诊断和治疗自闭症的抗原神经元特异性烯醇化酶肽

诊断和治疗自闭症的抗原神经元特异性烯醇化酶肽
1.【相关申请的交叉引用】
2.本技术要求2019年11月25日提交的美国临时申请编号62/940175号的权益和优先权，出于所有目的，此处以引用的方式将该申请全文并入。
3.【关于政府赞助的研究或开发的发明的权利的声明】
4.这项发明以国家卫生研究院(nih)颁发的授予编号2p01es011269-11的政府资助完成。政府对这项发明享有一定的权利。


背景技术：

5.自闭症谱系障碍(asd)是在儿童早期诊断的一组神经发育障碍，根据社交能力、社会沟通能力的丧失以及重复性和受限的兴趣和行为的存在进行分类。2018年，疾控中心估计美国59名儿童中就有1名受到影响，这使得asd成为一个重要的健康问题，对受影响的家庭和医疗系统来说是巨大的社会经济负担。目前可用于asd的治疗干预措施是行为导向或基于症状的药理学治疗，仅在诊断后应用。目前对asd的病因知之甚少，虽然早期诊断后应用的某些治疗方法已显示出希望，但目前还没有预防性的替代方法。
6.已知的是，在胎儿生长早期，母体免疫系统的激活会对大脑发育产生负面影响。由于不清楚的原因，一些孕妇的免疫系统会产生自身抗体(免疫系统对自身组织的成分做出反应而产生的蛋白质)，这些抗体会错误地将胎儿大脑的一些部分识别为异物。因此，妊娠期暴露于这些母体自身抗体可能导致asd神经发育特征的改变。事实上，23％生下自闭症儿童的母亲具有针对在发育中的大脑中高度表达的七种蛋白质的循环自身抗体，而生下正常儿童的母亲只有1％。已知每种蛋白质都在神经发育中发挥重要作用；干扰其中一个以上的水平或功能可能会协同作用，改变大脑发育的轨迹。参见，美国专利号8,383,360。
7.因此，需要早期的、非遗传的、表位特异性的生物标记物来确定儿童患asd的母体风险。此外，还迫切需要通过创建高度特异的治疗方法和/或干预工具来解决asd的病因和治疗，而不仅仅是相关症状。在受影响的母体中及早识别这些母体自身抗体，将允许进行早期医疗干预，以限制胎儿暴露于自身抗体并导致其孩子患asd的风险，从而降低asd的患病率，并改善否则会受影响的儿童及其家庭的生活质量。本公开满足这些需求，并提供了相关的优点。


技术实现要素：

8.本公开提供了特异性结合在母亲或潜在母亲中针对神经元特异性烯醇化酶(nse)多肽产生的母体自身抗体的肽(例如，肽表位)。本文所述的肽可用于通过检测母亲或潜在母亲的生物样品中是否存在母体自身抗体来确定后代发生自闭症谱系障碍(asd)的风险。还可将肽施用给母亲或潜在母亲以阻断母体自身抗体与其抗原之间的结合，从而中和母体自身抗体。此外，这些肽可用于免疫吸附，以清除母体血浆中的循环自身抗体。
9.在第一方面中，本文提供一种分离肽，其与seq id nos:l-6中的任一个具有至少约80％的序列同一性。在一些实施例中，肽包含seq id nos:1-6中任一个的至少5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14或15个连续的(contiguous)氨基酸。在一些实施例中，肽与结合神经元特异性烯醇化酶(nse)蛋白的母体抗体结合。
10.在一些实施例中，肽的长度为约15至约30个氨基酸。在一些实施例中，肽的长度多至约25个氨基酸。在特定的实施例中，肽包含由seq id nos:1-6中任一个组成的氨基酸序列。
11.在一些实施例中，肽是模拟表位。在一些实施例中，模拟表位包括d-氨基酸。在其他实施例中，模拟表位包括一个或多个相对于seq id nos:1-6中任一个的氨基酸修饰(例如置换)。
12.在一些实施例中，肽还包含标记，例如生物素、荧光标记、化学发光标记和放射性标记。在其他实施例中，标记附着(例如，共价附着)至肽。
13.在另一方面中，本公开提供了一种组合物，其包括本文所述的肽或多个肽。在一些实施例中，组合物还包括药学上可接受的载体。在特定的实施例中，组合物中的肽或多个肽选自由seq id nos:1-6组成的组。在特定的实施例中，多个肽包括至少2、3、4、5或6个不同的肽。在一些实施例中，不同的肽与相同的母体抗体(例如，针对nse的抗体)结合。
14.在另一方面中，本公开提供了一种试剂盒，其包括本文所述的肽或多个肽和固体载体。在一些实施例中，固体载体是多孔板、elisa板、微阵列、芯片、珠粒、多孔带材或硝化纤维素过滤器。在一些实施例中，肽或多个肽固定在(例如，共价附着至)固体载体上。在特定的实施例中，所述肽或多个肽选自由seq id nos:1-6组成的组。在特定的实施例中，多个肽包含至少2、3、4、5或6个不同的肽。在一些实施例中，不同的肽与相同的母体抗体(例如，针对nse的抗体)结合。
15.在一些实施例中，试剂盒还包括使用说明。在一些情况下，使用说明包括将固体载体与来自母亲或潜在母亲的生物样品接触的说明。在其他情况下，使用说明包括与一种或多种肽结合的母体抗体的存在与后代(如胎儿或孩子)发生asd风险增加相关联的说明。在其他实施例中，试剂盒还包括用于检测与一个或多个肽结合的母体抗体的存在的标记二抗。
16.在其他实施例中，试剂盒还包括阴性和阳性对照样品。在一些情况下，阴性对照样品获自有正常发展(td)儿童的母亲。在其他情况下，生物样品和/或对照样品对全长nse有反应。在其他情况下，生物样品和对照样品对全长nse均无反应。在进一步的实施例中，试剂盒还包括直接或间接标记有可检测部分的二抗。
17.在另一方面中，本公开提供一种用于确定后代发生自闭症谱系障碍(asd)风险的方法，该方法包括：在来自后代的母亲或潜在母亲的生物样品中检测是否存在与本文所述肽或多个肽结合的母体抗体，其中与肽或多个肽结合的母体抗体的存在表明后代发生asd的风险增加。
18.在该方法的一些实施例中，该方法还包括从母亲或潜在母亲获取样品。在某些实施例中，样品选自由血液、血清、血浆、羊水、母乳和唾液组成的组。在一些实施例中，肽或多个肽选自由seq id nos:1-6组成的组。在该方法的一些实施例中，多个肽包含至少2、3、4、5或6个不同的肽。在特定的实施例中，不同的肽与相同的母体抗体，例如，针对nse的抗体相结合。在该方法的一些实施例中，肽或多个肽附着至固体载体，例如，多孔板、elisa板、微阵列、芯片、珠粒、多孔带材或硝化纤维素过滤器。
19.在该方法的一些实施例中，母体抗体通过如蛋白质印迹western blot、斑点印迹dot blot、elisa、放射免疫分析、免疫沉淀、电化学发光、免疫荧光、facs分析或多重珠分析的技术检测。
20.在该方法的一些实施例中，检测样品(即来自母亲或潜在母亲的生物样品)中是否存在母体抗体，无需将检测样品与对照样品进行比较。在其他实施例中，将检测样品与阳性或阴性对照样品进行比较。在一些情况下，检测样品和/或对照样品对全长nse有反应。在其他情况下，检测样品和对照样品对全长nse均无反应。在其他情况下，阴性对照获自有td儿童的母体。在该方法的一些实施例中，母亲或潜在母亲有患asd的孩子。在一些实施例中，母亲或潜在母亲有asd或自身免疫性疾病家族史。
21.在另一方面中，本公开提供一种用于预防或降低后代发生自闭症谱系障碍(asd)风险的方法，该方法包括：对后代的母亲或潜在母亲施用治疗有效量的本文所述的肽或多个肽，其中所述肽或多个肽结合在母亲或潜在母亲中循环的抗体以形成中和复合物，从而预防或降低后代发生asd的风险。
22.在该方法的一些实施例中，该方法还包括从母亲或潜在母亲去除中和复合物。在该方法的一些实施例中，中和复合物通过亲和血浆净化技术去除。
23.在该方法的一些实施例中，肽或多个肽通过静脉注射施用。在一些实施例中，肽或多个肽选自由seq id nos:1-6组成的组。在特定的实施例中，多个肽包含至少2、3、4、5或6个不同的肽。在一些实施例中，不同的肽与相同的母体抗体，例如，针对nse的抗体相结合。
24.通过以下详细描述，本公开的其他目的、特征和优点对于本领域的技术人员将是显而易见的。
【附图说明】
25.图1a-1d：用母体血浆探测胎猴脑(fetal monkey brain fmb)的蛋白质印迹(western blot，wb)。(图1a)丽春红染色的硝酸纤维膜，包含从fmb的制备细胞(prep cell)分离物收集的第一组分的样品，以及此后每第十个组分的样品。(图1b)图1a所示复制膜的wb用对37kda(ldh)、39kda(ybx1)、44kda(gda)和73kda(stip1、crmp1/2)抗原有反应的母体血浆池进行探测。(图1c)prep cell组分，含有39-42kda之间的蛋白质。组分#12用于2d凝胶电泳。(图1d)fmb组分#12的wb用母体血浆探测，该血浆对ldha-b、gda和ybx1无反应。通道1：仅二抗对照，通道2-4：母体血浆对ldha-b(绿色箭头)、ybx1(蓝色箭头)和gda(黑色箭头)有反应。通道5-8：母体血浆池#1，对39kda附近的蛋白质有条带反应性。通道10-14：母体血浆池#2，对37和39kda附近的两种蛋白质有条带反应性。通道9：fmb抗原的血浆样品阴性对照。缩写：fmb，胎猴脑；ldh a和b，乳酸脱氢酶a和b；ybx1，y盒结合蛋白1；gda，鸟嘌呤脱氨酶；crmp1和crmp2，崩塌反应介体1和2；stip1，应激诱导磷酸化蛋白1。
26.图2a-2e：用于质谱分析法的二维(2-d)凝胶电泳和抗原选择。图2a描绘了用于蛋白质与fmb组分#12(图2b)比对的抗igg染色凝胶，以及用血浆池1和血浆池2(图2c)印迹的膜。图2d描绘了图2b和图2c的合并图像。(图2e)由母体igg抗体结合的蛋白的wb(混合血浆1和2)，每种抗体都标有斑点编号。总共选取了27个蛋白质点，随后通过质谱法进行分析。
27.图3：elisa阳性样品的平均反应性(fi)超过50的序列热图。如果fi》200，则认为样品呈阳性。红色字母表示作为es 293-297中主要表位一部分的氨基酸残基，es 408-410表
disorders:a research review for practitioners,ozonoff,et ah,eds.,2003,american psychiatric pub；gupta,autistic spectmm disorders in children,2004,marcel dekker inc；hollander,autism spectrum disorders,2003,marcel dekker inc；handbook of autism and developmental disorders,volkmar,ed.,2005,john wiley；sicile-kira and grandin,autism spectrum disorders:the complete guide to understanding autism,asperger’s syndrome,pervasive developmental disorder,and other asds,2004,perigee trade；和duncan,et al.,autism spectrum disorders[two volumes]:a handbook for parents and professionals,2007,praeger中找到。
[0036]
术语“正常发展”和“td”指的是未被诊断为自闭症谱系障碍(asd)的受试者。通常情况下，正常发展的儿童不会表现出与asd的诊断典型相关的严重程度的asd相关的沟通能力受损、社交互动受损或重复和/或刻板行为。虽然正常发展的儿童可能会表现出被诊断为asd的儿童所表现出的一些行为，但正常发展的儿童不会表现出支持asd诊断的行为群和/或严重性。
[0037]
