一种人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法

1.本发明涉及一种人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子磁微粒化学发光免疫定量检测试剂 盒及其检测方法，属于免疫检测分析领域，尤其是化学发光检测领域。


背景技术：

2.冠状病毒的感染性主要决定于s蛋白，s蛋白可与宿主细胞膜上的膜受体结合。从而 介导病毒和细胞膜融合。sars-cov-2感染的第一个关键蛋白-ace2。除了ace2外，近期 陈志南院士研究团队通过表面等离子体共振分析，并同时辅以竞争性抑制实验发现cd147 可作为除ace2之外，sars-cov-2入侵宿主细胞另一条新的潜在途径，并进一步证实s 蛋白与cd147结合后，病毒对宿主细胞对侵袭能力增强。以上可以说明，sars-cov-2的 s蛋白通过与宿主细胞上的cd147结合，介导病毒对入侵。
3.cd147，又名basigin或emmprin，是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。cd147 在多种肿瘤细胞和组织中高表达，通过诱导基质金属蛋白酶的分泌促进肿瘤浸润及转移。 有研究表明，cd147还与疟原虫的侵袭和病毒的感染有关。
4.cd147对促进sars-cov-2对宿主细胞的侵袭发挥了重要的作用，而目前对控制 sars-cov-2的传播和治疗尚无有效办法，各国都在寻找治疗剂并开发疫苗。针对cd147 这一新途径的发现，为抗病毒药物的开发开启了新思路。ace2作为sars-cov-2感染的第 一个关键蛋白，但由于其广泛分布于各种组织，如：心脏、肺、肾、睾丸等，并在控制血 压，肺损伤，预防心力衰竭和肾损伤等方面有重要作用。但，如果以ace2作为治疗靶点， 可能会引起严重的副作用。因此，以cd147为治疗靶点的研究可能更具前景，关于cd147 的检测试剂盒也亟待开发。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以化学发光免疫定量检测技术为基础， 获得一种细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)的化学发光免疫定量检测试剂盒及其检 测方法。
6.为实现上述发明目的之一，本发明采用的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的化学发光 免疫定量检测试剂盒的技术方案如下：
7.所述试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金 属蛋白酶诱导因子cd147单克隆抗体、生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 cd147单克隆抗体，所述试剂盒将待测样本的抗原与生物素标记的cd147单抗、碱性磷酸酶 标记的cd147单抗耦连形成复合物，向复合物加入酶促化学发光底物后，形成发光反应检 测发光强度，以检测待测样本中的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子浓度。
8.优选的，所述试剂盒还包括人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子cd147校准品，校准品 也与生物素标记的cd147单抗、碱性磷酸酶标记的cd147单抗耦连形成复合物，发光检测
待 测样本中的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子浓度。
9.优选的，链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液为超顺磁性纳米微粒，粒径为10～20nm，粒 径小于30nm的超顺磁性纳米颗粒具有大的磁矩常量，可忽略剩磁和矫顽力，能够对应用的 磁场做出快速的响应。
10.优选的，所述cd147抗体是his标记的重组蛋白，蛋白序列如如序列表seq id no.1所 示。重组蛋白经大肠杆菌表达，46.3kd。
11.优选的，碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子cd147单克隆抗体为母 液稀释液，稀释比例为1:300～500。其中碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因 子cd147单克隆抗体母液的检测方法为：将200ug碱性磷酸酶加入1ml10mm碳酸钠缓冲液 中，加入20ug人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗体，37℃反应2小时后，用proteing 亲和柱纯化酶标抗体，得到酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗体。
12.优选的，生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子cd147单克隆抗体为母液稀 释液，稀释比例为1:700～1000。其中生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子cd147 单克隆抗体为母液的检测方法为：将20ug人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗体加 入1ml10mm碳酸钠缓冲液中，加入20ug生物素衍生物，37℃反应2小时后，用proteing亲 和柱纯化生物素标记抗体，得到生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗 体。
13.上述1ml10mm碳酸钠缓冲液ph为8.0。
14.所述将链霉亲和素包被的磁微粒母液用酶标磁微粒缓冲液稀释浓度为0.6mg/ml。
15.所述校准品用校准品缓冲液将人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)抗原稀释至 工作浓度，分别为0，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00ng/ml。
16.本发明还提供了一种人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子磁微粒化学发光免疫定量检测 试剂盒的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
17.a)加样孵育：取校准品或待测样本至反应管中，依次加入等体积的碱性磷酸酶标记的 人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子单克隆抗体和生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱 导因子单克隆抗体，37℃孵育反应10分钟；然后加入链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液；
18.b)磁分离清洗：孵育反应完成后的反应管放在磁分离架上静置1分钟，去上清后加入 磁珠包被物缓冲液，缓冲液加入量大于反应管内液体总量，放在磁分离架上静置1分钟，去 上清后再次加入磁珠包被物缓冲液冲洗，反复冲洗至少三次；
