一种电活性钛支架增强复合膜及其制备方法

1.本发明涉及骨科及口腔外科植入修复材料技术领域，具体地涉及用于颌骨缺损修复、牙槽骨增量或颅骨修复的电活性钛支架增强复合膜及其制备方法。


背景技术：

2.引导骨再生术(gbr)是口腔外科及骨科手术中应用最多的骨增量技术。基本原理是利用屏障膜有效阻止上皮或纤维细胞进入骨缺损区，维持缺损空间，促进骨缺损修复。然而常规作为屏障膜的材料(如可吸收的胶原膜或不可吸收的ptfe膜)缺乏机械强度，难以维持稳定的空间，在术后可能发生折叠塌陷，影响骨再生。
3.在颅骨修补手术中，修补材料的选择至关重要。目前，临床上常用的修补材料主要分为自体骨、异体骨、羟基磷灰石材料、金属钛材料和高分子材料等。其中，自体骨修补因须开辟第二术区，来源受限，塑形困难且易被吸收等原因，临床使用受到限制。同种异体骨和异种骨也因明显的排异反应和高感染率而被放弃。羟基磷灰石材料虽然具有良好的生物相容性和骨诱导性，但其机械强度较差，抗拉强度较低，容易在术中螺钉固位和术后受到外力而碎裂，术后感染率较高。
4.至于金属钛材料，其虽有良好的生物相容性和机械强度，但由于存在切割伤害，隔热性差，塑形困难，术后往往会出现排异、感染、疼痛和塌陷变形等并发症，并会干扰核磁共振检查。因此，高分子颅骨修补材料应运而生。其中，聚甲基丙烯酸甲酯质地较脆易碎且生物活性不足，高密度聚乙烯韧性与硬度较低，支撑能力不足，均有待进一步发展。
5.目前临床上较常使用的高分子材料主要是聚醚醚酮peek，其具有良好的生物相容性及透x射线性能，并与皮质骨的生物机械性能相近，但其价格过于昂贵，且缺乏骨整合性，不能与周围的自体颅骨相结合，出现排异的风险较高。
6.国内外临床上采用传统钛网修复大面积骨缺损。然而，在种植骨增量手术及大范围骨缺损时，术后容易暴露从而导致感染失败。因此，开发一种具有电活性钛支架增强复合膜，是目前引导骨再生技术的重要需求。
7.背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

8.为解决现有技术中的技术问题，本发明提供电活性钛支架增强复合膜及其制备方法。本发明所提供的电活性钛支架增强复合膜在宏观性能和微观结构上均具有良好的性能，在骨修复过程中，为新骨再生提供充足的三维空间，促进成骨。此外可以根据牙位不同进行相应弯曲塑型，与对应牙槽骨硬组织紧密贴合，同时具有优异的力学性能和稳定仿生量级电活性，可促进骨髓间充质干细胞黏附、细胞骨架重排和成骨分化，显著提升垂直骨增量效果。具体地，本发明包括以下内容。
9.本发明的第一方面，提供一种电活性钛支架增强复合膜，所述复合膜具有四边形
或大致为四边形的轮廓，且所述四边形的每个角或其附近设置有固定所述复合膜的固定位点；所述复合膜包括：钛支架和包覆所述钛支架的膜材料，其中，所述钛支架由厚度20-500μm的钛基材料组成且具有根据所述固定位点设计的结构；所述钛支架包括：主架和连接在所述主架两侧的呈分叉结构的次架，所述次架包括呈一定角度的第一分支结构和第二分支结构，且所述分叉结构的末端位于所述固定位点或位于所述固定位点附近位置。
10.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述高分子材料层包括第一层和第二层，且通过所述第一层和所述第二层包覆所述钛支架，所述钛支架在所述复合膜中的面积占比(覆盖面积占比)为0.6-1。
11.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述主架沿长度方向延伸，所述次架沿宽度方向延伸，所述主架为细长的条状结构，且所述角度为20-30度，由此使所述钛支架形成中间细、两端宽的哑铃型。
12.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述钛支架具有分别沿长度方向和沿宽度方向对称的结构。
13.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述钛支架的长宽比为2-4:1，且所述主架的长度与所述次架的宽度之比为0.9-2:1。
14.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述钛支架进一步包括位于所述主架中间且与所述主架实质上垂直的横架。