当用于核酸或蛋白质时，术语“分离(isolated)”表示该核酸或蛋白质基本上不含在自然状态下与其相关联的其他细胞成分。它优选处于均质状态。它可以处于干燥或水溶液中。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。作为制剂中主要物种存在的蛋白质基本上被纯化。特别是，分离的基因是从位于基因两侧且编码与感兴趣的基因不同的蛋白质的开放阅读框中分离出来的。术语“纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。特别是，这意味着核酸或蛋白质的纯度为至少85％、至少95％或至少99％。
[0038]
术语“核酸”或“多核苷酸”指的是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限定，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合性质，并以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、同源基因、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可以通过生成其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧核糖核酸残基置换的序列来实现(batzer et al,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka et al.,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；and rossolini et al.,mol.cell.probes 8:91-98(1994))。
[0039]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用以指代氨基酸残基的聚合物或氨基酸残基的多个聚合物的组装。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0040]
术语“氨基酸”包括天然存在的α-氨基酸及其立体异构体，以及非天然(非天然存在的)氨基酸及其立体异构体。氨基酸的“立体异构体”指的是氨基酸的镜像异构体，如l-氨基酸或d-氨基酸。例如，天然存在的氨基酸的立体异构体指的是天然存在的氨基酸的镜像异构体，即d-氨基酸。
[0041]
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(ala)、
半胱氨酸(cys)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、苯丙氨酸(phe)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、亮氨酸(leu)、蛋氨酸(met)、天冬酰胺(asn)、脯氨酸(pro)、谷氨酰胺(gln)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、缬氨酸(val)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于d-丙氨酸(d-ala)、d-半胱氨酸(d-cys)、d-天冬氨酸(d-asp)、d-谷氨酸(d-glu)、d-苯丙氨酸(d-phe)、d-组氨酸(d-his)、d-异亮氨酸(d-ile)、d-精氨酸(d-arg)、d-赖氨酸(d-lys)、d-亮氨酸(d-leu)、d-蛋氨酸(d-met)、d-天冬酰胺(d-asn)、d-脯氨酸(d-pro)、d-谷氨酰胺(d-gln)、d-丝氨酸(d-ser)、d-苏氨酸(d-thr)、d-缬氨酸(d-val)、d-色氨酸(d-trp)、d-酪氨酸(d-tyr)及其组合。
[0042]
非天然(非天然存在的)氨基酸包括但不限于氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、n-置换甘氨酸和n-甲基氨基酸，其呈l-或d-构型且功能类似于天然存在的氨基酸。例如，“氨基酸类似物”是与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的非天然氨基酸，即与氢、羧基基团、氨基结合的α-碳，但具有修饰的r(即侧链)基团或修饰的肽主链，例如高丝氨酸、去甲亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍盐。“氨基酸模拟物”指的是结构不同于氨基酸的一般化学结构，但功能类似于天然存在的氨基酸的化合物。
[0043]
本文中的氨基酸可通过其公知的三字母符号或iupac-iub生物化学命名委员会推荐的一字母符号来表示。例如，在本文中，l-氨基酸可由其公知的三字母符号(例如，arg代表l-精氨酸)或大写的一字母的氨基酸符号(例如，r代表l-精氨酸)表示。在本文中，d-氨基酸可由其公知的三字母符号(例如，d-arg代表d-精氨酸)或小写的一字母的氨基酸符号(例如，r代表d-精氨酸)表示。
[0044]
关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到对肽、多肽或蛋白质序列的单独置换、添加或删除，即改变、添加、或删除编码序列中的一个氨基酸或一小部分氨基酸，是“保守修饰变体”，其中这种改变导致氨基酸被化学相似的氨基酸置换。化学上相似的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸，如l-氨基酸、天然存在的氨基酸的立体异构体，如d-氨基酸，以及非天然氨基酸，如氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、n-置换甘氨酸和n-甲基氨基酸。
[0045]
提供功能相似氨基酸的保守置换表在本领域是众所周知的。例如，可以进行置换，其中脂肪族氨基酸(例如，g、a、i、l或v)被该基团的另一成员置换。类似地，脂肪族极性不带电基团，如c、s、t、m、n或q，可被该基团的另一成员置换；碱性残基，例如k、r或h，可以相互置换。在一些实施例中，具有酸性侧链的氨基酸例如e或d可分别被其不带电荷的对应物，例如q或n，置换；反之亦然。以下八组中的每一组都含有其他示例性氨基酸，它们彼此为保守性置换：
[0046]
1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；
[0047]
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
[0048]
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
[0049]
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
[0050]
5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、缬氨酸(v)；
[0051]
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；
[0052]
7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和
[0053]
8)半胱氨酸(c)、蛋氨酸(m)
[0054]
(例如，参见creighton，proteins，1993)。
[0055]
术语“氨基酸修饰”或“氨基酸改变”指的是一种或多种氨基酸的置换、删除或插入。
[0056]“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定的，其中与不包括添加或删除的参考序列相比，比较窗口中的序列部分(例如，本文所述的肽)可包括添加或删除(即，间隙)，以实现两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数，得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，并将结果乘以100，得出序列一致性百分比，从而计算百分比。
[0057]
在两个或多个多肽或肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”指的是作为相同序列的两个或多个序列或子序列。通过比较窗口或指定区域进行比较和比对，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量，以获得最大对应时，如果两个序列具有相同的指定氨基酸残基百分比(即在指定区域70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，或在未指定的情况下，在参考序列的整个序列)，则两个序列“基本相同”。关于氨基酸序列，同一性或实质同一性可存在于长度为至少5、10、15或20个氨基酸的区域，任选地存在于长度为约至少25、30、35、40、50、75或100个氨基酸的区域，任选地存在于长度为约至少150、200或250个氨基酸的区域，或存在于参考序列的全长上。对于较短的氨基酸序列，例如，20个或更少氨基酸的氨基酸序列，根据本文定义的保守置换，当一个或两个氨基酸残基被保守置换时，存在实质同一性。
[0058]
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。blast和blast 2.0算法是适用于确定序列一致性和序列相似性百分比的算法的两个示例，它们分别描述于altschul et al.(1977)nuc.acids res.25:3389-3402和altschul et al(1990)j.mol.biol.215:403-410中。进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获取。
[0059]
当第一多肽或肽与针对第二多肽或肽产生的抗体在免疫上发生交叉反应时，表明两个多肽或肽序列基本相同。因此，第一多肽或肽通常与第二多肽或肽基本相同，例如，其中两个序列仅因保守置换而不同。
[0060]
术语“抗原片段”指的是与抗体结合的多肽的连续的(contiguous)子序列。抗原片段可能具有免疫原性，也可能不具有免疫原性，即它可能会诱导免疫反应，也可能不会诱导免疫反应。
[0061]
术语“构象抗原片段”指的是多肽或四聚体的空间上连续的区域，该区域可能由连续的子序列形成，也可能不由连续的子序列形成。构象抗原片段可能具有免疫原性，也可能不具有免疫原性。
[0062]
术语“表位”或“抗原决定簇”指的是b细胞和/或t细胞对肽或多肽产生反应的位点。b细胞表位既可以由连续的氨基酸形成，也可以由蛋白质的三级或四级折叠并列的非连续的氨基酸形成。由连续的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级或四级折叠(即构象确定)形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，
表位通常包含至少3个，更常见的是，包含至少5个或8至10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括，例如，x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如epitope mapping protocols in methods in molecular biology,vol.66,glenn emorris,ed.(1996)。识别相同表位的抗体可通过简单的免疫分析识别，显示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力(例如，电化学发光分析、竞争性elisa、固相放射免疫分析(spria)或阻断性蛋白质印记)。t细胞识别cd8细胞约9个氨基酸或cd4细胞约13至15个氨基酸的连续表位。识别表位的t细胞可以通过测量抗原依赖性增殖的体外分析来识别，如通过启动的t细胞对表位的反应由3h-胸腺嘧啶核苷掺入确定(burke et al,j.inf.dis.170,1110-19(1994))，通过抗原依赖性杀伤来识别(cytotoxic t lymphocyte assay,tigges et al,j.immunol.(1996)156:3901-3910)或通过细胞因子分泌来识别。
