311][0312]
所有接头长度变体显示出相对于对照双特性结合分子的至少约2x的活性，其中具有最短接头长度的变体(7或15个氨基酸)显示出最佳激动剂活性。
[0313]
7.3.实施例3：hek293细胞中fgfr1c信号传导的活化
[0314]
7.3.1.材料&方法
[0315]
如实施例3中所述产生hek293.sreluc.hfgfr1c.hklb稳定细胞系。对于蛋白质印迹分析，将hek293.sreluc.hfgfr1c.hklb细胞铺到6-孔板中，并于含有10％胎牛血清(fbs)的完全培养基中培养过夜。将培养换成添加0.1％fbs的opti-mem减血清培养基(thermofisher,usa)。大约24小时后，在细胞中加入稀释的配体至1nm或10nm最终浓度。15分钟后，以冷的pbs清洗细胞，然后在ripa裂解缓冲液中裂解(150mmtris/hcl，ph 7.4，50mm nacl,1％np-40和0.1％tween 20)。将总细胞裂解物用sds-page再溶解，并转置于pvdf膜上。对于蛋白质印迹分析，使用下列一抗：总erk(cell signaling,9102)，磷酸化-erk(cell signaling,9101)，plc-γ(cell signaling,5690)，磷酸化-plcγ(cell signaling,2821)。
[0316]
7.3.2.结果
[0317]
在稳定表达人fgfr1c和人klb的hek293.sreluc.hfgfr1c.hklb细胞中检测双特异
性和三特异性结合分子的激动剂活性，将不相关抗体regn1945作为阴性对照对照并将fgf21(regn1438)作为阳性对照。处理后，如测量荧光酶活性那样测量活化的fgfr1c诱导的erk和plc-γ磷酸化。
[0318]
f1k_scfv6lk7和f1k_scfv6l1在1nm和10nm浓度下强力诱导erk和plc-γ磷酸化。明显地，经f1k_scfv6或f1k_scfv6lk7处理的细胞中的磷酸化-erk和磷酸化-plc-γ的水平显著高于以对应浓度亲代双特异性抗体(regn4366)、fgfr1/klb激动剂双特异性抗体(regn4304)或重组的人fgf21(regn1438)处理的细胞中的水平(图10a)。
[0319]
为评估fgfr1c活化的时程，用配体处理hek293.sreluc.hfgfr1c.hklb细胞不同时间，并收获以进行蛋白质印迹分析。结果如图10b所示。早在用regn1438、regn4304或f1k_scfv6处理后15分钟观察到由磷酸化-erk水平所测量的erk活化，并持续至多6小时。在整个处理的时程，相较于regn1438或regn4304，f1k_scfv6显示出更高的磷酸化-erk水平。在15分钟时间点，f1k_scfv6强力地诱导磷酸化-plcγ，然后随时间逐渐下降。
[0320]
7.4.实施例4：通过不对称流场流分级偶联多角度激光散射(a4f-malls)进行的klb、fgfr1c和结合分子间形成的体外复合物的大小分析
[0321]
7.4.1.概述
[0322]
原则上，本公开的三特异性结合分子可与fgfr1c和klb形成不同类型的复合物。为了确定所形成的复合物类型，使用不对称流场流分级偶联多角度光散射(a4f-malls)进行2 1 n-scfv和2 1 n-fab三特异性结合分子间所形成的体外复合物的大小分析。还使用a4f-malls来分析由对照的双特异性结合分子(regn4304)和单特异性klb结合分子(regn4661)所形成的复合物。
[0323]
7.4.2.材料&方法
[0324]
7.4.2.1.a4f-malls流动相缓冲液
[0325]
通过将1.4g磷酸二氢钠单水合物、10.7g磷酸氢二钠七水合物和500ml 5m氯化钠混合，制备流动相缓冲液(10mm磷酸钠，500mm氯化钠，ph 7.0
±
0.1)；然后将溶液以hplc等级的水加至5.0l体积。最终所测量的缓冲液ph为7.0。使用前将流动相缓冲液过滤(0.2μm)。
[0326]
7.4.2.2.a4f-malls
[0327]
a4f-malls系统由eclipse