15.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述次架进一步包括位于所述第一分支结构和所述第二分支结构之间的第三分支结构，且所述第三分支结构沿所述主架方向延伸，由此使所述钛支架形成米字型。
16.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述钛支架进一步包括分别位于所述主架两端且分别与所述主架实质上垂直的两个横架，从而使所述钛支架形成滑翔机型。
17.根据本发明所述的电活性钛支架增强复合膜，优选地，所述主架和所述次架的分支结构具有相同的宽度。
18.优选地，所述复合膜通过使钛支架复合于高分子材料层内部，经退火和电晕极化后得到。还优选地，所述第一层和所述第二层各自分别由相同或不同成分组成，且各自分别独立地选自聚酯类、聚偏氟乙烯pvdf、聚偏氟-三氟乙烯p(vdf-trfe)、聚甲基丙烯酸甲酯pmma和聚二甲基硅氧烷中的至少一种。
19.优选地，所述复合膜厚度为100-500μm，优选100-400μm，更优选100-300μm，如250μm。
20.本发明的第二方面，提供根据第一方面所述的电活性钛支架增强复合膜的制备方法，其包括以下步骤：(1) 使钛支架复合于高分子材料层内部，从而形成膜结构，在对应于钛支架的分叉结构末端分别设置固定位点；(2) 以2.5-4℃/分钟的速率升温至105-145℃，优选110-130℃，更优选120-130℃，保持30-80分钟，优选40-70分钟，更优选60分钟，然后冷却，优选自然冷却至室温；
(3) 采用极化方式进行极化处理，极化处理参数包括极化场强0.1-10kv/mm、极化时间10-60min，即可得到电活性钛支架增强复合膜。
21.本发明的有益效果包括但不限于：(1)本发明通过优化钛支架的结构，在保证机械强度的情况下，降低了钛支架的厚度和面积，减小在粘膜上暴露的风险，实现了支持强度和可塑性的统一，并且优化后的钛支架为细长的支叉状结构，明显提升复合膜的力学性能，包括拉伸强度、弹性模量，并降低弯曲强度，有利于提升材料服役性能和长期稳定性。
22.(2)本发明的复合膜可以根据不同牙位位置对应的牙槽骨形状进行弯曲塑型，与相应牙槽骨硬组织紧密贴合，并且钛支架的边缘线远小于钛网，弯曲后钛支架暴露风险大幅降低。
23.(3)本发明的复合膜通过退火和高压电场极化，从而使复合膜表面带有仿生电位，带电稳定性好，在骨缺损区域构建仿生电学微环境，进而促进骨修复或垂直骨增量。
24.(4)本发明的复合膜具有优异的防组织黏连性能，尤其是动物实验结果显示的ct和组织学检测都是经过方便去除复合膜后的标本，仍然保留所修复组织的完整性，同时复合膜表面未有残留组织，这说明本发明的复合膜可以有效防止组织黏连，因此，克服了现有技术中单纯钛网或现有膨体高分子修复膜材料容易和组织黏连的缺点。
附图说明
25.图1为本发明示例性的哑铃型钛支架的结构示意图。
26.图2为本发明另一示例性的米字型钛支架的结构示意图。
27.图3为本发明另一示例性的滑翔机型钛支架的结构示意图。
28.图4-6为不同形状钛支架的三维有限元分析结果。
29.图7为不同形态钛支架的力学性能表征结果。
30.图8-11为钛支架在聚合物基体中的面积占比优化模拟结果。
31.图12为本发明钛支架的实物图。
32.图13为本发明电活性钛支架增强复合膜的实物图。
33.图14为不同厚度、不同退火时间的电活性钛增强复合膜压电常数测试结果。
34.图15为不同界面处理的钛增强复合膜压电常数对比结果。
35.图16-17为电活性钛增强复合膜材料的力学性能表征(图16拉伸强度；图17左：弹性模量；右：弯曲强度)。
36.图18-20为电活性钛增强复合膜材料的电响应性评价结果(图18极化；图19未极化；图20极化与未极化对比)。
37.图21为钛增强复合膜压电常数时序性监测结果。
38.图22为黏着斑的免疫荧光图像。其中白色虚线表示细胞核，黏着斑的纵列的图中示出为黏着斑荧光图像，f-actin的纵列的图中示出了细胞骨架荧光图像。
39.图23为细胞面积、黏着斑的面积和数量的定量分析结果(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
40.图24为电活性钛增强复合膜诱导bmscs成骨分化表达bmp-2免疫荧光结果。
41.图25为电活性钛增强复合膜促进骨髓间充质干细胞成骨基因表达结果(*p《