[0063]
术语“特异性结合”或“特异性指向”指的是t细胞受体和/或抗体全部或部分与靶肽/多肽或其抗原片段之间相比与其他肽/多肽的优先关联。当然，能认识到，抗体或t细胞受体与非靶肽/多肽之间可能会发生一定程度的非特异性相互作用。然而，可以区分特异性结合，如通过特异性识别靶肽/多肽或其抗原片段来介导。通常，特异性结合或特异性指向的免疫反应导致靶肽/多肽和针对靶肽/多肽或t细胞受体的抗体之间的关联比针对靶肽/多肽或t细胞受体的抗体和非靶肽/多肽之间的关联强得多。与缺乏靶肽/多肽表位的细胞或组织相比，特异性结合通常导致与具有靶肽/多肽表位的细胞或组织结合的针对靶肽/多肽的结合抗体的量(每单位时间)增加约10倍(例如，大于100倍)。靶肽/多肽和针对靶肽/多肽的抗体之间的特异性结合通常意味着至少106m-1
的亲和力。优选大于108m-1
的亲和力。特异性结合可以使用本领域已知的任何抗体结合分析来确定，包括但不限于蛋白质印记、dot blot、elisa、流式细胞术、电化学发光、复合珠分析(例如，使用luminex或荧光微球)和免疫组织化学。特异性针对靶肽/多肽表位的t细胞通常表现出抗原诱导的增殖以响应靶肽/多肽，其大于响应非靶肽/多肽的抗原诱导增殖的约2倍(例如，大于约5倍或10倍)。t细胞增殖试验是本领域已知的，并可通过3h-胸腺嘧啶核苷掺入来测量。
[0064]
术语“样品”指的是获自受试者，例如人类受试者的任何生物样品。样品包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞、唾液、尿液、粪便、痰、支气管灌洗液、眼泪、乳头抽吸物、母乳、任何其他体液、组织样品，如胎盘活检，及其细胞提取物。在一些实施例中，样品是全血或其部分成分，如血浆、血清或细胞团块。
[0065]
术语“受试者”、“个体”或“患者”通常包括人类，但也可以包括其他动物，如，例如其他灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马、绵羊、豪猪等。在特定实施例中，受试者是人类受试者。
[0066]
术语“发生asd的风险增加”指的是与胎儿或儿童未暴露于针对一种或多种抗原的抗体或低于预定阈值水平的针对一种或多种抗原的抗体水平的风险、可能性或概率相比，暴露于结合本文所述一种或多种抗原(例如nse)的抗体或针对一种或多种抗原的抗体水平高于预定阈值水平的胎儿或儿童出现asd症状的可能性或概率增加。
[0067]
术语“发生asd的风险降低”指的是与暴露于针对一种或多种抗原的抗体或高于预定阈值水平的针对一种或多种抗原的抗体水平且其母亲没有接受治疗干预的胎儿或儿童将会出现asd症状的可能性或概率相比，暴露于结合本文所述一种或多种抗原(例如nse)的抗体或针对一种或多种抗原的抗体水平高于预定阈值水平且其母亲已接受治疗干预—例
如，阻断、灭活或去除与抗原结合的抗体—的胎儿或儿童将发生asd症状的可能性或概率降低。
[0068]
术语“肽表位”或“抗原肽”是指本文所述的一个或多个抗原(例如nse)的肽或片段，其模拟表位(例如，由针对抗原的抗体结合)，尽管此类肽表位的结构或序列与天然抗原表位之间可能不存在明确的同源性。相反，肽表位的模拟依赖于物理化学性质的相似性和相似的空间组织。肽表位的筛选和构建是本领域已知的。例如，肽表位可通过序列修饰从已知表位衍生，或使用肽的组合肽库从头开发，例如，结合一个或多个抗原的抗体。参见例如yip and ward,comb chem high throughput screen(1999)2(3):125-128；sharav,et al,vaccine(2007)25(16):3032-37；和knittelfelder,et al.,expert opin biol then(2009)9(4):493-506。
[0069]
术语“家族史”指的是家族成员中存在某种疾病状况(如“asd或自身免疫性疾病”)。家庭成员可以是直系亲属，例如父母、子女、祖父母或外祖父母，或是近亲，例如兄弟姐妹、姑、姨或叔、舅、堂亲、表亲。通常，家庭成员是具有共同基因遗传的血亲。
[0070]
术语“治疗有效量”指的是本文所述的肽的量，其能够实现治疗效果或期望结果(即，足够量的肽以阻断针对抗原的抗体与靶抗原的结合)，优选具有最小或无副作用。在一些实施例中，治疗上可接受的量不会引起或造成不良副作用。治疗有效量可通过首先施用低剂量，然后逐渐增加该剂量，直到达到预期效果来确定。本文所述抗体阻断剂的“预防有效量”和“治疗有效量”可防止asd的发病或导致asd严重程度的降低。“预防有效量”和“治疗有效量”还可以分别预防或改善由于母体抗体活性引起的紊乱和疾病而导致的损害或残疾。
[0071]
术语“药学上可接受的载体”指的是在制备药物组合物时有用的化合物、化学品或分子，该药物组合物通常是安全的、无毒的，并且在生物学上或其他方面都不是不理想的，并且包括可在受试者中用于医药用途的那些物质。本文和e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”中描述了合适的药物载体。
[0072]
如本文所用，术语“施用”包括口服施用、局部接触、作为栓剂施用、静脉注射、腹腔内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或给受试者植入缓释装置，例如微型渗透泵。施用可通过任何途径，包括肠外和跨粘膜(例如，口腔、舌下、腭部、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮施用)。肠外施用包括例如静脉注射、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹腔、脑室和颅内。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉输液、透皮贴片等。本领域技术人员将知道用于施用本文所述的治疗有效量的肽的额外方法，所述肽用于预防或缓解与母体抗体的存在或活性相关的一个或多个症状。“联合施用”是指在施用第二种药物之前或之后同时施用本文所述的肽。
[0073]
如本文所用，术语“治疗”指的是在治疗或改善病理或状况方面成功的任何标志，包括任何客观或主观参数如减轻、缓解、症状减轻或使患者更能忍受病理或状况、减缓退化或衰退的速度、使退化的终点更少虚弱、或改善患者的身心健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数，包括体格检查、组织病理学检查(例如活检组织分析)、尿液、唾液、组织样品、血清、血浆或血液的实验室分析或成像的结果。
[0074]
术语“特异性抑制”指的是试剂(例如本文所述的肽)抑制针对一种或多种抗原(例如nse)的抗体结合能力。特异性抑制通常导致至少约2倍于背景的抑制，例如，大于约10倍、
20倍、50倍对针对靶抗原的抗体结合的抑制，例如，通过在没有试剂的情况下比较抗体的结合。在一些实施例中，抗体与靶抗原的结合被试剂(例如本文所述的肽)完全抑制或阻断。通常，特异性抑制是使用适当的统计测试在统计学上有意义地减少抗体与靶抗原的结合(例如，p《0.05)。
[0075]
术语“试剂”包括肽(例如肽表位)、模拟表位、多肽(例如配体、抗体)、核酸、小有机化合物等。
[0076]
术语“固体载体”指的是适用于执行本文所述方法的任何材料，如塑料管或玻璃管、珠粒、载玻片、微量滴定板、多孔过滤器或膜、无孔过滤器或膜、非磁珠、微球、载玻片、微阵列等。
[0077]
术语“中和复合物”指的是包含与本文所述特定肽结合的母体抗体的复合物，其阻止/抑制/阻断母体抗体与其抗原(例如nse)结合。例如，特异性识别nse抗原的母体自身抗体可与本文所述nse肽或其模拟表位形成中和复合物，从而母体自身抗体不结合nse抗原。
[0078]
术语“亲和血浆净化技术”指的是从受试者血浆中去除有害物质(如致病剂)的体外血液净化程序。
[0079]
iii.实施例的详细描述
[0080]
本公开提供特异性结合针对内源性自身抗原nse蛋白的母体自身抗体的肽(例如，肽表位及其模拟表位)。本公开还提供包含本文所述肽的组合物和试剂盒。另外，本公开提供通过使用本文所述肽检测母亲或潜在母亲的生物样品中是否存在母体自身抗体来确定(例如，怀孕或怀孕前的母亲或潜在母亲)子女或未来后代发生自闭症谱系障碍(asd)的风险的方法。本公开还提供通过向后代的母亲或潜在母亲施用治疗有效量的本文所述肽以阻断母体自身抗体与其抗原之间的结合来预防或降低后代发生asd的方法。
[0081]
a.神经元特异性烯醇化酶(nse)
[0082]
nse是大脑中含量最丰富的蛋白质之一，根据大脑区域的不同，nse可占总可溶性蛋白质的0.4％至2.2％。它具有不同的作用，包括通过pi3k/akt和mapk/erk信令通路参与糖酵解和糖异生途径、神经细胞分化、激活和增殖。此外，nse在rhoa激酶途径的激活中发挥作用，其根据信号的强度可导致神经退行性变或神经保护。另外，nse在m1小胶质细胞和反应性星形胶质细胞中的表达上调，表明nse参与cns炎症过程。因此，nse在神经发育过程中起着几个重要作用，而且还与神经退行性变有关[18]。
[0083]
血浆nse水平的测量值已被用作各种应用的生物标志物[17]。例如，它是神经成熟的有用指标，是目前应用最广泛的小细胞肺癌(sclc)生物标志物，并且已被证明对不同sclc细胞系的细胞体外生长和迁移有直接影响[28,29]。另外，它还用于其他类型癌症的诊断和预后，如非小细胞肺癌(nsclc)、神经内分泌肿瘤(nets)、神经母细胞瘤、脑癌和脑损伤(tbi)[30]。如本文示例所述，我们基于在神经形成过程中与nse结合的抗体可能影响蛋白质功能和脑代谢的概念，解决了nse自身抗体作为mar asd潜在生物标记物或风险因素的价值，对神经组织功能和发育具有持久影响。
[0084]
如本文实施例所述，我们发现对于两个实验组(asd和td)针对nse的自身抗体反应率相似。这表明完整的nse蛋白本身并不是一个生物标记物，类似于之前的研究，其表明自身抗体对多种而非单一抗原的反应性赋予asd特异性的必要性[8、12、13、31、32]。当我们首次发现最初的七种自身抗原时，我们发现对特异性抗原组合的反应性作为asd风险的生物
标志物具有高度显著性，包括ldh、stip1和crmp1(13％asd vs 0％td)以及3种或更多种自身抗原的其他几种组合(为》98％的特异性)[6、8、9]。因此，我们使用更大的数据集测试nse，发现它增加了mar asd检测的特异性和敏感性。
[0085]
在最近的研究中，我们对crmp1、crmp2、gda、ldha/b、stip1和ybx1进行了基于微阵列的表位作图，并进一步描述了对仅由来自asd儿童的母亲的自身抗体识别的几个表位的差异反应性[15]。另外，我们使用我们原始的一组自身抗原表位来创建内源性抗原驱动的自闭症小鼠模型，在该模型中，用ldha、ldhb、crmp1和stip1的肽表位对小鼠进行免疫。这种方法允许胚胎在整个妊娠期持续暴露于针对mar asd特异性肽的自身抗体。因此，我们创建了显示asd相关行为的小鼠模型，证明暴露于这种自身抗体组合会导致神经发育的改变[11]。
[0086]