tm 3 a4f分离系统偶联配置有紫外线(uv)二极管阵列检测器的agilent 1200 series hplc系统、wyatt technology dawnii激光散射仪(ls)和t-rex差示折射仪(ri)检测器组成。检测器以下列顺序串联：uv-ls-ri。ls和ri检测器根据wyatt technology公司提供的说明书校正。
[0328]
将限定量的抗-klb和抗-fgfr1c多特异性结合分子各自与regn6424(重组klb)和regn6152(重组fgfr1c)混合并以1x dpbs,ph 7.4稀释，产生等摩尔比率：0.2μm多特异性结合分子：0.2μm regn regn6424或0.2μm多特异性结合分子：0.2μm regn regn6424：0.2μm regn regn6152。所有的样品室温孵育2小时并在4℃保持不过滤，随后进样至装有w350隔离箔垫(350μm垫片厚度，2.2cm垫片宽度)的eclipse
tm
短通道并使用10kda mwco再生纤维素膜。在各样品进样前，通道用流动相缓冲液(10mm磷酸钠，500mm氯化钠，ph 7.0
±
0.1)预平衡。单独进样牛血清白蛋白(bsa；2mg/ml；10μg样品负载)并纳入作为系统适用性对照。
[0329]
分级方法由四个步骤组成：进样、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。整个分级方法使用a4f-malls流动相缓冲液(10mm磷酸钠，500mm氯化钠，ph 7.0
±
0.1)。各样品(7μg)以
0.2ml/min的流速进样1分钟，随后以1.0ml/min的聚焦流速聚焦3分钟。将样品以1.0ml/min的通道流速以恒定的交叉流3.0ml/min洗脱15分钟，接着以3.0ml/min至0ml/min的线性梯度交叉流洗脱5分钟。最后，将交叉流保持在0ml/min另外的5分钟用以冲洗通道。使用相同的参数设定分级bsa。
[0330]
7.4.2.3.malls数据分析
[0331]
使用astra v软件(5.3.4.14版，wyatt technology)分析数据。将数据拟合至涉及过量散射光与溶质浓度和重均摩尔质量mw的方程式(kendrick等人,2001,anal biochem.299(2)：136-46；wyatt,1993,anal.chim.acta 272(1)：1-40)：
[0332]
方程式1：其中c为溶质浓度，r(θ,c)为作为散射角和浓度的函数的来自溶质的过量瑞立比值(raleigh ratio)，mw为摩尔质量，p(θ)描述散射光的角度依赖性(对于回转半径《50nm的粒子为～1)，a2为渗透压扩增中的第二维里系数(因为在稀释溶液上进行测量，因此可忽略)和
[0333]
方程式2：其中n0代表溶剂折射率，na为阿伏伽德罗常数，λ0为真空中入射光的波长，dn/dc代表溶质的特定折射率增加量。
[0334]
bsa单体的摩尔质量用来评估数据收集期间的光散射和差异折射率检测器的校正常数(系统适应性检查)。从uv和ri检测器所测定的bsa的平均摩尔质量的相对的标准偏差(％rsd)为≤5.0％。
[0335]
光散射检测器的归一化系数、检测器间的延迟体积和谱带展宽项从使用的a4f-malls条件下收集的bsa色谱图计算得出。这些数值适用于所有其他样品就校正这些项目所收集的数据文件。
[0336]
使用astra软件所提供的蛋白质缀合物分析以实验测定dn/dc值和215nm的消光系数。使用修正的消光系数和dn/dc值分析所有的蛋白质-蛋白质复合物样本。
[0337]
7.4.3.结果
[0338]
使用a4f-malls评估重组klb(regn6424)、重组fgfr1c(regn6152)和多种单特异性(regn4661)、双特异性(regn4304)和三特异性(2 1 n-scfv)结合分子之间所形成的复合物的相对大小分布。结果如图11a(regn4661)、图11b(regn4304)和图11c(2 1 n-scfv格式)中所示。潜在的抗体：抗原复合物的理论摩尔质量和预测的化学计量提供于图11a-11c的插图。如预期的，当以等摩尔比率组合时，单特异性klb结合分子(regn4661)与klb形成典型的1：1(波峰1,～280kda)和1：2(波峰2,～356kda)复合物(图11a)。