一种双嘧达莫杂质定位溶液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及一种双嘧达莫杂质定位溶液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.双嘧达莫(化学结构式见式1)主要利用其抗血小板聚集作用以预防血栓形成。与阿司匹林联合用于短暂性脑缺血发作(tia)和缺血性脑卒中患者的二级预防及冠心病的治疗；与华法林合用预防瓣膜置换术后血栓形成。
3.静脉注射剂利用其血管扩张作用，可用作心肌缺血的诊断试剂(双嘧达莫试验)，作为冠心病的一种辅助检查手段，并确定心肌缺血范围。
[0004][0005]
双嘧达莫的主要合成路线(如下所示)：经由四氯化物(2,4,6,8-四氯嘧啶并[5,4-d]嘧啶)与哌啶缩合生成二氯化物(2,6-二氯-4,8-二(哌啶-1-基)嘧啶并[5,4-d]嘧啶)，二氯化物与二乙醇胺缩合生成双嘧达莫。
[0006][0007]
上述双嘧达莫的合成路线中出现了7种杂质，而关于双嘧达莫杂质的控制方法，中国药典(以下简称chp2020)、欧洲药典(以下简称ep10.4)、美国药典(以下简称usp-nf2021)
均有收载。chp2020、ep10.4、usp-nf2021均使用液相色谱法测定杂质的含量，其中杂质的定位方式、限度要求及对照品的获取方式等信息见表1。
[0008]
表1双嘧达莫相关杂质的概况
[0009][0010]
从表1可知，ep10.4与usp-nf2021对已知杂质b与杂质d的限度进行了控制，但是美国药典的杂质对照品购买周期长、价格高昂，导致购买困难；欧洲药典的杂质对照品购买周期长，所含的杂质较多，仅适用在欧洲药典的检测方法下才能鉴别出各个峰，不利于新方法的开发应用。chp2020未进行控制，究其原因：1、中国食品药品检定研究院没有相关杂质的对照品；2、无对应的杂质b与杂质d的定位方法。
[0011]
综上所述，有必要提供一种含有双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的定位溶液。