如本文实施例所述，我们将nse识别为一种额外的mar asd自身抗原，并发现16个由仅在asd组中存在的母体自身抗体识别的表位序列，使用传统t-检验和sam得分t-检验分析，其中4个序列与对照组相比显示出统计学意义。表位序列(es 408和409)serlakynqlmriee(seq id no:6)和erlakynqlmrieee(seq id no:3)具有最大or值(分别为10.1和12.6)，表明具有针对这些序列的自身抗体与具有患asd儿童的风险之间存在强烈关联。这些asd特异性表位肽可用于创建mar asd动物模型，以评估nse asd特异性肽单独或与其他自身抗原的致病性表位结合的影响，从而更好地理解抗-nse在自闭症病理学中的作用。
[0087]
作为作用机制，我们假设asd特异性nse表位自身抗体的存在可能以两种不同的方式抑制适当的蛋白质功能：1)直接干扰适当的蛋白质折叠(三级和四级结构)，或者，2)结合关键功能位点(催化或底物位点)[33-36]。虽然在发育中的大脑中抗nse抗体可能会引发针对这些自身抗体靶向的细胞的反应，但基于我们之前的啮齿类动物模型，我们缺乏组织破坏的证据。相反，抗crmp1、ldha/b和stip1的mar asd自身抗体的存在似乎会影响祖细胞的成熟以及成人大脑树突棘和结构的改变[10、13、37]。然而，脑内自身抗体介导的免疫病理机制仍知之甚少。
[0088]
最后一个感兴趣的领域是探索asd和非asd特异性肽序列与免疫表位数据库(iedb)中报告的表位库之间的关系[38]。这种兴趣源于肽模拟识别的潜力，以提供一些关于如何产生针对这些自身蛋白的自身抗体的理解。我们发现序列dypvvsiedpfdqdd(seq id no:7)、ypvvsiedpfdqddw(seq id no:8)、pvvsiedpfdqddwa(seq id no:9)、vvsiedpfdqddwaa(seq id no:10)和vsiedpfdqddwaaw(seq id no:11)在两个实验组中被抗体识别，表明普通人群识别的免疫优势表位。正如预期的那样，这些序列与α和γ烯醇化酶(nne和nse)有高度同源性，严格地为90％，有趣的是，它们与其他蛋白质有80％的同源性，包括来自人类γ疱疹病毒8(单核细胞增多症病原体)的蛋白质orf73、来自乙型肝炎病毒的蛋白x和来自人类的serpin hi，表明直接接触这些物质可能存在分子模拟。
[0089]
b.肽表位
[0090]
在某些方面中，本公开提供了特异性结合母体抗体的分离肽，这些抗体是在母亲或潜在母亲中针对神经元特异性烯醇化酶(nse)蛋白产生的。nse是在神经元和神经内分泌组织上表达的催化酶，分别在糖酵解和糖异生途径中介导2-磷酸甘油酯(2pg)转化为2-磷酸烯醇丙酮酸(2pep)和反向反应(2pep到2pg)[16]。对于真核细胞，有三种由不同基因编码
并具有组织特异性表达的烯醇化酶同种型；α烯醇化酶(eno 1)广泛表达，γ烯醇化酶(eno2)仅在神经元中发现，β烯醇化酶(eno 3)仅在肌肉中发现。烯醇酶以二聚体形式存在，其功能取决于天然辅因子mg 来调节酶的构象和催化活性[17]。在大脑中，nse在神经元上的表达为γγ，在小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞上表达为αγ。在发育的早期阶段，在神经组织上观察到非神经烯醇化酶(nne，αα-二聚体)，但发生神经和神经胶质细胞的分化和成熟时，其转变为γγ和αγ同种型(nse)，它通过调节细胞存活/死亡信号，参与细胞代谢、免疫反应调节、神经炎症、神经发育和脑内稳态[18]。因此，由于nse在神经发育生物学中的明确作用，在asd的背景下，nse作为母体自身抗体靶点的潜力是有充分根据的。
[0091]
在第一方面中，肽具有与seq id nos:1-6(dvaasefyrdgkydl(seq id no:1)；iedpfdqddwaawsk(seq id no:2)；erlakynqlmrieee(seq id no:3)；rlakynqlmrieeel(seq id no:4)；dypvvsiedpfdqddwaaw(seq id no:5)；和serlakynqlmriee(seq id no:6)中的任一个的氨基酸序列为至少约50％，例如，约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，肽包含seq id nos:1-6中任一个的氨基酸序列的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续的氨基酸。在其他实施例中，肽(例如，其抗原片段)具有seq id nos:1-6中任一个的氨基酸序列长度的至少约50％，例如，约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包括seq id nos:1-6中任一个的氨基酸序列或由其组成。在其他实施例中，肽在氨基末端和/或羧基末端包括一个或多个额外的氨基酸残基，其对应于nse多肽序列中那些位置的氨基酸残基。在特定的实施例中，肽与结合nse多肽的母体抗体结合。
[0092]
在一些实施例中，肽的长度为约5至约45个氨基酸、长度为约8至约45个氨基酸、长度为约8至约25个氨基酸、长度为约12至约45个氨基酸、长度约5至约40个氨基酸、长度为约10至约40个氨基酸、长度为约15至约30个氨基酸、长度为约15至约25个氨基酸、长度为约15至约22个氨基酸、长度为约15至约20个氨基酸、长度为约17至约25个氨基酸、长度为约19至约25个氨基酸、或长度为约45、40、35、30、25、20、15、10或5个氨基酸。例如，肽的长度可以为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多个氨基酸。通常，肽的长度不应超过允许形成三级结构，如，例如，大于45个氨基酸(如果以分离分子的形式存在)。然而，如果融合至更大的分子，如抗体或另一种蛋白质或大分子，则肽可能超过45个氨基酸，这可能会阻止肽内三级结构的形成。如果该肽是具有与不同母体抗体结合的第一和第二肽片段的二价肽，则该肽也可能超过45个氨基酸。在特定的实施例中，肽的长度至多为约15、20、25、30、35、40或45个氨基酸。
[0093]
在一些实施例中，肽还包括标记，如可检测标记。在某些情况下，标记选自由生物素、荧光标记、化学发光标记和放射性标记组成的组。在某些其他情况下，标记与肽共价结合。
[0094]
在其他实施例中，肽包括进一步修饰的变体，以提高其对蛋白水解降解的抵抗力或优化溶解性性质或使其更适合作为治疗剂。例如，肽还包括含有除天然存在的l-氨基酸以外的残基的类似物，例如d-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。d-氨基酸可被部分或全部氨基酸残基置换。
2009,john wiley interscience。
[0102]
在其他方面中，本公开提供包含本文所述的任何一或多个的组合物。作为非限制性示例，组合物包含与针对nse的母体抗体结合的多个肽。作为另外的非限制性示例，组合物包含选自由seq id nos:1-6组成的组的一个或多个肽。作为进一步的非限制性示例，组合物包含对应于seq id nos:1-6的肽。
[0103]
c.模拟表位
[0104]
在某些方面中，本公开提供免疫模拟本文所述肽表位(例如，与结合nse蛋白的母体抗体结合的肽)的模拟表位。在一些实施例中，模拟表位是免疫模拟肽表位并与抗原位点具有序列同源性的肽序列。在其他实施例中，模拟表位是免疫模拟肽表位并具有三维构象但不具有与抗原位点相似的序列同源性的肽序列。
[0105]
在一些实施例中，模拟表位引起的抗体反应与肽表位引发的抗体反应相似。在某些情况下，模拟表位的抗体反应对应于与肽表位结合的母体抗体上的相同抗原位点结合。模拟表位作为分子模拟物与母体抗体结合的能力可用于阻止抗体与其原始靶抗原(例如nse蛋白)结合。
[0106]
在一些实施例中，模拟表位是通过生物筛选从噬菌体展示文库获得的。适用于筛选和识别候选模拟表位的噬菌体展示库通常是多种噬菌体，其在可能被抗体结合的位置表达长度小于100个氨基酸、小于75个氨基酸、小于50个氨基酸、小于25个氨基酸的随机氨基酸序列，特别是在约3至约25个氨基酸的范围内。
[0107]
在其他实施例中，模拟表位是通过筛选肽库获得的。在一些情况下，肽库是重叠的肽库。在其他情况下，肽库是截短肽库，可用于识别活性所需的最短氨基酸序列。在其他情况下，模拟表位是通过丙氨酸扫描获得的，其中丙氨酸被用来依次置换每个残基，以识别负责肽活性的特定氨基酸残基。在进一步的情况下，模拟表位是通过位置扫描获得的，其在单个位置识别感兴趣的氨基酸，并用所有其他天然氨基酸一次置换一个，以在该位置识别用于增加肽活性的优选氨基酸残基。在相关情况下，位置扫描可包括两位置组合扫描或三位置组合扫描。设计、筛选和识别模拟表位的其他方法如美国专利号4,833,092所述，其公开内容以引用的方式全文并入以用于所有目的。
[0108]
在进一步的实施例中，模拟表位可包含在结构上比序列的线性形式更受限的肽序列。未置换的线性肽，如溶液中的游离肽，通常能够呈现大量不同的构象。相比之下，结构受限的肽，可能通过具有一个或通常两个或更多个减少其可呈现的可能构象的数量的取代基，也在本发明的范围内。
[0109]
取代基，如与进一步肽链的共价键或分子内键，将在结构上限制肽。例如，肽可以形成包含该肽的氨基酸序列的较大多肽的一级结构的一部分。在某些情况下，肽包括环肽。
[0110]
其他取代基包括与其他部分，如大分子结构(包括生物和非生物结构)的共价键。生物结构的示例包括但不限于载体蛋白质。非生物结构的示例包括脂质囊泡，如脂质体、胶束、脂质纳米颗粒等。
[0111]
在一些实施例中，载体蛋白与模拟表位结合。为此目的已知许多载体，包括各种基于蛋白质的载体，如白蛋白(例如，牛血清白蛋白(bsa))、锁孔血蓝蛋白(klh)、卵清蛋白(ova)、破伤风类毒素(tt)、来自非分型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白(hmp)、白喉类毒素或细菌外膜蛋白，所有这些都可以从生化或药品供应公司获得，或通过标准方法制备)。
[0112]
在其他实施例中，模拟表位是疫苗的成分。疫苗可包含一个或多个模拟表位，其中每个模拟表位能够结合相同或不同的母体抗体以阻止抗体结合到其原始靶抗原(例如nse蛋白)。多个模拟表位可结合在一起，例如，使用每个模拟表位结合的多聚赖氨酸。
[0113]
在特定的实施例中，肽模拟表位的设计使用单个氨基酸置换，然后对每个肽结构进行亲和性测试，以确定哪些肽模拟物具有阻断自闭症特异性母体自身抗体的能力。在某些情况下，当合成肽模拟表位时使用d-氨基酸，因为由d-氨基酸合成的肽更耐蛋白水解消化，并且在体内具有更长的半衰期。在其他情况下，每个自身抗原的肽模拟表位融合至聚乙二醇(peg)支架，从而产生能够中和自闭症特异性母体自身抗体的异源多聚体。例如，参见kessel et al,chem med chem.4(8):1364-70,2009。
[0114]
由于peg支架上的肽的免疫原性低于单个肽，因此连接到peg支架上的模拟表位肽可用作抗体阻断剂。可使用自动肽合成器(pioneer；applied biosystems；foster city，ca)，在适当的聚乙二醇(peg)-ps树脂(genscript corporation；piscataway，nj)上用9-芴基-甲氧基-羰基保护的氨基酸化学合成肽模拟表位。可通过使用三氟乙酸和清除剂从树脂中切割肽并从侧链中去除保护基团。粗肽可通过反相高效液相色谱法使用预备c
18
柱以溶剂a[95％/5％,h2o(0.1％三氟乙酸)/乙腈]和溶剂b(100％乙腈)的梯度进行纯化。然后使用高效液相色谱法通过分析c
18