0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
42.图26为比格犬牙槽骨骨增量手术过程。
43.图27为电活性钛支架增强复合膜植入1个月后的μct结果。
44.图28为电活性钛支架增强复合膜植入3个月后的μct结果。
45.图29为电活性钛支架增强复合膜促进垂直骨增量的μct定量分析结果(*、#分别表示与blank空白组、ti-p(vdf-trfe)相比有统计学差异，p《0.05)。
46.图30为植入钛增强复合膜3个月后的h&e染色结果，a、b、c和d为圈选区域的高倍镜视野。(a)牙槽嵴顶左侧；(b)牙槽嵴顶顶端；(c)牙槽嵴顶右侧和(d)牙槽嵴中央。(nb：新骨；ob：旧骨。放大倍数
×
100)。
47.图31为植入钛增强复合膜3个月后的masson染色结果。a、b、c和d为圈选区域的高倍镜视野。(a)牙槽嵴顶左侧；(b)牙槽嵴顶顶端；(c)牙槽嵴顶右侧和(d)牙槽嵴中央。(nb：新骨；ob：旧骨。放大倍数
×
100)。
48.图32为市售商品钛网复合膜结构图。
49.图33-36为市售商品钛网复合膜与本发明支架复合膜的力学性能比较结果。拉伸模量和弹性极限和弹性模量数据显示，钛支架复合膜高于商品钛网复合膜，因此在临床手术操作和骨愈合过程中，钛支架复合膜不易产生金属和有机高分子的撕脱，可以保证复合材料的整体完整性，保证临床手术操作稳定，骨增量过程的可预期；弯曲模量变低表明更容易根据临床要求及骨形态塑型。
50.附图标记说明：图1的哑铃型钛支架：110-主架、120-次架、121-第一分支结构、122-第二分支结构、123-第三分支结构、124-第四分支结构；图2的米字型钛支架：210-主架、211-横架、220-次架、221-第一分支结构、222-第二分支结构、223-第三分支结构；图3的滑翔机钛支架：310-主架、311-第一横架、312-第二横架、320-次架、321-第一分支结构、322-第二分支结构。
具体实施方式
51.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
52.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
53.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。
54.本文中，术语“钛支架”是指使用时位于复合膜内部用于支撑复合膜的支架结构。已知在复合膜中力学性能受到钛支架影响。一般而言，在复合膜中钛支架的面积占比越小，复合膜的力学支撑性能越差。本发明的钛支架通过优化具有最小的面积占比，同时还具有最佳的力学支撑。钛支架由钛基材料的钛片组成，只要能够实现在超薄厚度条件下具有所需的弹性模量和所需的抗弯强度，对于钛基材料可以不特别限定，但优选使用纯钛片或钛合金。纯钛片中钛的纯度一般为99.90以上，优选99.95%以上，更优选99.99%以上。此类纯钛片的实例包括但不限于四级纯钛版、五级纯钛板。钛合金的实例包括但不限于钛锆合金、钛镁合金等。
55.本文中，钛支架厚度相对于目前引导骨再生术中普遍使用的钛片厚度而言具有更薄的厚度。一般而言厚度为10-300μm，例如20-200μm、20-250μm，优选25-150μm，如100μm、80μm、50μm等。目前医用纯钛网的厚度一般为200μm以上，但本技术的可以达到100μm以下，优选80μm、50μm以下，更优选30μm以下，进一步优选20μm以下。另一方面，一般需要10μm以上，从而能够提供所需的力学性能，并确保与高分子材料的变形应力保持基本一致，进而实现与高分子材料层的高度贴合。本发明的钛支架如果厚度过大，一方面不容易缝合，从软组织中暴露可能性加大，造成感染。另一方面，弯曲强度变大，当与高分子膜复合后，其变形应力与高分子膜变形应力不一致，高分子膜不能有效包裹支架，在使用时容易与高分子膜分层。
56.本文中，术语“所需的弹性模量”是指颌骨缺损修复时能够有效弯曲的弹性模量。同时该弹性模量范围还与缺损修复时使用的高分子材料的模量相当。该模量一般在0.05-0.5gpa，优选0.1-0.4gpa，更优选0.2-0.35gpa。此处，弹性模量通过使用万能试验机测量。弹性模量过小，则不利于颌骨缺损修复时对于缺损空间的维持，进而不利于骨缺损的修复，甚至可能发生术后折叠塌陷，影响骨再生。如果模量过大，一方面与修复时使用的高分子材料的模量可能不匹配，另一方面，对于修复部分产生过高应力，不容易关闭软组织，金属容易暴露，引发感染。