同样地，当对照双特异性结合分子(抗-klbxfgfr1c；regn4304)与等摩尔量的klb混合时，观察到具有～280kda的计算摩尔质量的离散同质峰(峰1)(图11b)。以单独组分的计算摩尔质量为基准，峰1可能代表1：1双特异性：klb复合物。在混合物中进一步加入fgfr1c产生具有～305-444kda的计算摩尔质量的宽峰(峰2)，其一般而言与1：1：1双特异性：klb：fgfr1c三元复合物相符(图11b)。峰2尾端的上升趋势的摩尔质量表示较大的复合物，其通过klb-fgfr1c相互作用的微弱结合也可能存在溶液中，但容易因分级而解离。
[0339]
相较于对照单特异性和双特异性结合分子，三特异性结合分子以独特、较高等级
的化学计量结合klb和fgfr1c。当与等摩尔量的klb混合时，f1k-scfv6 igg1形成具有～579kda摩尔质量的广泛离散的同质峰(峰1)，其可能代表含有2分子f1k-scfv6 igg1与2分子klb结合的复合物(2：2复合物；图11c)。在混合物中加入不同量的fgfr1c后，观察到具有～607-644kda的计算摩尔质量的略微较宽的后洗脱峰(峰2)。峰2可能代表含有2分子f1k-scfv6 igg1、2分子klb和1-2分子fgfr1c的三元复合物(2：2：1和2：2：2复合物；图11c)的混合物。
[0340]
图12a说明了与fgfr1c和klb复合的fgf21的化学计量。图12b说明了fgf21-抗体结合的各种可选化学计量。本文所示的数据揭示，本公开的三特异性结合分子，相较于对照的单特异性和双特异性结合分子，可与klb和fgfr1c结合形成具有独特化学计量的三元复合物，其与双特异性结合分子相比可能有助于其增加的激动剂活性。
[0341]
7.5.实施例5：fgfr3/aplp2和fgfr3/cd63 2 1 n-scfv mbm
[0342]
7.5.1.材料和方法
[0343]
7.5.1.1.mbm的生成
[0344]
为构建具有与双价fgfr3 mab融合的单价scfv的2 1 n-scfv mbm，将16个aplp2靶向和三个cd63靶向的scfv独立地与具有修饰的人igg4 fc骨架的fgfr3亲代抗体30108的重链n-端融合，该骨架具有效应子沉默取代、臼型(y349c、t366s、l368a、y407v，eu编号)和星形(h435r、y436f，eu编号)突变(表11)。第二重链含有相同的30108 fab和具有相同效应子沉默取代和臼型(s354c,t366w,eu编号)突变的修饰的igg4 fc(表11)。2 1 n-scfv mbm的一般形式说明于图1中，fgfr3/aplp2和fgfr3/cd63 2 1 n-scfv mbm含有效应子沉默取代、杵臼突变和星形突变。在含有scfv的链中具有臼型突变并在缺乏scfv结构域的链中具有杵型突变的2 1 n-scfv mbm的一般形式如图3c所说明。在含有scfv的链中具有星形突变的2 1 n-scfv mbm的一般形式如图3a所说明。
[0345]
由integrated dna technologies,inc.(san diego,california)合成编码以下的dna片段：(i)各种aplp2或cd63 scfv，以vh(带有vh-44c，kabat编号)、接头(4xg4s(seq id no：57))、vl(带有vl-100c突变，kabat编号)、用于连接scfv与fab的接头(g4s)3(seq id no：1)的方向，(ii)30108的fab区，和(iii)修饰的人igg4 fc(表10)。单独重链的哺乳动物表达载体通过nebuilder hifi dna组装试剂盒(new england biolabs inc.)组装。对于fgfr3/aplp2或cd63 2 1 n-scfv分子的表达，将重链1-臼*，重链2-杵和ulc 3-20dna依照制造商的方案共转染至expi293细胞(thermofisher scientific)。收获50ml的细胞培养基并通过hitrap蛋白a ff柱(ge healthcare)进行纯化处理。对于功能确认，将3asb-5和3csb-2放大至200ml并进行包括尺寸排阻色谱法作为最终步骤的一系列纯化程序。使用先前所制备和纯化的靶向fgfr3的30108 igg作为对照。