柱对肽的纯度进行分析。合成肽的特性也可以通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱来确认。在某些情况下，肽模拟表位可以使用涉及对肽上的特定残基进行可逆保护的策略进行聚乙二醇化。该程序仅适用于肽，因为它们通常只包含几个亲核基团，并且在这一过程中所涉及的严酷化学处理中比全长蛋白质更稳定。该方法涉及三个步骤：(1)用合适的试剂保护已知对活性重要的残基，并最终纯化所需的异构体；(2)在单一的未受保护的反应性靶残基水平上进行聚乙二醇化；和(3)移除所有保护基。
[0115]
为了确定多聚肽模拟表位是否与患者血清中的抗脑自身抗体结合，可以使用elisa分析。elisa分析也可用于确定多聚肽模拟表位是否抑制针对天然抗原蛋白质的抗原抗体相互作用。这可以通过在执行elisa之前将母体抗体阳性血浆与异源多聚体预孵育来实现。
[0116]
动物模型可用于检查肽模拟表位在体内的有效性、安全性和/或药代动力学性能。作为一个非限制性示例，可以使用母体自身抗体相关(mar)自闭症的小鼠模型。例如，参见国际专利出版物wo 2016/210137中的示例5。mar自闭症母鼠和对照母鼠(即怀孕的雌性小鼠)可随机分配至两种治疗条件之一：妊娠期模拟表位治疗或生理盐水对照。一旦mar自闭症母鼠的耐受性被打破，分配至治疗组的母鼠可以通过静脉注射施用模拟表位肽。模拟表位在体内的效力可通过每24小时向母鼠注射200μg模拟表位，共4次来确定。治疗后肽模拟表位对小鼠自身抗体效价的降低可使用针对整个靶抗原蛋白的elisa分析来确定。可以进行一系列治疗试验，以确定在妊娠期间减少/阻断小鼠母体抗体所需的治疗次数。在确定理想的治疗方案后，可以培育母鼠以产生后代，用于后续的行为分析。
[0117]
在特定的实施例中，肽是一种模拟表位，其包含氨基酸序列中的部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或全部位置的d-氨基酸和/或包含相对于seq id nos:1-6的任一个的氨基酸序列的氨基酸序列中的一个或多个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)位置的氨基酸修饰(例如，置换)。
[0118]
d.试剂盒
aldrich，st.louis，mo和chemicon，temecula，ca购买。
[0128]
试剂盒还可包括用于将固体载体与来自母亲或潜在母亲的生物样品接触的说明，以及用于将母体抗体的存在或高于阈值水平的母体抗体水平与母亲或潜在母亲的胎儿或儿童发生asd的概率增加相关联的说明。
[0129]
在一些实施例中，试剂盒还包括用于检测母体抗体的阴性和阳性对照样品。在一些情况下，阴性对照样本获自有td儿童的母亲。在其他情况下，阴性和/或阳性对照样品对nse抗原有反应。在其他情况下，阴性和/或阳性对照样品对nse抗原无反应。在一些实施例中，试剂盒包括用于制备样本中母体抗体滴定曲线的样品，以协助评估测试生物样品中的抗体定量水平。在特定的实施例中，试剂盒包包括seq id nos:1-6中所述的一个或多个肽，例如seq id nos:1-6中所述的肽的1、2、3、4、5或6个。
[0130]
试剂盒可用于为任何育龄女性提供诊断或预后。诊断或预后可以在怀孕之前、期间或之后确定。可在妊娠的早期、中期和/或晚期的一个或多个期间检测母体抗体。在一些实施例中，母体抗体的检测对怀有大脑已经开始发育的胎儿的女性的生物样品进行，例如，在怀孕约12周后。在一些实施例中，母体抗体的存在与否或母体抗体的量化水平在产后进行一次或多次评估，例如，在出生后的头四周和/或母亲母乳喂养儿童时。在一些实施例中，在怀孕前或任何未怀孕的女性中，对母体抗体的存在或母体抗体的量化水平进行一次或多次评估。
[0131]
e.接受诊断或治疗的患者受试者
[0132]
本文所述的方法可对任何哺乳动物进行，例如，人类、非人灵长类动物、实验室哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠)、家养哺乳动物(例如猫、狗)或农业哺乳动物(例如牛、绵羊、猪、马)。在一些实施例中，患者是女性或人类。
[0133]
任何能够生育孩子的女性都可受益于本文所述的方法。孩子可以被孕育，也可能不被孕育，也就是说，女性可以怀孕，但不必怀孕。在一些实施例中，女性具有新生儿。在一些实施例中，女性处于生育年龄，即她已开始月经且未到达绝经期。
[0134]
在一些实施例中，本文所述的诊断和预防和/或治疗方法对怀有胎儿的女性(即怀孕的女性)进行。这些方法可以在怀孕期间的任何时候进行。在一些实施例中，这些方法对怀有大脑已经开始发育的胎儿的女性进行。例如，胎儿可能处于孕期12周左右或更晚。在一些实施例中，接受治疗或诊断的女性受试者处于妊娠中期或晚期。在一些实施例中，接受治疗或诊断的女性受试者处于妊娠早期。在一些实施例中，女性处于产后，例如，在分娩后6个月内。在一些实施例中，女性处于产后哺乳期。
[0135]
从目前的方法中受益的女性可能但不必有asd或自身免疫疾病的家族史。例如，女性可能患有asd，或其家庭成员(例如父母、子女、祖父母、外祖父母)患有asd。在一些实施例中，女性患有自身免疫性疾病，或其家庭成员(如父母、子女、祖父母、外祖父母)患有自身免疫性疾病。
[0136]
在一些实施例中，本文描述的方法包括确定诊断或治疗适合患者的步骤，例如，基于先前病史或家族病史或妊娠状态或任何其他相关标准。
[0137]
f.确定发生自闭症谱系障碍风险的方法
[0138]
在某些方面中，本公开提供了用于确定胎儿或儿童发生自闭症谱系障碍(asd)的可能性或风险的方法，包括在来自胎儿或儿童的母亲或潜在母亲的生物样品中识别与nse
抗原结合的母体自身抗体的存在。方法包括检测生物样品中是否存在与本文所述的任何一或多个肽结合的母体自身抗体，其中与所述肽或多个肽结合的母体自身抗体的存在表明胎儿或儿童发生asd的可能性或风险增加。
[0139]
对于从母亲或潜在母亲采集的生物样品，可以使用任何含有抗体的流体样品。例如，生物样品可以是血液、血清、血浆、羊水、尿液、母乳或唾液。当然，可以评估一种或多种不同体液中特异性结合一个或多个肽的抗体。
[0140]
在特定的实施例中，评估生物样品是否存在特异性结合本文所述肽(例如，seq id nos:1-6)的至少一个或多个的母体抗体，例如，seq id nos:1-6中所述的肽的至少1、2、3、4、5或6个。在一些实施例中，使用本文所述的一种或多种肽(例如，seq id nos:1-6)检测样品中特异性结合nse抗原的母体抗体的存在。作为非限制性示例，一个或多个肽，例如，seq id nos:1-6中所述的1、2、3、4、5或6个不同肽，可用于检测样品中是否存在母体抗体。
[0141]
在某些情况下，可使用seq id nos:1-6中所述的1、2、3、4、5或6个肽或其抗原片段检测针对nse的母体抗体的存在。
[0142]
在一些实施例中，检测到母体抗体的存在(与未检测到母体抗体相比)表明胎儿或儿童患或将发生asd的可能性增加。
[0143]
在一些实施例中，将生物样品中母体抗体的水平或滴度与阈值水平或滴度进行比较。生物样品中抗体的水平或滴度大于阈值水平或滴度，表明胎儿或儿童患或将发生asd的可能性增加。同样，生物样品中抗体的水平或滴度低于阈值水平或滴度并不表示胎儿或儿童患或将发生asd的概率增加(即，不表示概率增加)。特定生物流体中母体抗体的阈值水平或滴度可通过评估孕妇群体中的母体抗体水平，并将儿童发生asd时母亲的生物流体中的抗体水平或滴度与儿童未发生asd时母亲的生物流体中的抗体水平或滴度进行比较来确定。阈值水平或滴度也可以在怀孕期间的不同时间点确定，例如，孕育胎儿期间每四周、每两周或每周。也可以在儿童出生后测量阈值抗体水平或滴度，例如，在出生后的头四周和/或母体母乳喂养儿童时。
[0144]
可在怀孕前、怀孕期间或怀孕后确定针对nse抗原的母体抗体的存在或针对nse抗原的母体抗体的量化水平。在怀孕期间确定时，可在怀孕期间的任何时间酌情进行一次、两次、三次、四次或更多次母体抗体检测。例如，可在妊娠的早期、中期和/或晚期的一个或多个期间检测母体抗体。在一些实施例中，母体抗体的检测对怀有大脑已经开始发育的胎儿的女性的生物样品进行，例如，在怀孕约12周后。在一些实施例中，母体抗体的存在与否或母体抗体的量化水平在产后进行一次或多次评估，例如，在出生后的头四周和/或母亲母乳喂养儿童时。在一些实施例中，在怀孕前或任何未怀孕的女性中，对母体抗体的存在与否或母体抗体的量化水平进行一次或多次评估。
[0145]
根据需要或期望，可一次或多次确定母体抗体的存在。在一些实施例中，母体抗体的存在与否或母体抗体的量化水平怀孕期间每四周、每两周或每周评估一次，或根据情况进行更多次或更少次的评估。
[0146]
在一些实施例中，确定母体抗体的存在不需要将测试样品(即来自母亲或潜在母亲的生物样品)与对照样品进行比较。在其他实施例中，将测试样品与对照进行比较。对照可以来自在不同时间点的相同个体。例如，测试样品可在怀孕期间采集，对照样品可在怀孕前从同一个体采集。在一些情况下，测试样品将在妊娠期相对较晚的时候采集，对照样品将
在妊娠期较早的时候从同一个体采集。在这种情况下，如果测试样品中的母体抗体水平高于对照样品，则胎儿或儿童发生asd的风险增加。如果在怀孕期间对多个样品进行评估，母体抗体水平或滴度在孕期增加表明胎儿或儿童发生asd的风险增加。同样，母体抗体水平或滴度在孕期缺失或降低表明胎儿或儿童发生asd的风险较低或降低。
[0147]
对照也可以来自已知存在母体抗体状态的不同个体。对照可以是已知母体抗体存在状态的个体集合的计算值。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些情况下，阴性对照获自有td儿童的母亲。在其他情况下，阴性和/或阳性对照样品对nse抗原产生反应。在其他情况下，阴性和/或阳性对照样品对nse抗原无反应。
[0148]
在一些实施例中，对照是来自另外的个体或个体集合的阴性对照。如果对照样品的已知状态为抗体阴性，则测试样品中的母体抗体水平高于阴性对照样品，表明胎儿或儿童发生asd的风险增加。测试样品中的母体抗体水平与阴性对照样品相似，表明胎儿或儿童发生asd的风险没有增加，即风险较低或降低。
[0149]
在一些实施例中，对照是来自另外的个体或个体集合的阳性对照，或对照反映了预定的抗体阈值水平。如果对照样品的已知状态为抗体阳性，则测试样品中的母体抗体水平与阳性对照样品中相似或更高，表明胎儿或儿童发生asd的风险增加。相对于对照样品测试样品中的母体抗体水平较低，表明胎儿或儿童没有增加发生asd的风险，或者具有较低或降低发生asd的风险。
[0150]
对照样品或数值与测试样品之间的差异只需足以被检测到即可。在一些实施例中，当与阴性对照或之前测量的对照相比，抗体水平增加至少10％、25％、50％、1倍、2倍、3倍、4倍或更多时，确定测试样品中的母体抗体水平增加，从而asd的风险增加。
[0151]
为了诊断胎儿或儿童将发生asd的可能性增加，可以确定是否存在针对nse抗原任何亚型、同种型或同功酶的母体抗体。
[0152]
可以使用本领域已知的任何方法检测母体抗体。示例性方法包括但不限于蛋白质印记(western blot)、斑点印迹(dot blot)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)、放射免疫分析(ria)、电化学发光和复合珠分析(例如，使用luminex或荧光微珠)。
[0153]
肽可以是nse抗原的抗原片段。肽可衍生自nse抗原的已知抗原表位，其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加或以其他方式修饰。肽可从天然来源纯化或基本纯化，或重组或合成产生。
[0154]
在一些实施例中，用于检测母体抗体的肽可以固定在固体载体上。固体载体可以是例如，多孔板、微阵列、芯片、珠粒、多孔带材或硝化纤维素过滤器。固定可通过共价连接或非共价连接。在一些实施例中，固定通过特异性结合靶肽的捕获抗体。
[0155]