57.本文中，术语“所需的抗弯强度”是指骨缺损修复时能够有效弯曲而不断裂的强度。该强度一般在10-100mpa，优选12-80mpa，还优选13-50 mpa，更优选15-20 mpa。该抗弯强度范围能够为复合膜能够有力支撑，维持稳定的空间。
58.本文中，术语“复合膜”是指电活性钛支架增强复合膜，有时也可称作电响应性骨缺损修复膜，其用于维持骨缺损区域的空间，为骨修复提供骨诱导性生长空间，特别是适用于牙槽骨增量，为牙种植修复提供条件的膜材料，其包括高分子材料和由其包裹的钛支架。复合膜的厚度一般为100-500μm，优选120-400μm，更优选150-300μm。复合膜的形状不特别限定，根据临床用途可以设计任意形状。在示例性实施方案中，复合膜为条形，对应于条形的四个角或其附近设置固定位保留固定区域。复合膜包括钛支架和包覆所述钛支架的膜材料，下面进行详细说明。
59.钛支架本技术的钛支架用于制备骨增量时使用的复合膜，其具有根据复合膜使用时的固定位点而设计的全方位力学支撑结构。
60.本技术中，钛支架一般包括沿长度方向延伸的主架和沿宽度方向延伸的次架。次架一般为两个，分别位于主架的两端。次架由分支结构构成。每个次架中分结构的数量不限定，但至少包括第一分支结构和第二分支结构。如果存在其它分支结构，其设置于第一分支
结构和第二分支结构之间。第一分支结构和第二分支结构之间的夹角不特别限定，但是确保第一分支结构的末端和第二分支结构的末端分别对应于复合膜的固定位点或其周边或附近。为此，优选的夹角一般在20-40度之间，优选22-38度之间，更优选24-26度之间。
61.优选地，本发明的钛支架整体的宽度为8-18mm，长度为18-28mm。还优选地，本发明的钛支架整体的宽度为9-15mm，长度为19-25mm。
62.本发明中，主架和次架分别由钛片或钛细条构成，且构成主架的钛片与构成分支结构的钛片具有相同的宽度，其宽度优选为0.25mm-3mm，还优选为0.35-1.5mm。
63.本发明的钛支架可以是平整结构，也可以是定制的或预先弯曲结构。
64.在示例性实施方案中，可选地，钛支架可以进行表面处理或表面修饰，例如多巴胺表面修饰或钛支架表面粗糙化等。进一步优选地，多巴胺表面修饰可以采用多巴胺通过化学氧化聚合、酶催化氧化聚合、电化学聚合或光聚合等方法形成聚合在钛支架表面的多巴胺膜，以提高钛支架的生物相容性并促进骨形成。更重要的是，其加强钛支架与高分子材料层的结合作用或粘结强度，从而在膜结构用于骨增量时，即使在弯曲的情况下彼此不会发生分离。在具体实施方案中，将钛支架加入到0.01-0.1mol/l的多巴胺水溶液中，并在40℃-80℃下搅拌6h-12h，然后再超声震荡1min-15min，离心洗涤3-5次，然后在功率为180w的条件下超声1-10min，得到多巴胺处理的钛支架。
65.在示例性实施方案中，优选地，表面粗糙化处理可以使用喷砂-酸蚀方法进行处理。例如，将钛支架先用sio2颗粒在0.4mpa压力条件下进行喷砂处理，然后用10%的h2so4与10%的hcl混合液在60℃恒温条件下酸蚀30min。
66.在示例性实施方案中，本技术的钛支架为哑铃型或大致为哑铃型，其特别适用于制备长方形复合膜，此时的钛支架优选为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架和沿宽度方向延伸的两个次架。
67.主架为细长的条状结构，两个次架分别位于主架的两端，由此形成哑铃型或大致为哑铃型。该结构具有上下对称结构和左右对称结构。每个次架分别由两个分支结构构成。每两个分支结构所形成的角度为25度。主架的长度大致为次架宽度(即两个分支结构末端之间的距离)的2倍。
68.基于哑铃型钛支架制备的修复膜在使用时，在对应于第一分支结构、第二分支结构、第三分支结构和第四分支结构的位置设置固定位点。固定位点可以设置固定孔。例如，在固定位点可设置有固定件通过的通孔，固定件的实例包括但不限于固定螺栓等。基于哑铃型钛支架的修复膜特别适用于单颗前牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是复合膜两端沿钛支架任一对称轴方向进行弯曲使用。
