一种套细胞淋巴瘤预后风险评估模型及其构建方法和应用

1.本发明属于疾病预后评估和和分子生物学技术领域，具体涉及一种套细胞淋巴瘤预后风险评估模型及其构建方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,mcl)是一种成熟的b细胞淋巴样肿瘤，占非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma,nhl)的6-8％。作为一种通常在晚期被诊断出的疾病，大多数mcl患者的病情进展呈侵袭性，预后较差。因此，与其他成熟b细胞淋巴瘤不同，mcl的治疗方案更为积极。此外，mcl通常携带涉及细胞周期、dna损伤和细胞存活的遗传分子变化。然而，具有不良预后变异的患者在新的靶向治疗后表现出较差的结局。因此，找到用于mcl预后评估和治疗的有效分子是很重要的。
4.配对盒蛋白5(paired-box 5，pax5)已被证明是一种必需的转录因子，它在癌症发展和免疫中起着至关重要的作用。先前的研究表明，pax5在多种类型的人类肿瘤中异常表达，例如乳腺癌、胃癌和肺癌。此外，pax5通过调节atg5激活idh1-as1，促进前列腺癌的肿瘤生长。pax5促进psma3-as1的转录，提高lamc1表达，从而促进胆管癌进展。pax5基因在淋巴瘤中可能的致癌活性仍然存在争议。由pax5缺陷引起的pten表达增加会损害滤泡b细胞中的pi3k/akt信号通路。其单倍体不足可导致cd8

t细胞功能障碍或衰竭。然而，pax5改变与mcl患者的预后之间的联系尚不明确。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估模型及其构建方法和应用。本发明通过研究发现，pax5和脾肿大是独立的套细胞淋巴瘤预后因素，并结合套细胞淋巴瘤国际预后指数(mantle cell lymphoma international prognostic index,mipi)评分构建了一个新的套细胞淋巴瘤预后风险评估模型，其有效优化了风险分层并促进了套细胞淋巴瘤患者的预后评估，因此具有良好的实际应用之价值。
6.具体的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的第一个方面，提供一种套细胞淋巴瘤预后生物标志物，所述生物标志物至少包括pax5和/或脾肿大。
8.经试验验证，脾肿大和pax5阳性是套细胞淋巴瘤独立的预后因素，其与mcl患者的较短总生存期(overall survival,os)相关。
9.本发明的第二个方面，提供检测套细胞淋巴瘤预后生物标志物的物质在制备套细胞淋巴瘤预后评估产品中的应用。
10.本发明的第三个方面，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估模型，所述套细胞淋
巴瘤预后风险评估模型基于mipi评分、pax5和脾肿大构建完成；
11.具体的，所述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型中，将5分分配给中等mipi评分和高mipi评分(低mipi评分赋分为0分)，4.5分分配给pax5阳性表达(pax5阴性表达赋分为0分)，4分分配给脾肿大(无脾肿大赋分为0分)。
12.其中，所述mipi评分维持现有分组及评分赋值不变；
13.基于此，mcl患者被分为3个风险组，分别定义为低风险组(0-5分)、中等风险组(6-10分)和高风险组(11-13.5分)。
14.上述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型命名为mipi-sp，经试验证明，结合了mipi、pax5和脾肿大的新型评分模型mipi-sp对mcl患者的预后价值优于mipi评分模型。
15.本发明的第四个方面，提供上述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型的构建方法，所述构建方法包括：将mipi评分、pax5情况和脾肿大情况进行结合构建获得；具体的，赋予mipi评分、pax5情况和脾肿大情况对应的评估分值，获得各项评估分值相加后获得的总分值对应的预后状态。
16.本发明的第五个方面，提供上述预后生物标志物、套细胞淋巴瘤预后风险评估模型在制备套细胞淋巴瘤预后风险评估系统中的应用。
17.本发明的第六个方面，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估系统，所述预后风险评估系统包括：
18.a)分析模块，所述分析模块用于获取受试者pax5、脾肿大和mipi评分相关数据，以及；
19.b)评估模块，所述评估模块根据获取得到的数据，赋予其对应的评估分值加和进而获得总分值，从而输出受试者对应的预后状态，从而实现对套细胞淋巴瘤预后风险评估。