技术实现要素：

[0012]
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种双嘧达莫杂质定位溶液。
[0013]
本发明还提供了一种双嘧达莫杂质定位溶液的制备方法。
[0014]
本发明还提供了一种双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的定位检测方法。
[0015]
本发明的第一方面提供了一种双嘧达莫杂质定位溶液，包括如下步骤：
[0016]
将双嘧达莫与二乙醇胺在碱性催化剂的条件下进行反应即得定位溶液；所述定位溶液为包括双嘧达莫杂质b、双嘧达莫杂质d和双嘧达莫的混合溶液，所述双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的摩尔浓度比为1：(2～10)。
[0017]
本发明关于双嘧达莫杂质定位溶液的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
[0018]
本发明的定位溶液可以用于同时检测双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d，减少了对对照品的依赖，弥补了中国食品药品检定研究院暂无双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d对照品出售的缺陷。另外，本发明的制备方法简单，起始原料容易获取，本发明限定了双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的摩尔浓度比为1：(2～10)。利用定位溶液中的双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的摩尔浓度的差异，在液相色谱中利用峰面积大小定位双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d，且可以不用限制特定的色谱条件即可分辨。
[0019]
根据本发明的一些实施方式，以双嘧达莫的浓度计，将所述混合溶液采用溶剂稀释至6μg/ml～2mg/ml。
[0020]
根据本发明的一些实施方式，所述溶剂为有机溶剂或含有有机溶剂的水溶液。
[0021]
根据本发明的一些实施方式，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇或乙腈中的至少一种。
[0022]
根据本发明的一些实施方式，所述双嘧达莫的cas编号为58-32-2。
[0023]
根据本发明的一些实施方式，所述双嘧达莫杂质b的cas编号为16908-47-7。
[0024]
根据本发明的一些实施方式，所述双嘧达莫杂质d的cas编号为1176886-12-6。
[0025]
本发明的第二方面提供一种双嘧达莫杂质定位溶液的制备方法，包括如下步骤：
[0026]
将双嘧达莫与二乙醇胺在碱性催化剂的条件下进行反应即得定位溶液；所述定位溶液中包括双嘧达莫杂质b、双嘧达莫杂质d和双嘧达莫的混合溶液；反应温度为80～220℃。
[0027]
根据本发明的一些实施方式，所述双嘧达莫与二乙醇胺的摩尔比为1:(3.9～7.7)。
[0028]
根据本发明的一些实施方式，所述碱性催化剂包括氢氧化钠、碳酸钠、叔丁醇钠或叔丁醇钾中的至少一种。
[0029]
根据本发明的一些实施方式，所述反应温度为145℃～155℃。
[0030]
根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为1.5h～2.5h。
[0031]
根据本发明的一些实施方式，所述碱性催化剂是双嘧达莫用量的20mol％～30mol％。
[0032]
本发明的第三方面提供一种双嘧达莫杂质b和双嘧达莫杂质d的定位检测方法，包括如下步骤：
[0033]
供试品溶液：将双嘧达莫原料药加入有机溶剂溶解；
[0034]
定位溶液：取上述所述的定位溶液；
[0035]
液相色谱条件包括如下参数：
[0036]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；规格：4.0mm
×
100mm，5μm；
[0037]
流动相选自磷酸二氢钾溶液和甲醇的混合溶液、甲酸铵或乙腈的混合溶液；
[0038]
检测波长：295nm；柱温为45℃；
[0039]
将所述定位溶液、所述供试品溶液按照所述的液相色谱条件分别进行液相色谱分析，通过所述定位溶液对供试品溶液定位检测。
附图说明
[0040]
图1是对照品溶液色谱图；
[0041]
图2是本发明实施例1的定位溶液色谱图；
[0042]
图3是供试品溶液色谱图；
[0043]
图4是空白溶液色谱图；
[0044]
图5是对照品溶液在200nm～400nm波长下的dad(二极管阵列检测器；diode array detector)光谱图；其中左图为双嘧达莫杂质b的dad光谱图；右图为双嘧达莫杂质d的dad光谱图；
[0045]
图6是本发明实施例1的定位溶液在200nm～400nm波长下的dad光谱图；其中左图为双嘧达莫杂质b的dad光谱图；右图为双嘧达莫杂质d的dad光谱图；
[0046]
图7是本发明实验例2中的杂质b对照品溶液色谱图；
[0047]
图8是本发明实验例2中的杂质d对照品溶液色谱图；
[0048]
图9是本发明实验例2中的定位溶液色谱图；
[0049]
图10是本发明实验例2中的供试品溶液色谱图；
[0050]
图11是本发明实验例2中的空白溶液色谱图；
[0051]
图12是本发明实验例2中的杂质b与杂质d对照品溶液在200nm～400nm波长下的dad光谱图；其中左图为双嘧达莫杂质b的dad光谱图；右图为双嘧达莫杂质d的dad光谱图；
[0052]
图13是本发明实验例2中的定位溶液在200nm～400nm波长下的dad光谱图；其中左图为双嘧达莫杂质b的dad光谱图；右图为双嘧达莫杂质d的dad光谱图；
[0053]
图14是本发明实验例3中的杂质b对照品溶液质谱图；
[0054]
图15是本发明实验例3中的杂质b定位溶液质谱图；
[0055]
图16是本发明实验例3中的杂质b供试品溶液质谱图；
[0056]
图17是本发明实验例3中的杂质d对照品溶液质谱图；
[0057]
图18是本发明实验例3中的杂质d定位溶液质谱图；
[0058]
图19是本发明实验例3中的杂质d供试品溶液质谱图。
具体实施方式
[0059]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0060]
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0061]
以下实施例及对比例中采用的原料如下：
[0062]
双嘧达莫(原料药)来源于亚宝药业集团股份有限公司、二乙醇胺(分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司、氢氧化钠(分析纯)购自广州化学试剂厂、叔丁醇钾(分析纯)购自上海麦克林生化科技有限公司。
[0063]
实施例1
[0064]
本实施例提供一种双嘧达莫杂质定位溶液，其中双嘧达莫杂质b、双嘧达莫杂质d和双嘧达莫3种组分的含量比例约为0.8:3:96，其制备方法如下：
[0065]
取二乙醇胺0.3g、双嘧达莫0.25g与5mol/l的氢氧化钠溶液25μl，置100ml圆底烧瓶中，置于150℃的磁力加热搅拌器中短暂加热，使圆底烧瓶中的二乙醇胺由稠转稀，取出圆底烧瓶轻轻旋转，使双嘧达莫浸润于二乙醇胺中，在圆底烧瓶中轻轻放入转子，安装球形冷凝管，放置于磁力加热搅拌器中回流加热。磁力转子转速为每分钟300转。2小时后取出圆底烧瓶，具塞水浴冷却至室温。加入甲醇5ml，超声使溶解，摇匀，滤过，取续滤液作为定位溶液贮备液。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例提供一种双嘧达莫杂质定位溶液，其中双嘧达莫杂质b、双嘧达莫杂质d和双嘧达莫3种组分的含量比例约为0.3:2:97.5，其制备方法与实施例1相同，其区别仅在于，本实施例用10％的叔丁醇钾的叔丁醇溶液50μl替换实施例1中的氢氧化钠。
[0068]
实验例1
[0069]
按本发明实施例1制作的定位溶液贮备液进行测试，其中双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d的浓度存在明显差异，使用高效色谱去检测时，选用合适的色谱条件与合适浓度的
定位溶液，理论上色谱图会显示1小1大2个可明显区分的杂质峰，峰面积较小者为双嘧达莫杂质b，峰面积较大者为双嘧达莫杂质d，由此可确定这2种杂质峰的保留时间。根据此特性，在使用液相色谱法检测双嘧达莫原料药及相关制剂的杂质b或杂质d时，可采用本发明制作的定位溶液替代相关的对照品。
[0070]