为了检测母体抗体，可在足以允许特异性结合样品中存在的一个或多个靶抗原的任何抗体的特异性结合的条件下(例如，时间、温度、样品浓度)，本文所述的一个或多个肽孵育样品。一个或多个肽可以结合至固体载体。例如，一个或多个肽可暴露于样品约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小时，或整夜，约8、10、12、14或16小时。然而，孵育时间可以或多或少取决于，例如，一个或多个肽的组成、一个或多个靶抗原的组成、样品的稀释度和孵育温度。使用稀释度较低的样品和较高的温度进行孵育的时间较短。孵育通常在室温(约25℃)或生物温度(约37℃)下进行，也可在冰箱(约4℃)中进行。根据已知的免疫分析方法，在添加二
抗之前进行洗涤以去除未结合的样品。
[0156]
标记的二抗通常用于检测与本文所述的一个或多个肽结合的样本中的抗体。二抗与不同类别或同型的免疫球蛋白igm、igd、igg、iga和ige的恒定区或“c”区结合。通常，在本方法中使用针对igg恒定区的二抗。针对igg亚类，例如，iggl、igg2、igg3和igg4的二抗也可用于本方法。二抗可以用任何直接或间接可检测的部分进行标记，包括荧光团(例如，荧光素、藻红蛋白、量子点、发光珠、荧光珠)、酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(例如，3h、
32
p、
125
i)或化学发光部分。标记信号可以使用生物素和生物素结合部分(例如，抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性亲和素)的复合物放大。荧光标记的抗人igg抗体可从molecular probes，eugene，or购买。酶标记的抗人igg抗体可从sigma-aldrich，st.louis，mo和chemicon，temecula，ca购买。
[0157]
检测样品中自身抗体的存在与否或差异存在的方法将与二抗标记的选择相一致。例如，如果将本文所述的一个或多个肽转移至适于免疫印迹的膜基质上，则如果使用酶标记可使用数字成像仪对可检测信号(即印迹)进行量化，或如果使用放射性同位素标记，则可使用x射线胶片显影剂对可检测信号(即印迹)进行量化。在另一个示例中，如果将本文所述的一个或多个肽转移至多孔板，则可使用能够检测和量化荧光、化学发光和/或色度信号的自动板读取器来量化可检测信号。这样的检测方法在本领域是众所周知的。
[0158]
一般免疫分析技术在本领域是众所周知的。参数优化的指导可在，例如，wu,quantitative immunoassay:a practical guide for assay establishment,troubleshooting,and clinical application,2000,aacc press；principles and practice of immunoassay,price and newman,eds.,1997,groves dictionaries,inc.；the immunoassay handbook,wild,ed ,2005,elsevier science ltd.；ghindilis,pavlov and atanassov,immunoassay methods and protocols,2003,humana press；harlow and lane,using antibodies:a laboratory manual,1998,cold spring harbor laboratory press；和immunoassay automation:an updated guide to systems,chan,ed.,1996,academic press中找到。
[0159]
在某些实施例中，母体抗体的存在或增加的存在由免疫分析中的可检测信号(例如，印记、荧光、化学发光、颜色、放射性)指示，其中来自母亲或潜在母亲的生物样品与本文所述的一个或多个肽接触。该可检测信号可与来自控制样品的信号或阈值进行比较。在一些实施例中，当测试样品中母体抗体的可检测信号比对照样品中的母体抗体信号或预定阈值高至少10％、20％、30％、50％、75％时，检测到asd的存在增加，并表明asd的风险增加。在一些实施例中，当测试样品中母体抗体的可检测信号为对照样品中的母体抗体信号或预定阈值的至少1倍、2倍、3倍、4倍或更多时，检测到asd的存在增加，并表明asd的风险增加。
[0160]
在一些实施例中，母体抗体确定结果记录在有形介质中。例如，目前诊断分析(例如，观察母体抗体的存在或增加的存在)以及确定是否asd风险增加的诊断的结果可以记录在例如纸上或电子介质(例如，音频磁带、计算机磁盘、cd、闪存驱动器等)上。
[0161]
在其他实施例中，这些方法还包括以下步骤：基于母体抗体确定结果为患者(即，母亲或潜在母亲)提供诊断，以确定患者的胎儿或儿童发生asd的风险是否增加。
[0162]
g.通过施用肽表位降低风险的方法
[0163]
在某些方面中，本公开提供了通过向母亲或潜在母亲的体内施用阻断剂(例如本
文所述的nse肽或其模拟表位，其特异性结合与asd相关的母体自身抗体)来预防和/或降低胎儿或儿童发生自闭症谱系障碍(asd)的风险的方法。阻断剂可防止母体抗体特异性结合胎儿或儿童体内存在的内源性nse自身抗原。
[0164]
在一些实施例中，该方法包括向母亲或潜在母亲施用至少一种阻断剂，该阻断剂包含本文所述的至少一个或多个肽(例如，seq id nos:1-6)或其模拟表位，例如，seq id nos:1-6中所述肽的至少1、2、3、4、5或6个或其模拟表位。在某些情况下，阻断剂包含对应于seq id nos:1-6的肽或其模拟表位及其组合。在一些情况下，阻断剂特异性结合识别nse抗原的母体抗体。
[0165]
使用阻断剂或多种阻断剂的本公开的预防和/或治疗方法可提供给怀孕之前、期间或之后的女性。在一些实施例中，在怀孕期间的任何时间，可酌情施用一种或多种阻断剂一次、两次、三次、四次或更多次。例如，一种或多种阻断剂可在妊娠早期、中期和/或晚期的一个或多个期间施用。在一些实施例中，一种或多种阻断剂对怀有大脑已经开始发育的胎儿的女性施用，例如，在怀孕约12周后。在一些实施例中，在产后一次或多次施用一种或多种阻断剂评估，例如，在出生后的头四周和/或母亲母乳喂养儿童时。在一些实施例中，在妊娠前一次或多次施用一种或多种阻断剂，例如，对母体抗体测试呈阳性的女性和正试图怀孕的女性。
[0166]
在一些实施例中，施用包含两个或更多个肽或其模拟表位的多种试剂。多种试剂可以单独或一起施用。多种试剂可以是单个肽或模拟表位的池。在一些实施例中，两个或更多个具有不同表位的肽或模拟表位是化学连接的。多个抗原表位可以来自相同或不同的抗原多肽。在这种情况下，化学连接可以是肽的直接连接或通过使用化学支架或连接剂的连接。在一些实施例中，两个或更多个具有不同肽表位的肽或模拟表位融合在一起。肽表位融合可以重组表达或化学合成。
[0167]
在一些实施例中，方法还包括向母亲或潜在母亲施用一种或多种阻断剂(例如，seq id nos:1-6的一个或多个肽或其模拟表位)的治疗或预防方案的步骤，以减少、抑制或防止母体自身抗体与nse抗原的结合。
[0168]
在某些情况下，施用的减少、抑制或防止母体抗体与nse多肽结合的阻断剂或多种阻断剂包含seq id nos:1-6中所述的1、2、3、4、5或6个肽或其抗原片段或模拟表位。在其他情况下，施用的减少、抑制或防止母体抗体与nse多肽结合的阻断剂或多种阻断剂包含seq id nos:1-6中所述的1、2、3、4、5或6个肽或其抗原片段或模拟表位。
[0169]
施用的阻断剂可含有减少或最小化其免疫原性的修饰。对肽或模拟表位中的氨基酸的修饰包括但不限于酰胺部分或焦谷氨酰残基，或添加聚乙二醇链(聚乙二醇化)。这些修饰可能有助于降低形成r-折叠构象的倾向，或有助于肽的稳定性、溶解性和免疫原性的降低。在一些情况下，需要更稳定、更可溶和免疫原性更低的肽。在c末端以conh2(酰胺)基团修饰的许多肽似乎能抵抗羧肽酶的攻击，而在n末端具有焦谷氨酰残基的许多肽更能抵抗广泛特异性氨基肽酶的攻击。与未修饰的肽相比，聚乙二醇化肽已被证明提高了血浆半衰期，降低了免疫原性。此外，对阻断剂的序列分析将允许通过保守修改最小化已知t细胞表位。本文所述的肽也包括能同时抵抗羧肽酶和氨基肽酶二者攻击的环肽。另外，口服施用阻断剂可能有助于最小化免疫原性。
[0170]
在一些实施例中，预防和/或治疗方法包括首先使用本文所述的检测方法确定母
亲或潜在母亲中结合nse抗原的母体抗体的存在或增加的存在的步骤。检测呈阳性或高于母体抗体存在阈值水平的女性是接受特异性结合母体抗体的一种或多种阻断剂的候选者。检测阴性或低于母体抗体存在阈值水平的女性无需接受特异性结合母体抗体的一种或多种阻断剂。
[0171]
适于在本公开中使用的药物组合物包括其中包含治疗有效量的活性成分的组合物。当然，施用药的组合物的量取决于待治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、施用方式和处方医生的判断。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开。通常，一种或多种母体抗体阻断剂的有效力的量或有效量如下确定：首先施用低剂量或少量阻断剂，然后逐渐增加施用剂量，和/或根据需要添加一种或多种第二阻断剂，直到在治疗受试者中观察到预期效果，例如消除或减少未结合或游离母体抗体的存在至低于预定阈值水平，且毒性或不良副作用最小或没有。用于确定用于施用本公开药物组合物的适当剂量和给药时间安排的适用方法见述于，例如goodman and gilman’s the pharmacological basis of therapeutics,11th ed.,bmnton,et al,eds.,mcgraw-hill(2006)，和remington:the science and practice of pharmacy,21st ed.,university of the sciences in philadelphia(usip),2005,lippincott,williams and wilkins。
[0172]
剂量和间隔可单独调整，以提供足以维持治疗效果的一种或多种阻断剂的血浆或组织水平。包含有效量的一种或多种阻断剂的组合物的单次或多次施用可以按照治疗医师选择的剂量水平和模式进行。剂量和给药时间安排可以确定和调整，例如，基于母亲或潜在母亲中的母体抗体水平，可以根据临床医生常用的方法或本文所述的方法在整个治疗过程中对其进行监测。在一些实施例中，治疗水平将通过施用每日单次剂量实现。在其他实施例中，给药时间安排可包括多个每日剂量安排。在其他实施例中，本公开包括每隔一天、每半周或每周给药。
[0173]
例如，根据需要可每月、每两周、每周或每天施用一种或多种阻断剂。在一些实施例中，监测母亲或潜在母亲的母体抗体水平，如果存在母体抗体或母体抗体水平高于预定阈值水平，则施用一种或多种阻断剂。一种或多种阻断剂可施用约1、2、3、4、5、10、12、15、20、24、30、32、36周的时间，或酌情更长或更短的时间。例如，如果母体抗体水平低于预定阈值水平，可停止一种或多种阻断剂的施用。一种或多种阻断剂可在妊娠的整个期间，或在妊娠前期、中期或晚期的一个或多个期间施用。施用可以在怀孕前开始，也可以在出生后继续，母亲母乳喂养儿童时。
[0174]
在一种或多种阻滞剂是肽或其模拟表位的一些实施例中，典型剂量可为约0.1μg/kg体重直到约1g/kg体重，且包括约1g/kg体重的范围内，例如，1μg/kg体重至约500mg/kg体重。在一些实施例中，肽或模拟表位的剂量为约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg体重。
[0175]