[0346]
7.5.1.2.靶标结合的biacore分析
[0347]
进行biacore动力学分析用以评估3asb-5和3csb-2两种mbm对单独靶标的结合亲和力。
[0348]
7.5.1.3.增殖测定
[0349]
用表达s249c突变的umuc14细胞和表达fgfr3-tacc3融合突变的rt4细胞检测2 1 n-scfv对膀胱癌细胞增殖的影响。
[0350]
7.5.2.结果
[0351]
7.5.2.1.fgfr3/aplp2和fgfr3/cd63 2 1 n-scfv mbm的生成
[0352]
表达和纯化的代表性fgfr3/aplp2和fgfr3/cd63 2 1 n-scfv mbm的设计总结如表11中所示。
[0353][0354]
7.5.2.2.fgfr3/aplp2或cd63 2 1 n-scfv可与fgfr3、aplp2和cd63结合
[0355]
3asb-5和3csb-2对单独靶标的biacore动力学分析结果如表12a至12c中所示。发现两种2 1 n-scfv类似于亲代30108igg对照，以kd＝8nm与共同靶标fgfr3结合。对于3asb-5，发现其对aplp2的结合在亚纳摩尔浓度范围内，kd＝8.04e-10m。对于3csb-2，发现其对cd63的kd为5.88e-10m，比亲代h4h12450n igg的单价结合亲和力弱4倍。综上所述，3asb-5和3csb-2具有预期的与其靶标fgfr3、aplp2和cd63结合的能力。
[0356]
[0357][0358][0359]
7.5.2.3.fgfr3/aplp2 2 1 n-scfv 3asb-5和fgfr3/cd63 2 1 n-scfv 3csb-2在umuc14(s249c)和rt4(fgfr3-tacc3)细胞中可通过不同机制提供有效的增殖阻断
[0360]
用表达s249c突变的umuc14细胞和表达fgfr3-tacc3融合突变的rt4细胞检测2 1 n-scfv对膀胱癌细胞增殖的影响。亲代抗体h4h30108p2显示了在rt4细胞中的有效的生长抑制但在umuc14细胞中不理想的生长抑制活性。3csb-2和3asb-5在umuc14细胞中显示显著的提升活性，在最高的检测剂量(100nm)下增加～25％的生长抑制(图13a)。另外，2 1 n-scfv 3csb-2和3asb-5的活性在rt4细胞中维持高水平且与亲代抗体h4h30108p2相当(图13b)。不同于亲代fgfr3抗体，发现3csb-2和3asb-5能阻断由不同突变驱动的膀胱癌细胞增殖(图13a和13b)。
[0361]
为进一步研究fgfr3/aplp2或fgfr3/cd63 mbm背后的机制，针对umuc14细胞检测抗体诱导的受体降解效应。有趣地，在fgfr3/aplp2与fgfr3/cd63 mbm中观察到不同的机制。相较于无处理的细胞或以同种型对照抗体(regn1945)或亲代抗体h4h30108p2处理的细胞，用fgfr3/aplp2 mbm处理显示了增强水平的抗体诱导的受体降解(图14)。相反地，用fgfr3/cd63 mbm处理没有影响fgfr3受体水平，这表明双特异性3csb-2mbm的增强生长抑制活性源自不同的机制(图14)。
[0362]
8.具体实施方案
[0363]
本公开通过下列具体实施方案举项说明。
[0364]
1.多特异性结合分子(mbm)，其包含：
[0365]
(a)第一多肽链，其从n-端至c-端的方向包含(i)包含第一抗原结合位点(“abs1”)
的scfv，所述scfv可操作地连接至(ii)第一fab(“fab1”)的第一重链区，所述第一fab可操作地连接至(iii)fc结构域；
[0366]
(b)第二多肽链，其从n-端至c-端的方向包含(i)包含第二fab(“fab2”)的第二重链区，所述第二fab可操作地连接至(ii)fc结构域；
[0367]
(c)第三多肽链，其包含第一轻链，该第一轻链与所述第一重链区配对形成fab1，其中fab1包含第二抗原结合位点(“abs2”)；及
[0368]
(d)第四多肽链，其包含第二轻链，该第二轻链与所述第二重链区配对形成fab2，其中fab2包含第三抗原结合位(“abs3”)。