在测定样品时，可根据定位溶液中双嘧达莫杂质b峰与双嘧达莫杂质d峰的保留时间，去确定供试品溶液中的这2种杂质的出峰位置，结合自身对照法可对样品中的这2种杂质进行定量，由此达到不使用对照品便可准确定位杂质的目的。
[0071]
具体实施方法如下：
[0072]
供试品溶液：取双嘧达莫10mg，精密称定，置5ml量瓶中，加甲醇适量，使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0073]
定位溶液：按本发明实施例1制备的双嘧达莫杂质定位溶液贮备液，精密量取贮备液1ml置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0074]
对照品溶液：取ep10.4的混合峰鉴别对照品1瓶(每瓶2mg)加甲醇1ml，摇匀，即得。
[0075]
空白溶液：取二乙醇胺约0.3g，精密称定，置5ml量瓶中，加5mol/l的氢氧化钠溶液25μl，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0076]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(品牌：岛津；型号：inertsustain aq-c18；规格：4.0mm
×
100mm，5μm)；以0.1％磷酸二氢钾溶液(用0.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至7.0)为流动相a，以甲醇为流动相b；按表2进行梯度洗脱；柱温为45℃；流速为每分钟1.2ml；uv检测波长为295nm；dad扫描的波长范围为200nm～400nm；进样体积5μl。
[0077]
表2洗脱程序
[0078][0079]
测定法：取对照品溶液、定位溶液、供试品溶液与空白溶液各5μl，注入液相色谱仪(品牌：安捷伦；型号：1290infinity ii)，记录色谱图与光谱图。
[0080]
对照品溶液色谱图见图1；定位溶液色谱图见图2；供试品溶液色谱图见图3；空白溶液色谱图见图4；对照品溶液的杂质b与杂质d的dad光谱图见图5；定位溶液的杂质b与杂质d的dad光谱图见图6。
[0081]
供试品溶液色谱图中会出现主成分峰及一些杂质峰，由于定位溶液与供试品溶液都使用相同批次的双嘧达莫原料药进行制作，所以理论上，这些峰同时亦会出现在定位溶液的色谱图上，而定位溶液的色谱图会比供试品溶液色谱图额外多出2个非常明显的色谱峰，这2个峰分别为双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d峰，结合在定位溶液中这2种杂质的浓度存在明显差异的特点，可判断峰面积小者为双嘧达莫杂质b，峰面积大者为双嘧达莫杂质d。
[0082]
对比图1～图4，定位溶液色谱图在扣除与供试品溶液、空白溶液相同的色谱峰后，与上述论述的现象基本一致，剩余的色谱峰里有2个明显的杂质峰，其保留时间与对照品溶
液色谱图双嘧达莫杂质b峰和双嘧达莫杂质d峰的保留时间一致，定位溶液与对照品溶液的dad光谱图(见图5～图6)的最大吸收波长亦一致。可见，定位溶液能对双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d准确定位。
[0083]
按本发明制作双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d的定位溶液贮备液共6份，每份贮备液按上述定位溶液配制方法稀释，按上述测定法测定，按面积归一化法计算。经测试，6份定位溶液中双嘧达莫杂质b峰面积占总峰面积的0.5％～1.0％、双嘧达莫杂质d峰面积占总峰面积的2％～5％；且6份定位溶液中双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d峰面积均大于对照品溶液中相对应的杂质的峰面积，专属性良好。
[0084]
由上述实验例可知，定位溶液中的双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d在ep10.4的色谱条件下会显示1小1大2个杂质峰，因此可利用峰面积的大小进行清晰的区分，若按出峰顺序亦可对双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d进行区分，保留时间较短者为双嘧达莫杂质b，保留时间较长者为双嘧达莫杂质d。在以后检测双嘧达莫杂质b与双嘧达莫杂质d的工作中可不使用对照品，直接使用本定位溶液进行定位，可减少对对照品的依赖。样品中杂质的含量测定可参考ep10.4的自身对照法进行定量。
[0085]
实验例2
[0086]
实验例2的测定方法与实验例1相同，其区别在于，
[0087]
对照品溶液：取双嘧达莫杂质b与杂质d对照品各适量，精密称定，分别加甲醇稀释制成每1ml各约含0.5μg的溶液，即得。
[0088]
色谱条件不同，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(品牌：型号：xb-c18；规格：2.1mm
×
150mm，1.7μm)；以10mmol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至5.0)为流动相a，以乙腈为流动相b；按表3进行梯度洗脱；柱温为45℃；流速为每分钟0.3ml；uv检测波长为295nm；dad扫描的波长范围为200nm～400nm；进样体积2μl。
[0089]
表3洗脱程序
[0090][0091]
测定法：取对照品溶液、定位溶液、供试品溶液与空白溶液各2μl，注入液相色谱仪(品牌：安捷伦；型号：1290infinity ii)，记录色谱图与光谱图。
[0092]
对照品溶液色谱图见图7和图8；定位溶液色谱图见图9；供试品溶液色谱图见图10；空白溶液色谱图见图11；对照品溶液的杂质b与杂质d的dad光谱图见图12；定位溶液的杂质b与杂质d的dad光谱图见图13。
[0093]
对比图7～图11，定位溶液色谱图中扣除与供试品溶液、空白溶液相同的色谱峰后，与上述论述的现象基本一致，剩余的色谱峰里有2个明显的杂质峰，其保留时间与对照品溶液色谱图杂质b峰和杂质d峰的保留时间一致，定位溶液与对照品溶液的dad光谱图(见图12～图13)的最大吸收波长亦一致。可见，定位溶液在不同的色谱条件下也能对杂质b与杂质d准确定位。
[0094]
实验例3
[0095]
本发明制备的定位溶液还可以用于质谱仪进行定性分析样品是否存在杂质。使用超高效液相色谱串联高分辨质谱联用仪，具体步骤如下：
[0096]
供试品溶液：分别取杂质b与杂质d粗品各适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释制成每1ml各约含200ng的溶液，滤过，取续滤液，分别作为杂质b供试品溶液与杂质d供试品溶液。
[0097]
定位溶液：按本发明实施例1制作杂质b与杂质d的定位溶液贮备液。精密量取贮备液0.1ml置200ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为杂质b定位溶液；精密量取杂质b定位溶液5ml置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为杂质d定位溶液。
[0098]
对照品溶液：分别取杂质b与杂质d对照品各适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释制成每1ml各约含100ng的溶液，滤过，取续滤液，即得。
[0099]
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(品牌：型号：xb-c18；规格：2.1mm
×
150mm，1.7μm)；以10mmol/l甲酸铵溶液(用甲酸调节ph值至5.0)为流动相a，以乙腈为流动相b；按表4进行梯度洗脱；柱温为45℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长为295nm；进样体积2μl。
[0100]
表4洗脱程序
[0101][0102]
质谱条件：采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(品牌：赛默飞；型号：q exactive)测定。采用电喷雾离子源(esi)，使用正离子扫描模式。离子源参数见表5。
[0103]
表5离子源参数
[0104][0105]
监测模式为一级全扫(full scan)。各组分在质谱中的采集时间见表6。
[0106]
表6各组分采集时间
[0107][0108]
测定法：分别取对照品溶液、定位溶液与供试品溶液各2μl，分别注入超高效液相色谱串联高分辨质谱联用仪，记录质谱图。
[0109]
杂质b对照品溶液质谱图见图14，杂质b定位溶液质谱图见图15，杂质b供试品溶液质谱图见图16。
[0110]
杂质b的分子离子峰的[m h]