19.c)发光：向冲洗后的液体沉淀部分中加入发光底物液，37℃避光孵育5分钟后，测量 发光值。
20.具体的，所述检测方法包括具体为：
21.1)加样和孵育：加入人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)校准品或新鲜病人样 本至反应管中，加入碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147) 抗体和生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)抗体，37℃孵育反 应8～15分钟，加入链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液，37℃孵育反应10分钟；
22.2)磁分离清洗：将孵育反应完成后的反应管放在磁分离架上静置1分钟，除去上清
液； 第一次加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液； 第二次加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液； 第三次加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液；
23.3)发光：向步骤b)中的沉淀物中加入发光底物液，37℃避光孵育5分钟后，用化学发 光仪测量发光值。
24.当标准品检测时，将标准品稀释为浓度梯度检测，通过检测结果绘制标准曲线，标准曲 线公式为y＝1.0606x-0.184。
25.本发明使用超顺磁材料不同于常规技术合成的磁微粒，常规技术采用的磁微粒粒径一般 为1～3um不等，此种粒径磁微粒比表面积较小，检测分辨灵敏度不高。与现有技术不同的 是，本发明采用的磁微粒为超顺磁性纳米材料制成，粒径为10～20nm；粒径小于30nm的 超顺磁性纳米颗粒具有大的磁矩常量，可忽略剩磁和矫顽力，能够对应用的磁场做出快速 的响应；同时比表面积大，容易分散，可以提高检测单个抗原分子的能力，提高试剂盒的 线性范围和检测灵敏度。
26.与现有技术相比，本发明的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)试剂盒以磁微粒作 为免疫反应的固相，利用化学发光免疫分析方法与化学发光类测定仪配合，用于测定人体 咽喉分泌物、血清/血浆中的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)含量，避免了酶联免 疫试剂盒存在的线性范围窄、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低、稳定性差、成本高等 缺陷。该试剂盒弥补了目前市面上暂无细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)化学发光试 剂盒的空缺，与目前专用于科研的elisa试剂盒相比，检测范围宽，具有更好的重复性和 灵敏度，价格低廉，检测速度快。
附图说明
27.图1是本发明提供的检测试剂盒的检测原理及流程图；
28.图2是本发明提供的cd147电泳验证图；
29.图3是本发明的标准曲线图。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明提供的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的化学发光免疫定量 检测试剂盒及其检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
31.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验 材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
32.实施例1、试剂盒的制备
33.本发明的以磁微粒作为免疫反应的固相，利用化学发光免疫分析方法与化学发光类测 定仪配合，用于测定人体体样本中的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子含量。试剂盒包括 链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液、碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (cd147)单克隆抗体(简称酶标单抗)、生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (cd147)单克隆抗体(简称生物素标记单抗)、人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147) 校准品等。本发明涉及的试剂盒以磁微粒作为免疫反应的固相，利用化学发光免
疫分析方 法与化学发光类测定仪配合，用于测定人体血清/血浆中的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因 子(cd147)含量。反应的技术原理为：如图1所示，待测样本或校准品的人细胞外基质金属 蛋白酶诱导因子(cd147)中的抗原与生物素标记单抗、碱标单抗结合形成复合物，所述复合 物为生物素标记单抗-抗原-酶标单抗复合物；随后向所述复合物中加入链霉亲和素包被的磁 微粒，通过链霉亲和素与生物素结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直 接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质分离。清洗沉淀的复合物，加入酶 促化学发光底物，底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中 间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，利用发光仪测定反应的发光强度。在测定范 围内，发光强度与样本中的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)浓度成正比，使用改 良的四参数logistic方程拟合可定量测算出待测样本中人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (cd147)浓度。
34.本技术的cd147抗体为重组蛋白，蛋白质量为46.3kd，蛋白序列(seq id no.1)如 下：
35.masmtdqqaearaflseemiaefkaafdmwdadgggdistkelgtvmrmlgqnp tkeeldaiieevdedgsgtidfeeflvmmvrqmkedakgkseeelancfrifdknadgfi dieelgeilratgehvieediedlmkdsdknndgridfdeflkmmegelgeaheaeevhe eahheeahhaeahheeahahaeevhepeeapeeeekpringsepgtvfttvedlgskill tcslndsatevtghrwlkggvvlkedalpgqktefkvdsddqwgeyscvflpepmgta niqlhgpprvkavkssehinegetamlvcksesvppvtdwawykitdsedkalmngsesr ffvsssqgrselhienlnmeadpgqyrcngtsskgsdqaiitlrvrshlaklaaalehhh hhh