确切剂量取决于本文所述的各种因素，包括特定抑制剂、疾病严重程度和施用途径。确定确切的治疗有效剂量可由临床医生在无需过度实验的情况下确定，并可包括以上公开的范围内的任何剂量。
[0176]
一种或多种阻断剂通过施用途径施用，使得一种或多种阻断剂与母体抗体结合，并防止抗体结合与发生asd的风险相关的内源性自身抗原，并且最小化对试剂的免疫反应。
通常，这些药物是系统性施用的。在一些实施例中，一种或多种试剂通过非肠道途径施用，例如静脉注射或羊膜内施用(即直接进入羊膜囊)。另外，一种或多种试剂可口服施用。
[0177]
可通过注射(例如，通过快速浓注(bolus injection)或连续输注)配制用于肠外施用的一种或多种阻断剂。对于注射，一种或多种阻断剂可如下配制成制剂：在水性或非水性溶剂，如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中溶解、悬浮或乳化一种或多种阻断剂；并且如果需要，可以使用常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施例中，阻断剂的组合可配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，如汉克斯溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液。注射用制剂可以单位剂型呈现，例如以安瓿瓶或多剂量容器，并添加防腐剂。组合物可采取油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0178]
用于肠外施用的药物制剂包括水溶性形式的一种或多种阻断剂的水溶液。另外，一种或多种阻断剂的悬浮液可作为适当的油性注射悬浮液制备。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有适当的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以制备高浓度溶液。作为选择，一种或多种阻断剂可以呈粉末形式，以在使用前与合适的载体，例如无菌无热原水混合。
[0179]
与施用一种或多种阻断剂之前相比，如果在接受一次或多次施用一种或多种阻断剂后来自个体的生物样品中主动结合nse抗原的母体抗体的水平或滴度降低或消除，则使用一种或多种阻断剂的治疗被认为是有效的。例如，在一次或多次施用一种或多种阻断剂后，样品中主动结合nse抗原的母体抗体减少约10％、25％、50％、75％或100％表明施用一种或多种阻断剂是有效的。在已确定阈值水平的情况下，如果主动结合nse抗原的母体抗体的水平或滴度降低到阈值水平以下，则使用一种或多种阻断剂治疗被认为是有效力的。可以使用本领域已知的任何方法，包括本文所述的方法，测量主动结合nse抗原的母体抗体。
[0180]
h.通过去除母体抗体降低风险的方法
[0181]
在某些方面中，本公开提供了预防或降低后代，如胎儿或儿童，发生自闭症谱系障碍(asd)风险的方法，即在体外从母亲或潜在母亲的生物流体中去除母体抗体，然后将母体抗体水平降低或消除的生物流体返回母亲或潜在母亲。
[0182]
在一些实施例中，含有母体抗体的生物流体可从母亲或潜在母亲中移除，并与本文所述的一个或多个肽接触。在其他实施例中，可将本文所述的一个或多个肽施用给母亲或潜在母亲，以阻断生物流体中母体自身抗体与其自身抗原之间的结合，从而中和母体自身抗体，并且使用体外疗法，如亲和血浆净化技术，移除生物流体中存在的中和复合物。
[0183]
在一些实施例中，来自母亲或潜在母亲的生物流体与固定在固体载体上的一个或多个肽接触。固体载体可以是，例如，多孔板、elisa板、微阵列、芯片、珠粒、柱、多孔带材、膜或硝化纤维素过滤器。固定可以通过共价或非共价结合。在一些实施例中，固定是通过特异性结合靶肽表位的捕获抗体进行的。与固体载体连接的一个或多个肽是捕获生物流体中的母体抗体的固定相，从而使母体抗体水平降低或消除的生物流体与固体载体分离，即作为流动相，并返回给母亲或潜在母亲。
[0184]
在一些实施例中，体外处理的生物流体是血浆，通过血浆除去法去除母体抗体，这是本领域众所周知的过程。血浆与具有一个或多个固定肽的固体载体接触。血浆中的母体
抗体与固定肽结合。母体抗体水平降低或消除的血浆随后返回给母亲或潜在母亲。
[0185]
母体抗体的体外去除可以在女性怀孕之前、期间或之后进行。在一些实施例中，在怀孕期间的任何时候，酌情从生物流体中去除母体抗体一次、两次、三次、四次或更多次。例如，母体抗体可在妊娠早期、中期和/或晚期的一个或多个阶段被去除。在一些实施例中，母体抗体从怀有大脑已经开始发育的胎儿的女性移除，例如，在怀孕约12周后。在一些实施例中，母体抗体在产后被去除一次或多次，例如，在出生后的头四周和/或母亲母乳喂养儿童时。在一些实施例中，在怀孕前母体抗体被去除一次或多次，例如，对母亲抗体测试呈阳性的女性和正试图怀孕的女性。
[0186]
根据需要，可以执行一次、两次、三次、四次或更多次体外母体抗体去除过程，以消除或减少来自母亲或潜在母亲的母体抗体。母体抗体的体外去除可酌情每天、每周、每两周、每月、每两个月进行。在一些实施例中，监测母亲或潜在母亲中的母体抗体水平，如果母体抗体的存在高于预定阈值水平，则进行体外母体抗体去除。可酌情在1、2、3、4、5、10、12、15、20、25、35、36周或更长或更短的时间段内进行体外母体抗体去除。例如，如果母体抗体水平低于预定的阈值水平，则可以中止体外去除母体抗体。体外母体抗体去除可在整个妊娠期间进行，或在妊娠前期、中期或晚期的一个或多个期间进行。母体抗体去除可在怀孕前开始，并可在出生后继续进行，例如，在母亲母乳喂养儿童时。
[0187]
含有母体抗体的生物流体通常是血液、血清、血浆或母乳。在一些实施例中，生物流体是羊水。
[0188]
示例
[0189]
将通过具体实施例更详细地描述本公开。以下实施例仅用于说明目的，并不打算以任何方式限制本公开。
[0190]
示例1.材料和方法
[0191]
1.1研究受试者
[0192]
这项研究包括了在加州大学戴维斯分校mind研究所参加charge研究(遗传和环境对儿童自闭症的风险)的母亲[19]。本研究的charge研究参与者包括诊断asd(n＝246)的母亲，以及选自普通人群的儿童(正常发展，td；n＝149)的母亲。我们使用了如前所述的招募、资格和心理测量评估程序[7、19]。根据《精神障碍诊断和统计手册-5》(dsm-5)，mind研究所对asd的诊断进行了验证[20]。所有程序均由加州大学戴维斯分校和加州大学洛杉矶分校的加州人类受试者保护委员会和机构审查委员会批准。在参与之前，20名受试者以英语或西班牙语提供了书面知情同意书。与这些样品相关的人口统计信息如表1所示。
[0193]
表1研究人群的人口统计学。示出儿童出生时母体的平均年龄和收集样品时儿童的平均年龄。
[0194][0195]
缩写：asd，自闭症谱系障碍；td，正常发展；sd，标准偏差；max，最大年龄；min，最小年龄。a遗传和环境对儿童自闭症的风险(charge)研究的受试者。
[0196]
1.2样品采集和制备
[0197]
在柠檬酸-葡萄糖(bd-诊断)中采集血液，并将血浆分离、编码、等分，并在-80℃储存。使用前，将样品解冻，并以13,000rpm离心10分钟。
[0198]
1.3胎脑抗原制备
[0199]
组织处理如前所述进行[8]。简而言之，我们使用了加州国家灵长类动物研究中心提供的152天大的胚胎恒河猴大脑(fmb)。使用polytron 3000均质机(brinkman)以缓冲液对fmb进行机械均质，超声处理3分钟，并以3000
×
g离心10分钟。然后收集上清液，通过超滤浓缩，并通过二喹啉甲酸测定法(bca)测量其蛋白质含量。
[0200]
1.4制备细胞(prep cell)
[0201]
蛋白质分离如前所述进行[8]。简而言之，40mg fmb如下进行电泳并按分子量进行分离：使用prep cell设备(bio-rad，hercules，ca)在10％聚丙烯酰胺凝胶上以12瓦进行17小时。以0.75ml/分钟的流率每隔5分钟收集蛋白质组分。共获得110个组分，通过超滤浓缩至5mg/ml，并通过蛋白质印迹(wb)检测分子量和抗原反应(图1a-1d)。丽春红染色证实了蛋白质富集和组分，范围为约5kda/每个组分。组分#12含有37-45kda之间的蛋白质，因此被选择用于抗原识别(图2a-2e)。
[0202]
1.5蛋白质印迹
[0203]
为测试自身抗体对含有37-45kda之间的蛋白质的fmb组分#12的反应性，如前所述，用母体血浆样品探测该组分(图1d)[8]。综上所述，通过在sds缓冲液中在100℃加热10分钟使200μg蛋白质变性，并在12％sds-page凝胶上在200v分离1小时。在4℃将蛋白质转移到0.2μm硝化纤维素膜上整夜(10v，持续16小时)。为了确认转移，用丽春红染料对膜进行染色，并将其切成3mm的条带，条带用1％酪蛋白缓冲液标记并封闭。然后将血浆样品稀释(1:400)，加入条带中，在rt下孵育1.5小时，随后进行五次洗涤，并与1:20,000山羊抗人igg hrp孵育30分钟。五次洗涤后，通过添加800μl super signal底物进行检测，并将条带放置在玻璃板上，使用fluorochem 8900成像仪进行成像。如果为阴性，则图像得分为0，如果为阳性，则图像得分为1。
[0204]
1.6二维(2-d)凝胶电泳
[0205]
如前所述，通过二维电泳分离母体自身抗体靶向的蛋白质组分[8]。简而言之，将
300μg在30-40kda范围内的蛋白质组分用cy2(ge life sciences，pittsburgh，pa，usa)标记，以准备进行二维电泳(所有凝胶重复进行)。首先，使用3-10等电聚焦带(ge healthcare，piscataway，nj，usa)，通过其等电点分离15μg的每个样品。然后将条带装载到2 10.5％聚丙烯酰胺凝胶(ge healthcare)上进行二维电泳。使用quant软件(6.0版，ge healthcare)捕获图像。将其中一种凝胶转移到硝酸纤维素膜上，以通过wb测定对37-39kda附近条带反应，但对gda、ldha/b和ybx1不反应的母体血浆。将产生的阳性斑点映射回cy2染色的重复二维凝胶，从凝胶中提取，并用胰蛋白酶(promega，madison，wi，usa)消化，为质谱分析做准备。
[0206]
1.7质谱
[0207]
质谱分析如我们之前的报告所述进行[8]。消化后的肽被脱盐(zip-tip cl8，millipore，billerica，ma，usa)并在maldi板(abi 01-192-6-ab型)上形成斑点。使用abi 4700质谱仪(applied biosystems，framingham，ma)获得maldi-tof ms和tof/tof串联ms/ms数据。获得的肽质量和相关碎片谱使用配mascot搜索引擎的gps explorer工作站(matrix science，boston，ma，usa)分析，并用于对ncbi进行blast搜索。蛋白质得分置信区间(c.i.％)或离子c.i.％大于95的候选被视为阳性(表1)。
[0208]
以100 c.i.选择通过质谱法识别的前4种商用抗原用于进一步的评估。为了评估针对包括nse、nne、aldoc和ckb在内的我们的顶级苗头(top hits)的抗体反应性，如前所述，用稀释的母体血浆(1:800)通过wb探测2μg重组蛋白(novus biological，littleton，co)。
[0209]
1.8酶联免疫吸附试验(elisa)
[0210]