[0369]
2.如实施方案1的mbm，其中各抗原结合位点(“abs”)与不同的表位结合。
[0370]
3.如实施方案1或实施方案2的mbm，其中abs1、abs2和abs3中的两个与相同靶分子的不同表位特异性结合。
[0371]
4.如实施方案1至3中任一项的mbm，其中该scfv、fab1和fab2能同时与其各自的靶标特异性结合。
[0372]
5.如实施方案1至4中任一项的mbm，其中abs1、abs2和abs3中的至少一个与具有第一组织表达图谱的靶分子特异性结合且abs1、abs2和abs3中的至少一个与具有第二组织表达图谱的靶分子特异性结合，而该第二组织表达图谱与第一组织表达图谱重叠但并不相同。
[0373]
6.如实施方案5的mbm，其中第一组织表达图谱和第二组织表达图谱在10处或更少组织中重叠。
[0374]
7.如实施方案6的mbm，其中该第一组织表达图谱和第二组织表达图谱在5个或更少组织中重叠。
[0375]
8.如实施方案7的mbm，其中该第一组织表达图谱和第二组织表达图谱在3个或更少组织中重叠。
[0376]
9.如实施方案6至8中任一项的mbm，其中该第一和第二组织表达图谱由人类蛋白图谱(hpa)和/或基因型组织表达(gtex)计划确定。
[0377]
10.如实施方案6至9中任一项的mbm，其中该第一和第二组织表达图谱为蛋白质表达图谱。
[0378]
11.如实施方案6至9中任一项的mbm，其中该第一和第二组织表达图谱为mrna表达图谱。
[0379]
12.如实施方案1至11中任一项的mbm，其中该mbm对fab1的靶分子的亲和力低于缺乏所述mbm的scfv但在其他方面与所述mbm在氨基酸序列上相同的第二mbm对fab1的靶分子的亲和力。
[0380]
13.如实施方案1至12中任一项的mbm，其中该scfv通过接头与第一重链区相连接。
[0381]
14.如实施方案13的mbm，其中该接头的长度为至少5个氨基酸、至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸及任选地长度为至多30个氨基酸、至多40个氨基酸、至多50个氨基酸、或至多60个氨基酸，且在一些具体的实施方案中该接头：
[0382]
(a)长度为5个氨基酸至50个氨基酸；
[0383]
(b)长度为5个氨基酸至45个氨基酸；
[0384]
(c)长度为5个氨基酸至40个氨基酸；
[0385]
(d)长度为5个氨基酸至35个氨基酸；
[0386]
(e)长度为5个氨基酸至30个氨基酸；
[0387]
(f)长度为5个氨基酸至25个氨基酸；
[0388]
(g)长度为5个氨基酸至20个氨基酸；
[0389]
(h)长度为6个氨基酸至50个氨基酸；
[0390]
(i)长度为6个氨基酸至45个氨基酸；
[0391]
(j)长度为6个氨基酸至40个氨基酸；
[0392]
(k)长度为6个氨基酸至35个氨基酸；
[0393]
(l)长度为6个氨基酸至30个氨基酸；
[0394]
(m)长度为6个氨基酸至25个氨基酸；
[0395]
(n)长度为6个氨基酸至20个氨基酸；
[0396]
(o)长度为7个氨基酸至40个氨基酸；
[0397]
(p)长度为7个氨基酸至35个氨基酸；
[0398]
(q)长度为7个氨基酸至30个氨基酸；
[0399]
(r)长度为7个氨基酸至25个氨基酸；
[0400]
(s)长度为7个氨基酸至20个氨基酸；或
[0401]
(t)长度为10个氨基酸至60个氨基酸。
[0402]
15.如实施方案14或14(m)的mbm，其中该接头的长度为20个氨基酸至50个氨基酸，任选地，其中该接头长度为25至35个氨基酸。
[0403]
16.如实施方案13至15中任一项的mbm，其中该接头为或包括gns(seq id no：61)或sgn(seq id no：62)的多聚体，其中n为1至7的整数，任选地，其中该接头包括g4s(seq id no：4)的多聚体。
[0404]