20.本发明的第七个方面，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估的预后评估方法，所述方法包括使用上述生物预后标志物、预后风险评估模型或预后风险评估系统进行评估。
21.以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
22.上述技术方案通过研究发现，pax5阳性与mcl患者的较短os相关。pax5和脾肿大是mcl患者的独立预后因素。由此，上述技术方案提出结合mipi评分、pax5和脾肿大的新型评分系统mipi-sp，且其对mcl患者的预后价值优于mipi评分系统。
23.上述技术方案阐明了pax5异常表达在mcl中的作用，并为mcl患者的风险分层和预后评估提供了一种新的评分系统，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
24.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
25.图1为本发明实施例中套细胞淋巴瘤(mcl)患者的临床特征的预后分析和免疫组化结果；其中，a为与pax5低表达的患者相比，pax5高表达的患者os显著缩短，b为中高危险度与较差的os相关，c为mipi评分与os之间的相关性，d为高ecog(≥2)与较差的os相关，e为脾肿大与较差的os相关，f为高水平的β2-mg(≥2.65mg/l)与较差的os相关，g为mcl组织中pax5表达的ihc结果(
×
400)。
26.图2为本发明实施例中mcl患者中pax5阳性和阴性亚组以及mipi亚组临床特征的
预后分析；其中，a-d为在pax5阳性患者中，β2-mg(≥2.65mg/l)、脾肿大、ki67(≥30％)和ldh(≥202u/l)与较差的os相关，e-g为在mipi评分亚组中，中等mipi评分(4≤mipi≤5)组中pax5阳性与较差os相关，低mipi评分(≤3)组和高mipi评分(≥6)组中pax5阳性与os无显著性差异。
27.图3为本发明实施例中mipi-sp的预后分析和roc曲线以及pax5的表达、蛋白质相互作用网络和kegg富集分析；其中，a为在mipi-sp中，中高风险组与mcl患者较差的os相关，b为mipi-sp在预测mcl患者的os方面优于mipi评分，c为gse32018数据集中mcl患者标本的pax5的mrna 表达水平高于正常组，d为string数据库中与pax5相互作用的基因组网络富集结果，e为pax5的kegg富集分析结果。
28.图4为本发明实施例中pax5参与癌症进展的机制；pax5通过调节pi3k/akt/mtor和wnt/β-catenin信号通路等多种信号通路参与癌症发展。
具体实施方式
29.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
30.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
31.结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
32.如前所示，pax5已被证明是一种必需的转录因子，它在癌症发展和免疫中起着至关重要的作用，然而，pax5改变与mcl患者的预后之间的联系尚不明确。
33.本发明为进一步探讨pax5表达的意义，收集了82例mcl病例，根据pax5的阳性和阴性表达评估其诊断特征、生化指标和os。结果表明，pax5可作为mcl理想的预后生物标志物，为临床风险评估提供线索。
34.具体的，本发明全面分析了82例mcl病例的临床特征和实验室检查数据。通过免疫组织化学染色区分pax5阳性和阴性表达。kaplan-meier生存曲线显示pax5阳性与较短的os(p＝0.011)相关。此外，升高的β2-mg(p＝0.027)和高mipi评分(p＝0.014)也与pax5阳性表达有关。在pax5阳性亚组中，β2-mg(≥2.65mg/l,p＝0.042)、脾肿大(p＝0.005)、ki67阳性率(≥30％,p＝0.047)和ldh(≥202u/l,p＝0.046)与较差的os相关。多因素cox分析表明，脾肿大(p＝0.013)和pax5阳性(p＝0.031)是独立的预后因素。因此，本发明建立了一种称为mipi-sp的新型预后分组系统。mipi-sp结合了pax5和脾肿大，对os的预后价值更高，其曲线下面积(area under the receiver operating characteristic curve，auc)为0.770
(95％置信区间，0.658-0.881)，优于mipi评分(auc＝0.698(95％置信区间，0.576-0.820))。本研究进一步挖掘了pax5在mcl中的潜在作用，新的风险评分系统mipi-sp优化了风险分层并促进了mcl患者的预后评估。