的精确分子量为525.3144。理论上，定位溶液与对照品溶液测得的杂质b的分子离子峰的[m h]

与525.3144比较，应一致，且峰的保留时间亦应一致。
[0111]
对比图14～图15，定位溶液与对照品溶液测得的杂质b的分子离子峰的[m h]

与525.3144比较，均一致，且两者的杂质b峰的保留时间均一致。可见定位溶液能有效定位并鉴别出杂质b。
[0112]
同理，供试品溶液中若存在杂质b，应与定位溶液在相同的保留时间出峰，且杂质b的分子离子峰的[m h]

亦一致。
[0113]
对比图15～图16，均符合上述推论，两图的分子离子峰的[m h]

与保留时间均一致。因此，可为供试品中存在杂质b成份提供佐证。
[0114]
杂质d对照品溶液质谱图见图17，杂质d定位溶液质谱图见图18，杂质d供试品溶液质谱图见图19。
[0115]
杂质d的鉴别方法与杂质b同理，杂质d的分子离子峰的[m h]

的精确分子量为461.2983。
[0116]
对比图17～图18，定位溶液与对照品溶液测得的杂质d的分子离子峰的[m h]

与461.2983比较，均一致，且两者的杂质d峰的保留时间均一致。可见定位溶液能有效定位并鉴别出杂质d。
[0117]
对比图18～图19，定位溶液质谱图与供试品溶液质谱图中的分子离子峰的[m h]

与保留时间均一致。因此，可为供试品中存在杂质d成份提供佐证。
[0118]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。