17.如实施方案13至16中任一项的mbm，其中该接头为或包括两个连续的甘氨酸(2gly)、三个连续的甘氨酸(3gly)、四个连续的甘氨酸(4gly(seq id no：5))、五个连续的甘氨酸(5gly(seq id no：6))、六个连续的甘氨酸(6gly(seq id no：7))、七个连续的甘氨酸(7gly(seq id no：8))、八个连续的甘氨酸(8gly(seq id no：9))或九个连续的甘氨酸(9gly(seq id no：10))。
[0405]
18.如实施方案13至17中任一项的mbm，其包含
[0406]
(a)gns(seq id no：61)或sgn(seq id no：62)的多聚体(例如，g4s(seq id no：4)的多聚体，其中n为1至7的整数，例如其包含g4s(seq id no：4)的多聚体；及
[0407]
(b)一个或多个另外的甘氨酸，例如两个连续的甘氨酸(2gly)、三个连续的甘氨酸(3gly)、四个连续的甘氨酸(4gly(seq id no：5))、五个连续的甘氨酸(5gly(seq id no：6))、六个连续的甘氨酸(6gly(seq id no：7))、七个连续的甘氨酸(7gly(seq id no：8))、八个连续的甘氨酸(8gly(seq id no：9))或九个连续的甘氨酸(9gly(seq id no：10))。
[0408]
19.如实施方案1至18中任一项的mbm，其中abs1、abs2和abs3中的至少一个与膜结合抗原特异性结合。
[0409]
20.如实施方案1至19中任一项的mbm，其中abs1和abs3与相同细胞上的膜结合抗原特异性结合。
[0410]
21.如实施方案1至20中任一项的mbm，其为三特异性结合分子(“tbm”)。
[0411]
22.如实施方案1至21中任一项的mbm，其中该第一轻链和该第二轻链为通用轻链。
[0412]
23.如实施方案1至22中任一项的mbm，其中该第一fab或第二fab的轻链恒定区和第一重链恒定区(ch1)为crossmab排列。
[0413]
24.如实施方案1至23中任一项的mbm，其包含fc异二聚体。
[0414]
25.如实施方案24的mbm，其中该fc异二聚体中的fc结构域相较于野生型fc结构域包含杵臼突变。
[0415]
26.如实施方案24或实施方案25的mbm，其中该fc异二聚体中的至少一个fc结构域相较于野生型fc结构域包含星形突变。
[0416]
27.如实施方案1至26中任一项的mbm，其为三价mbm。
[0417]
28.如实施方案1至27中任一项的mbm，其中abs3与人klothoβ(“klb”)特异性结合。
[0418]
29.如实施方案28的mbm，其中abs3包含抗-klb抗体的cdr序列，例如表2a至2b中所述的任一klb结合剂的cdr序列。
[0419]
30.如实施方案29的mbm，其中abs3包含抗-klb抗体的vh和/或v
l
序列，例如表2a至2b中所述的任一klb结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0420]
31.如实施方案1至30中任一项的mbm，其中abs1与人klb特异性结合。
[0421]
32.如实施方案31的mbm，其中abs1包含抗-klb抗体的cdr序列，例如表2a至2b中所述的任一klb结合剂的cdr序列。
[0422]
33.如实施方案32的mbm，其中abs1包含抗-klb抗体的vh和/或v
l
序列，例如表2a至2b中所述的任一klb结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0423]
34.如实施方案1至33中任一项的mbm，其中abs1和abs3与人klb上的不同表位特异性结合。
[0424]
35.如实施方案34的mbm，其中abs1和abs3能同时与人klb上的它们各自的表位特异性结合。
[0425]
36.如实施方案1至35中任一项的mbm，其中abs2与人纤维母细胞生长因子受体同种型(“fgfr1c”)特异性结合。
[0426]
37.如实施方案36的mbm，其中abs2包含抗-fgfr1c抗体的cdr序列，例如表3a至3b中所述的任一fgfr1c结合剂的cdr序列。
[0427]
38.如实施方案37的mbm，其中abs2包含抗-fgfr1c抗体的vh和/或v
l
序列，例如表3a至3b中所述的任一fgfr1c结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0428]