35.有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种套细胞淋巴瘤预后生物标志物，所述生物标志物至少包括pax5和/或脾肿大。
36.经试验验证，脾肿大和pax5阳性是套细胞淋巴瘤独立的预后因素，其与mcl患者的较短os相关。
37.本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述套细胞淋巴瘤预后生物标志物的物质在制备套细胞淋巴瘤预后评估产品中的应用。
38.所述预后评估产品至少可用于对受试者的总生存期进行预测评估。
39.本发明的又一具体实施方式中，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估模型，所述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型基于mipi评分、pax5和脾肿大构建完成；
40.具体的，所述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型中，将5分分配给中等mipi评分和高mipi评分(低mipi评分赋分为0分)，4.5分分配给pax5阳性表达(pax5阴性表达赋分为0分)，4分分配给脾肿大(无脾肿大赋分为0分)。
41.其中，所述mipi评分维持现有分组及评分赋值不变(a new prognostic index(mipi)for patients with advanced-stage mantle cell lymphoma.blood,2008,111(2):558-565)；基于此，mcl患者被分为3个风险组，分别定义为低风险组(0-5分)、中等风险组(6-10分)和高风险组(11-13.5分)。
42.上述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型命名为mipi-sp，经试验证明，结合了mipi、pax5和脾肿大的新型评分模型mipi-sp对mcl患者的预后价值优于mipi评分模型。
43.本发明的又一具体实施方式中，提供上述套细胞淋巴瘤预后风险评估模型的构建方法，所述构建方法包括：将mipi评分、pax5情况和脾肿大情况进行结合构建获得；
44.具体的，赋予mipi评分、pax5情况和脾肿大情况对应的评估分值，获得各项评估分值相加后获得的总分值对应的预后状态。
45.更具体的，将5分分配给中等mipi评分和高mipi评分(低mipi评分赋分为0分)，4.5分分配给pax5阳性表达(pax5阴性表达赋分为0分)，4分分配给脾肿大(无脾肿大赋分为0分)。
46.其中，所述mipi评分维持现有分组及评分赋值不变；基于此，mcl患者被分为3个风险组，分别定义为低风险组(0-5分)、中等风险组(6-10分)和高风险组(11-13.5分)。
47.本发明的又一具体实施方式中，提供上述预后生物标志物、套细胞淋巴瘤预后风险评估模型在制备套细胞淋巴瘤预后风险评估系统中的应用。
48.本发明的又一具体实施方式中，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估系统，所述预后风险评估系统包括：
49.a)分析模块，所述分析模块用于获取受试者pax5、脾肿大和mipi评分相关数据，以及；
50.b)评估模块，所述评估模块根据获取得到的数据，赋予其对应的评估分值加和进而获得总分值，从而输出受试者对应的预后状态，从而实现对套细胞淋巴瘤预后风险评估。
51.其中，所述评估模块具体评估流程包括：
52.分别将5分分配给中等mipi评分和高mipi评分(低mipi评分赋分为0分)，4.5分分配给pax5阳性表达(pax5阴性表达赋分为0分)，4分分配给脾肿大(无脾肿大赋分为0分)；
53.则mcl患者被分为3个风险组，分别定义为低风险组(0-5分)、中等风险组(6-10分)和高风险组(11-13.5分)。
54.本发明的又一具体实施方式中，提供一种套细胞淋巴瘤预后风险评估的预后评估方法，所述方法包括使用上述生物预后标志物、预后风险评估模型或预后风险评估系统对受试者进行预后风险评估。
55.所述对受试者进行预后风险评估至少包括对受试者的总生存期进行评估。
56.所述受试者为mcl患者。
57.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
58.实施例
59.1、材料和方法
60.1.1病例选择
61.本研究经山东省立医院医学伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言获得患者知情同意。回顾性分析了2006年10月至2021年9月82例mcl患者的临床特征和实验室检查资料。所有患者均按照who修订标准进行病理检查并确诊为mcl。
62.1.2免疫组化