36.本发明中的cd147蛋白序列由大肠杆菌表达，表达后经琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果如图2所示，图中cd147蛋白条带与蛋白marker相比，可以看出蛋白片段大小正确。
37.1.试剂盒的制备过程如下：
38.(1)酶标磁微粒缓冲液制备：
39.物料用量三羟甲基氨基甲烷2.42g氯化钠9.00gtween-200.50g牛血清白蛋白50.00gproclin3001.00g
40.将上述物料加入1000ml去离子水中，充分搅拌溶解，调节ph至8.00
±
0.10。
41.(2)酶标记物缓冲液制备：
42.物料用量三羟甲基氨基甲烷2.42g氯化钠18.00gtween-201.00g牛血清白蛋白100.00gproclin3001.00g
43.将上述物料加入1000ml去离子水中，充分搅拌溶解，调节ph至8.00
±
0.10。
44.(3)生物素标记物缓冲液制备：
45.物料用量三羟甲基氨基甲烷2.42g氯化钠9.00gtween-201.00g牛血清白蛋白50.00gproclin3001.00g
46.将上述物料加入1000ml去离子水中，充分搅拌溶解，调节ph至8.00
±
0.10。
47.(4)校准品缓冲液制备：
48.物料用量三羟甲基氨基甲烷2.42g氯化钠36.00gtween-201.00g胎牛血清100mlproclin3001.00g
49.将上述物料加入1000ml去离子水中，充分搅拌溶解，调节ph至7.40
±
0.10。
50.(5)链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液检测方法：
51.将链霉亲和素包被的磁微粒母液(采购于南京盘古基因纳米科技有限公司)用酶标磁 微粒缓冲液稀释浓度为0.6mg/ml。
52.(6)碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)单克隆抗体检测方 法：
53.将200ug碱性磷酸酶加入1ml10mm碳酸钠缓冲液(ph8.0)中，加入20ug人细胞外基 质金属蛋白酶诱导因子(cd147)单克隆抗体(采购于深圳雅为公司)，37℃反应2小时后， 用proteing亲和柱(ge公司)纯化酶标抗体，得到酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导 因子(cd147)单克隆抗体。稀释于酶标记物缓冲液中，稀释比例为1:400。
54.(7)生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)单克隆抗体检测方法：
55.将20ug人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)单克隆抗体(小鼠，单克隆，采购 于abcam公司)加入1ml10mm碳酸钠缓冲液(ph8.0)中，加入20ug生物素衍生物，37℃ 反应2小时后，用proteing亲和柱(ge公司)纯化生物素标记抗体，得到生物素标记的人 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)单克隆抗体。稀释于生物素标记物缓冲液中，稀释 比例为1:800。
56.(8)人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)校准品的检测方法：
57.用校准品缓冲液将人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)抗原稀释至工作浓度，分 别为0，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00ng/ml。
58.(9)组装：将上述试剂组分组装成盒，于2～8℃条件下保存。
59.实施例2、试剂盒的测试方法
60.(1)加样和孵育过程：吸取人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)校准品或新鲜 病人样本50ul加入反应管中，然后加入碱性磷酸酶标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因 子(cd147)单克隆抗体50ul和生物素标记的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子
(cd147)单 克隆抗体50ul，37℃孵育反应10分钟；然后加入链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液50ul， 37℃孵育反应10分钟；
61.(2)磁分离清洗过程：将孵育反应完成后的反应管放在磁分离架上静置1分钟，除去 上清液；第一次加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液； 第二次加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液；第三次 加入磁珠包被物缓冲液300ul，放在磁分离架上静置1分钟，除去上清液；
62.(3)发光过程：加入lumi-phos 530底物液(采购于美国lumigen公司)200ul，37℃ 避光孵育5分钟后，用滨松9507半自动化学发光仪测量发光值。
63.实施例3、试剂盒的性能测试结果。
64.试剂盒性能评价指标：对采用该方法制备的试剂盒进行准确度、线性、精密度和稳定 性进行测定。采用蛋白校准品检测后绘制标准曲线，标准曲线如图3所示，标准曲线公式 y＝1.0606x-0.1840，同时对检测结果线性情况进行评价，检测结果如下表所示：
65.1.准确度检测结果
[0066][0067]
2.线性检测结果
[0068][0069]
3.精密度检测结果
[0070]
重复次数低值样本10.4920.5030.5040.5150.52
60.5170.5280.5290.49100.51平均值0.51变异系数cv2.38％
[0071]
4.稳定性检测结果
[0072][0073]
5.灵敏度检测结果
[0074][0075]
由上述检测结果及分析可知，本发明的试剂盒检测结果线性宽，灵敏度高，重复性好， 其结果均具有统计学意义。
[0076]
采用本发明的检测试剂盒与市售的elisa试剂盒进行比较，测定结果如下表：
[0077][0078][0079]
由以上的结果可以看出：本发明涉及的试剂盒与elisa试剂盒相比，性能测试结果更 优，本发明的人细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(cd147)磁微粒化学发光免疫定量检测试剂 盒具有很好的适用性和先进性。
[0080]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说 明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出 的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
[0081]
[0082]
[0083]