39.如实施方案36至38中任一项的mbm，其中abs2与fgfr1c的d3环结合。
[0429]
40.如实施方案36至83中任一项的mbm，其中abs2与fgfr1c的d2环结合。
[0430]
41.如实施方案1至27中任一项的mbm，其中abs2与人纤维母细胞生长因子受体3(“fgfr3”)特异性结合。
[0431]
42.如实施方案41的mbm，其中abs2包含抗-fgfr3抗体的cdr序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的cdr序列。
[0432]
43.如实施方案42的mbm，其中abs2包含抗-fgfr3抗体的vh和/或v
l
序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0433]
44.如实施方案1至27或41至43中任一项的mbm，其中abs3与人fgfr3特异性结合。
[0434]
45.如实施方案44的mbm，其中abs3包含抗-fgfr3抗体的cdr序列，例如表4中所述
的任一fgfr3结合剂的cdr序列。
[0435]
46.如实施方案45的mbm，其中abs3包含抗-fgfr3抗体的vh和/或v
l
序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0436]
47.如实施方案1至27中任一项的mbm，其中abs2和abs3与人fgfr3特异性结合。
[0437]
48.如实施方案47的mbm，其中abs2包含抗-fgfr3抗体的cdr序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的cdr序列。
[0438]
49.如实施方案48的mbm，其中abs2包含抗-fgfr3抗体的vh和/或v
l
序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0439]
50.如实施方案47至49中任一项的mbm，其中abs3包含抗-fgfr3抗体的cdr序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的cdr序列。
[0440]
51.如实施方案50的mbm，其中abs3包含抗-fgfr3抗体的vh和/或v
l
序列，例如表4中所述的任一fgfr3结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0441]
52.如实施方案47至51中任一项的mbm，其中abs2和abs3与人fgfr3上的相同表位特异性结合。
[0442]
53.如实施方案52的mbm，其中abs2和abs3包含相同的cdr序列。
[0443]
54.如实施方案53的mbm，其中abs2和abs3包含相同的vh和v
l
序列。
[0444]
55.如实施方案41至54中任一项的mbm，其中abs1与人cd63特异性结合。
[0445]
56.如实施方案55的mbm，其中abs1包含抗-cd63抗体的cdr序列，例如表6中所述的任一cd63结合剂的cdr序列。
[0446]
57.如实施方案56的mbm，其中abs1包含抗-cd63抗体的vh和/或v
l
序列，例如表6中所述的任一cd63结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0447]
58.如实施方案41至54中任一项的mbm，其中abs1与人淀粉样蛋白前体样蛋白2(aplp2)特异性结合。
[0448]
59.如实施方案58的mbm，其中abs1包含抗-aplp2抗体的cdr序列，例如表5中所述的任一aplp2结合剂的cdr序列。
[0449]
60.如实施方案59的mbm，其中abs1包含抗-aplp2抗体的vh和/或v
l
序列，例如表5中所述的任一aplp2结合剂的vh和/或v
l
序列。
[0450]
61.一种缀合物，其系包括如实施方案1至27中任一项的mbm和一细胞毒剂或细胞生长抑制剂。
[0451]
62.一种药物组合物，其包括如实施方案1至27中任一项的mbm或如实施方案61的缀合物和赋形剂。