63.免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)染色按照以下步骤进行。mcl患者的淋巴组织用福尔马林固定过夜。置于0.1m pbs中，随后将淋巴组织置于乙醇和二甲苯中进行梯度脱水，然后包埋在液体石蜡中。脱蜡和复水后，切片用10％山羊血清封闭30分钟。然后，将切片与抗pax5抗体(ab109443，abcam，美国)在4℃下孵育过夜。用pbs洗涤三次，每次5分钟后，将载玻片与二抗(sa1052，boster，美国)孵育1小时。然后，进行一系列苏木精染色和封片。所有样本均由两名病理学家独立评估。ihc标记的pax5表达分为阴性(0-10％阳性淋巴瘤细胞)和阳性(》10％阳性淋巴瘤细胞)。根据pax5阳性或阴性将所有患者分为两组。
64.1.3统计分析
65.数据由spss软件23.0版进行。通过卡方检验对临床特征与pax5表达之间的相关性进行统计分析。应用t检验计算两组之间的实验室参数统计学差异。通过单因素和多因素cox分析对临床特征与os之间的关系进行分析。通过对数秩检验评估了kaplan-meier生存曲线之间的差异。受试者工作特征(receiver operating characteristic，roc)曲线用于比较mipi评分和建立的新型风险评分系统。p值《0.05被认为具有统计学意义。
66.1.4数据采集
67.在geo数据库gse32018(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中分析了pax5差异表达的基因表达谱。在string数据库v11.5(https://string-db.org/)中分析了pax5蛋白与其他蛋白之间的相互作用。
68.2、结果
69.2.1 mcl患者的临床特征
70.在82例mcl患者中，男性占71.95％(59例)，女性占28.04％(23例)。患者诊断时的年龄范围为33-87岁，中位年龄为62岁。60岁以上患者比例高达59.76％。此外，cyclind1、
bcl-2、bcl-6、cd3、cd5、cd19、cd20、cd23、cd43、cd79a等主要病理性免疫分子的阳性率分别为85.37％、53.65％、9.76％、12.20％、82.93％、30.49％、91.46％、18.29％、41.46％和32.93％。ⅲ期和ⅳ期患者分别占23.17％和57.32％。根据mipi评分，将患者分为低危组(30.49％)、中危组(26.83％)、高危组(32.93％)和未知组(9.76％)。接受chop/r-chop治疗的患者占接受化疗患者的71.19％，其余根据病情采用不同的治疗方案。此外，共对61例患者的治疗效果进行了评价，其中有3例完全缓解，6例部分缓解，33例病情稳定，19例疾病进展。
71.2.2 pax5表达阳性的mcl患者预后不良
72.为了探索pax5在mcl患者中的预后作用，采用kaplan-meier方法进行os分析。结果显示，pax5阳性患者的os明显短于pax5阴性患者(p＝0.011；图1a)。其他临床特征的生存分析表明，高风险评分(p＝0.028)、mipi评分(p＝0.006)、ecog(≥2；p＝0.019)、脾肿大(p＝0.002)和β2-mg(≥2.65mg/l；p＝0.002)与较差的os相关(图1b-f)。pax5表达根据ihc结果被分为阴性(0-10％阳性淋巴瘤细胞)和阳性(》10％阳性淋巴瘤细胞)(图1g)。单因素cox回归分析进一步揭示了脾肿大(p＝0.004)、高密度脂蛋白(p＝0.038)、直接胆红素(p＝0.009)、pax5阳性(p＝0.019)和mipi评分(p＝0.044)与os相关。此外，对mcl患者的多因素分析表明pax5阳性(p＝0.031)和脾肿大(p＝0.013)是os的独立预后因素(表1)。
73.表1.套细胞淋巴瘤(mcl)患者总生存期的单因素和多因素cox回归分析
[0074][0075]
hdl：高密度脂蛋白；fib：纤维蛋白原；db：直接胆红素。(
*
p《0.05,
**
p《0.01)
[0076]
2.3 mcl患者pax5表达与临床特征或实验室指标的相关性
[0077]
根据ihc的结果，60.98％的患者pax5为阳性，39.02％的患者pax5为阴性。对mcl患
者的进一步分析表明pax5阳性与mipi评分之间存在明显的相关性(p＝0.014；表2)。在风险分类中，高危患者pax5的阳性率显著高于低中危患者(p＝0.015；表2)。我们分析了pax5表达与实验室参数之间的相关性，发现pax5阳性患者的β2-mg明显高于pax5阴性患者(p＝0.027；表3)。mcl患者的特定合并症与pax5的阳性或阴性表达之间没有统计学差异(表4)。
[0078]
表2.mcl患者临床特征与pax5表达之间的关系
[0079]
[0080][0081]
ecog:东部肿瘤合作组；wbc:白细胞；β2-mg:β2-微球蛋白；ldh:乳酸脱氢酶；sd:病情稳定；pr:部分缓解；cr:完全缓解；pd:疾病进展。(