一旦nse被wb识别为可行的抗原候选物，我们使用elisa方法评估了更大的nse反应性样品集。我们检测了来自参与charge研究的具有至少一个患asd(n＝232)的儿童的418名母亲的血浆，或来自正常发育儿童(td；n＝186)的母亲的对照样品。微量滴定板用100μl nse(novus biological，littleton，co)(在ph 9.6的碳酸盐涂覆缓冲液中为2μg/ml)，在4℃孵育整夜，用pbst 0.05％洗涤四次，并在室温(rt)下用2％super block(thermo scientific，rockford，1l)封闭1小时。将血浆样品稀释1:500，并一式两份运行。稀释后，向每个孔中添加100μl稀释样品，孵育1.5小时，洗涤4次，然后与1:10,000山羊抗人igg hrp igg(kirkegaard&perry laboratories，inc.,gaithersburg，ma)孵育1小时。然后洗涤板，并通过添加100μl bd-opteia流体底物进行检测，用于elisa(bd biosciences，san jose，ca)。4分钟后，用50μl 2n hcl停止反应。使用imark微孔板吸光度读数器(biorad，hercules，ca，usa)在490-450nm处测量吸光度。
[0211]
1.9接受者操作特征(roc)曲线
[0212]
对于elisa分析，使用roc曲线确定nse反应性的阳性截止值。roc曲线是通过绘制各种阈值设置下的真阳性率和假阳性率来创建的。因此，我们使用七个阳性样品(标记为 )创建了我们的曲线，这些样品来自具有患asd儿童且wb阳性的母亲(真阳性样本)以及测试样本。通过使用阳性样本作为参考事件，截止值具有更高的特异性(假阳性较少)，尽管牺牲了一些灵敏度(检测限)。roc绘制了每个值的灵敏度与1-特异性之间的关系图，创建了表示测试准确性的曲线下面积(auc)。尤登指数用于计算截止值[21、22]。
[0213]
1.10微阵列筛选
[0214]
完整的nse序列(np_001966.1)获自ncbi，并在微阵列玻片上将其翻译成连续15-mer肽的库，其中肽-肽重叠14个氨基酸(aa)。如前所述，发现肽微阵列由pepperprint合成[23]，由此利用固相fmoc化学法(pepperprint，heidelberg，germany)将靶向的15-mer肽序列直接打印在玻片上，一式两份。源自人类流感血凝素(ha)(ypydvpdyag)和脊髓灰质炎疫苗(kevpaltavetgat)的肽也被纳入，作为阳性对照。
[0215]
为测试针对打印肽的抗体反应性，我们根据制造商的说明，用来自参与charge研究(asd＝27和td＝22)的母亲的血浆探测阵列。微阵列载玻片首先与标准缓冲液(含有0.05％吐温20、ph 7.4的pbs)孵育10分钟，然后在rt下阻断45分钟(rockland blocking buffer mb-070；rockland immunochemicals inc)。然后载玻片在4℃下摇动的情况下以1:250稀释的染色缓冲液中的单个母体血浆样品孵育整夜，然后在标准缓冲液中洗涤3次。为检测信号，将载玻片与在染色缓冲液(含10％封闭缓冲液的标准缓冲液)中以1:5000稀释的山羊抗人ig(h l)-dylight649(rockland immunochemicals inc.)在rt下孵育30分钟。孵育二抗后，使用genepix 4000b微阵列扫描仪(molecular devices，sunnyvale，california)对微阵列成像。
[0216]
根据制造商的建议，使用pepperprint analyser软件(pepperprint)对斑点强度(fi)和肽注释进行荧光信号量化。数据预处理方法如之前的肽微阵列研究所报告。简而言之，使用zue et al报道的校正方法[24,25]计算净荧光强度(fi)。每个点设置一个3x2的窗口，六个点的中间值用作中心点的“邻域背景”。为使净荧光强度(fi)标准化，每个斑点都设置一个3x1的“滑动窗口”，并将三者的中值用作中心斑点的标准化信号[24,25]。校正后的净强度通过从标准化信号中减去校正后的背景来计算。如果背景中的背景信号高于斑点(负fi)，则根据类似研究的报告，将信号设置为1[26、27]。
[0217]
最后，在进行背景校正和信号标准化后，通过计算重复信号的中值获得校正后的净信号，并计算变异系数。对cv高于50％的样品进行标记和校正。由于非特异性结合，低于200fi的值被视为阴性，只有值超过200的序列被视为阳性进行统计分析[26、27]
[0218]
统计分析
[0219]
为了彻底检查诊断组之间显著不同的序列数据，并确定特定组(td或asd)的特异性表位，我们使用了两种不同的分析方法：1)t检验—一种参数检验，允许我们通过均值差异比较两个独立样品，并假设数据的正态分布，以及2)微阵列显著性分析(sam)—一种基于排列的方法，用于测量表位表达和反应变量之间关系的强度，在本例中为asd和td诊断。sam得分与数据关系的显著性直接成比例(最大得分＝2)。使用xlstat 2015.1软件(addinsoft，paris，france)进行t-检验，并使用r统计计算环境运行sam分析。另外，我们通过fisher精确检验比较了asd组和td组的表位反应性的普遍性。如果p《0.05，则认为差异显著。使用graphpad prism软件(graphpad software，san diego，ca)计算重要序列的优势比(or 95％c.i)。
[0220]
示例2.抗原识别
[0221]
将胎猴脑(fmb)按分子量分为110个组分，并对包含分子量为37-45kda的蛋白质的组分#12(图1b和1c)进行2-d凝胶/蛋白质印迹对分析(图2a-2e)。将一种凝胶转移到硝化纤维素膜上，并用于验证患有asd儿童的母亲对37-45kda之间的蛋白质的自身抗体反应性(图ib和1c)，这些蛋白质通过wb对上述分子量范围内的自身抗原(gda、ldha、ldhb和ybx1)呈阴
性(图1d)。观察到多个斑点，并从第二个匹配的2-d凝胶中收集所有已识别斑点进行质谱分析(图2a-2e)。以100％ci选择37-45kda附近的蛋白质进行验证，表2列出了验证抗原的详细质谱结果。
[0222]
表2图2e中选择的每个斑点的质谱结果概述
[0223][0224]
斑点编号1、6、8和21-25中的蛋白质参与糖酵解-糖原异生途径。
[0225]
以100％ci选择由母体自身抗体识别的前4种商用蛋白质用于进一步评估，包括神经元特异性烯醇化酶(nse)、非特异性烯醇化酶(nne)、果糖-二磷酸醛缩酶c(aldoc)和肌酐激酶b(ckb)。使用重组蛋白对每一种蛋白质进行测试，以评估母体自身抗体针对单个抗原的反应性。随后，nse被母体样本识别为与37-45kda条带相对应，在被识别出测试样品中具有最大特异性，因此被选为最有可能的附加mar asd靶自身抗原候选物。
[0226]
示例3.抗原验证
[0227]
nse被质谱识别为母体自身抗体的潜在靶点，并基于其在神经发育中的关键作用，我们选择进一步评估nse作为潜在的mar asd生物标记物。重组nse首先通过wb随后通过elisa验证母体自身抗体反应性。有asd儿童的232名母亲中有26名(6.2％)观察到反应性，有正常发展儿童的186名母亲中有21名(td，5％)观察到反应性，表明单独的nse不是mar asd的生物标记物。因此，我们使用类似于之前描述的七种mar自身抗原的方法来探测样本，以识别asd和td组之间的差异表位。
[0228]
示例4.表位作图
[0229]
将完整的nse序列(np_001966.1)翻译成434种不同的15-mer肽，具有14个aa重叠，并在玻璃微阵列上打印两份，然后用asd组和对照组母亲的稀释血浆对其进行检测。在数据预处理步骤后，我们根据elisa反应性将样品分为两类(阳性：具有针对nse的抗体的样品；阴性：样品对nse天然形式呈阴性，但可能对隐匿的表位有反应)，用于统计分析。对于elisa( )样品，我们发现16个序列具有asd特异性(0％td)，5个序列被两组抗体识别(fi》200)。在16个asd特异性序列中，使用t-检验和sam t-检验，有4个序列具有统计学显著性(表3)。dvaasefyrdgkydl(seq id no:1)(p＝0.047；sam得分1.49)、iedpfdqddwaawsk(seq id no:2)(p＝0.049；sam得分1.49)、erlakynqlmrieee(seq id no:3)(p＝0.045；sam得分1.57)和rlakynqlmrieeel(seq id no:4)(p＝0.017；sam得分1.82)。
[0230]
表3母体自身抗体识别的重要nse表位概述(elisa阳性)
[0231][0232]
缩写：es，表位序列；asd，自闭症谱系障碍；td，正常发展
[0233]
另外，为了评估表位序列与给定组的相关性，我们使用了fisher精确检验，没有发现显著差异，可能是因为我们的样本量较小。相反，我们计算了每个单独肽95％置信区间(95％cis)的优势比(or)。我们发现所有asd特异性序列具有超过3的or，serlakynqlmriee(seq id no:6)(or10.1，ci 95％0.5094至200.7)和erlakynqlmrieee(seq id no:3)(or 12.6，ci 95％0.6408至247.7)是具有最高or的两个表位(图3)。如上所述，我们发现两品样
本组的血浆都能识别的五个连续的表位序列，这表明大的免疫显性表位包括印刷序列dypvvsiedpfdqdd(seq 10id no:7)、ypvvsiedpfdqddw(seq id no:8)、pvvsiedpfdqddwa(seq id no:9)、vvsiedpfdqddwaa(seq id no:10)和vsiedpfdqddwaaw(seq id no:11)(表3)。如图3所示，红色突出显示的序列显示了五个不同肽表位中的每一个中抗体识别的保守氨基酸。在elisa(-)样本中也观察到了对大的主要免疫优势表位的反应，表明它是主要被普通人群识别的模拟表位(表4)。有趣的是，我们还发现一个asd特异性表位序列，qdfvrdypvvsiedp(p＝0.054，sam得分1.97，or 12.6，ci 95％0.6408至247.7；seq id no:23)，其由elisa(-)样本确认，这表明它可能对nse的天然结构没有反应，更可能与隐性决定因子结合(表4)。
[0234][0235]
示例5.生物信息学
[0236]
为更好地了解最近确定的表位的潜在反应性来源，我们使用免疫表位数据库工具
(iedb)分析表位与iedb数据库中报告的所有表位的同源性。我们对90％和80％的序列同源性设置进行了blast搜索，发现每个已识别序列与其他烯醇化酶同种型，主要是α-烯醇化酶，具有90％的同源性(表5)。dypvvsiedpfdqdd(seq id no:7)和dfvrdypvvsiedpf(seq id no:16)表位各自都与人类γ疱疹病毒8(单核细胞增多症病原体)的蛋白质orf73有90％的同源性，且dvaasefyrdgkydl(seq id no:1)与博氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)(莱姆病病原体)的外表面蛋白a具有90％的同源性。其他序列与不同生物体的肽具有80％的同源性，包括丙型肝炎病毒的基因组多蛋白、人类β-疱疹病毒6b的病毒粒子包装蛋白ul25、链孢菌的alt a6、霍乱弧菌的atp依赖性rna解旋酶rhlb和乙型肝炎病毒的蛋白x。(表5)。
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应当理解，本文描述的示例和实施例仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员建议根据其进行的各种修改或改变且将包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利、专利申请和序列号均出于全部目的以引用的方式特此全文并入。