[0452]
63.一种治疗癌症的方法，该方法包括对患有癌症的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0453]
64.如实施方案63的方法，其中该癌症与表达abs1、abs2和/或abs3特异性结合的靶分子相关。
[0454]
65.如实施方案63或如实施方案64的方法，其中该mbm为根据实施方案41至60中任一项的mbm，该缀合物包含根据实施方案41至60中任一项的mbm，或该药物组合物包含根据实施方案41至60中任一项的mbm或包含根据实施方案41至60中任一项的mbm的缀合物。
[0455]
66.如实施方案63至65中任一项的方法，其中该癌症为膀胱癌。
[0456]
67.如实施方案63至65中任一项的方法，其中该癌症为胶质母细胞瘤。
[0457]
68.如实施方案63至65中任一项的方法，其中该癌症为鳞状细胞肺癌。
[0458]
69.一种治疗非酒精性脂肪性肝炎(“nash”)的方法，该方法包括对患有nash的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0459]
70.一种治疗代谢性疾病的方法，该方法包括对患有代谢性疾病的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0460]
71.一种降低循环hdl胆固醇的方法，该方法包括对具有升高的hdl胆固醇水平的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0461]
72.一种增加循环ldl胆固醇的方法，该方法包括对具有低ldl胆固醇水平的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0462]
73.一种降低血液甘油三酯的方法，该方法包括对具有升高的甘油三酯水平的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0463]
74.一种降低血糖的方法，该方法包括对具有升高的血糖水平的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0464]
75.一种治疗肥胖症的方法，该方法包括对患有肥胖症的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0465]
76.一种治疗糖尿病的方法，该方法包括对患有糖尿病的受试者施用有效量的如实施方案1至27中任一项的mbm、如实施方案61的缀合物、或如实施方案62的药物组合物。
[0466]
77.如实施方案69至76中任一项的方法，其中该mbm为根据实施方案28至40中任一项的mbm，该缀合物包含根据实施方案28至40中任一项的mbm，或该药物组合物包含根据实施方案28至40中任一项的mbm或包含根据实施方案28至40中任一项的mbm的缀合物。
[0467]
78.一种或多种核酸，其编码如实施方案1至60中任一项的mbm。
[0468]
79.一种细胞，其经工程化以表达如实施方案1至60中任一项的mbm。
[0469]
80.一种以一个或多个表达载体转染的细胞，该表达载体包括一个或多个编码如实施方案1至60中任一项的mbm的核酸序列，该核酸序列在一个或多个启动子的控制下。
[0470]
81.一种产生mbm的方法，该方法包括：
[0471]
(a)在表达该mbm的条件下培养如实施方案79或80的细胞；及
[0472]
(b)从细胞培养物中回收该mbm。
[0473]
82.如实施方案81的方法，其进一步包括富集该mbm。
[0474]
83.如实施方案81或实施方案82的方法，其进一步包括纯化该mbm。
[0475]
9.参考文献的引用
[0476]
本技术中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件就所有目的通过整体引用并入本发明，其引用程度等同于将单独提及的各单独出版物、专利或专利申请或其他
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