*
p《0.05)
[0082]
表3.pax5阳性或阴性表达的mcl患者实验室指标差异分析
[0083]
[0084][0085]
ck:肌酸激酶；myo:肌红蛋白；bnp:脑钠肽；ast:谷草转氨酶；hcy:同型半胱氨酸；tg:甘油三酯；apoa:载脂蛋白a；apob:载脂蛋白b；neut:中性粒细胞；lymph:淋巴细胞；mono:单核细胞；rbc:红细胞；hb:血红蛋白；plt:血小板；crp:c-反应蛋白；esr:红细胞沉降率；tbil:总胆红素。(
*
p《0.05)
[0086]
表4.有或没有pax5表达的mcl患者的合并症负荷
[0087]
[0088][0089]
2.4不同pax5表达和mipi评分的mcl患者的亚组分析
[0090]
我们分别分析了pax5阳性和pax5阴性的mcl患者可能的预后因素。在pax5阳性表达的mcl患者中，β2-mg(≥2.65mg/l；p＝0.042)、脾肿大(p＝0.005)、ki67阳性率(≥30％；p＝0.047)和ldh(≥202u/l；p＝0.046)与较差的os相关(图2a-d)。进一步分析了低mipi评分(≤3)、中等mipi评分(4≤mipi≤5)和高mipi评分(≥6)患者的预后。对于中等mipi评分(4≤mipi≤5)亚组的患者，pax5阳性与较差的os相关(p＝0.034)。然而，低mipi评分(≤3)和高mipi评分(≥6)亚组中mcl患者的pax5阳性和阴性与os没有表现出统计学差异(图2)。
[0091]
2.5 mcl患者的新型风险评分系统
[0092]
为了促进mcl患者的风险分层和预后评估，基于多因素cox分析建立了一个名为mipi-sp的新型风险评分系统，该系统结合了mipi评分、pax5和脾肿大。在mipi-sp中，分别将5分分配给中等mipi评分和高mipi评分(低mipi评分赋分为0分)，4.5分分配给pax5阳性表达(pax5阴性表达赋分为0分)，4分分配给脾肿大(无脾肿大赋分为0分)。mcl患者被分为3个风险组，分别定义为低风险组(0-5分)、中等风险组(6-10分)和高风险组(11-13.5分)。kaplan-meier生存分析显示，中高风险组的os显著短于低风险组(p《0.001；图3a)。通过roc曲线将mipi-sp与mipi评分进行了比较。mipi-sp的曲线下面积(area under the curve，auc)为0.770(95％置信区间,0.658-0.881)比auc为0.698(95％置信区间,0.576-0.820)的mipi评分更先进(图3b)。
[0093]
2.6 mcl中pax5的潜在调节作用
[0094]
如图3c所示，gse32018数据库中mcl标本中pax5的mrna表达水平明显高于正常组(p＝0.016)。此外，string数据库分析表明pax5与cd5、cd19、cd22、cd38、cd79α、cd79β和sox11共表达(图3d)。通过metascape分析，发现150个pax5相关基因主要富集于淋巴细胞活化、b细胞增殖和notch1信号通路(图3e)。总结pax5参与癌症发展的信号通路，如pi3k/akt/mtor和wnt/β-catenin信号通路(图4)。
[0095]
在此，我们回顾性分析了mcl患者的数据，发现了其临床特征、实验室检查指标和pax5表达之间的相关性。pax5( )可作为独立的预后因素表明mcl患者的os较差。因此，在mipi评分系统的基础上，建立了包含pax5表达和脾肿大的新型预后评估系统mipi-sp。mipi-sp优于mipi的优势使其成为潜在的风险分层和预后预测工具。
[0096]
为了实现对患者的持续监测，需要确定有效的生物标志物。为探讨pax5与mipi评分的关系，发现中等mipi评分组(4≤mipi≤5)中pax5阳性仍与预后不良相关，表明pax5的阳性表达可能进一步预示预后不良。因此，建立了一种称为mipi-sp的新型预后分组系统，该系统结合了mipi评分、pax5的表达和有无脾肿大。如roc曲线所示，mipi-sp的预后价值优于mipi评分。因此，mipi-sp可以有效优化mcl患者的风险分层，改善预后评估。
[0097]
string数据库分析表明，在以往的研究中，pax5与cd5、cd19、cd22、cd38、cd79α和cd79β共表达，并与sox11呈正相关。
[0098]
总之，pax5阳性与mcl患者的较短os相关。pax5和脾肿大是mcl患者的独立预后因
素。结合了mipi、pax5和脾肿大的新型评分系统mipi-sp对mcl患者的预后价值优于mipi评分系统。本研究阐明了pax5异常表达在mcl中的作用，并为mcl患者的风险分层和预后评估提供了一种新的评分系统。
[0099]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。