69.在另外的示例性实施方案中，本技术的钛支架为米字型，其特别适用于制备长方形复合膜，优选钛支架为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架和沿宽度方向延伸的两个次架。
70.主架为细长的条状结构钛片，两个次架分别位于主架的两端。每个次架分别由第一分支结构、第二分支结构第三分支结构三个钛片构成，其中第一分支结构和第二分支结构之间的夹角为25度，第三分支结构与主架对接，并形成为主架延伸端。延伸端的长度与第一分支或第二分支结构的长度相等或大致相等。
71.此外，在主架中间沿垂直于主架方向上进一步设置有横架。横架的长度与主架的
长度基本相等。主架的长度大致为次架宽度(即第一分支结构和第二分支结构末端之间的距离)的2倍。
72.基于米字型钛支架制备的用于牙槽骨垂直增量修复膜，在使用时在对应于第一分支结构、第二分支结构以及与这两个分支结构对称的另一端的两个分支结构的位置设置固定位点。基于米字型钛支架的修复膜特别适用于单颗后牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是两端沿钛支架任一对称轴方向进行弯曲使用。
73.另外的示例性实施方案中，本技术的钛支架为滑翔机型，其特别适用于制备长方形复合膜，优选为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架和沿宽度方向延伸的两个次架。
74.主架为细长的条状结构钛片，两个次架分别位于主架的两端。每个次架分别由第一分支结构和第二分支结构两个钛片构成，其中第一分支结构和第二分支结构之间的夹角为25度。
75.在主架中间沿垂直于主架方向上进一步设置有第一横架和第二横架。第一横架的长度与第二横架的长度相等，优选地，均与主架的长度基本相当。主架的长度大致为次架宽度(即第一分支结构和第二分支结构末端之间的距离)的2倍。
76.基于滑翔机型钛支架制备的用于牙槽骨垂直增量修复膜在使用时在对应于次架的四个分支结构的位置设置固定位点。基于滑翔机型钛支架的修复膜特别适用于多颗相邻前/后牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是两端沿钛支架任一对称轴方向进行弯曲使用。
77.膜材料本发明所用的膜材料为高分子材料层，其中高分子材料包括pvdf及其衍生物、胶原或壳聚糖，优选为pvdf及其衍生物，其实例包括但不限于聚酯类、聚偏氟乙烯pvdf、聚偏氟-三氟乙烯p(vdf-trfe)、聚甲基丙烯酸甲酯pmma和聚二甲基硅氧烷。钛支架两侧的高分子材料层可以是同一种成分，也可以是不同成分。在某些实施方案中，高分子材料层可以是致密的，从而防止细菌通过或结缔组织细胞和上皮细胞从中迁移。在另外的实施方案中，高分子材料层含有微孔，可以让氧气或血液通过，但同时防止细菌通过或结缔组织细胞和上皮细胞从中迁移。优选地，所述膜材料与本发明的钛支架形成紧密结合。
78.制备方法本技术的第二方面，提供电活性钛支架增强复合膜的制备方法，其至少包括：(1) 使所述钛支架复合于高分子材料层内部，从而形成膜结构，且在对应于分叉末端的位置或其附近设定固定所述膜结构的位点或区域；(2) 以2.5-4℃/分钟的速率升温至105-145℃，优选110-130℃，更优选120-130℃，保持30-80分钟，优选40-70分钟，更优选60分钟，然后冷却，优选自然冷却至室温；(3) 采用极化方式进行极化处理，极化处理参数包括极化场强0.1-10kv/mm、极化时间10-60min，即可得到电活性钛支架增强复合膜。
79.步骤(1)中，钛支架可通过已知方式进行，例如通过切割设备如激光显微切割机器进行。切割钛基材的厚度一般为20-500μm，例如20-400μm，优选20-200μm。在使用较高厚度的钛基材时，优选首先对基材进行薄化处理，例如蚀刻处理。蚀刻处理一般会对钛支架表面粗糙化，从而增强对高分子材料层的随着力，因而是优先的。
80.步骤(2)中为退火处理，通过上述退火辅助电极极化，所得复合膜材料带电均匀稳定。复合膜材料表面的温度升高可以产生热释电效应，并且电极极化可以使材料内部电荷沿一定方向发生极化偏转。原因可能在于受热和冷却后，由于温度的变化导致晶体在某一特定方向上产生表面电荷，并且极化偶极矩能随外施电场的方向而改变。
81.步骤(3)中通过高压电场极化，使复合膜表面带有仿生电位，在损伤区域构建仿生电学微环境。极化条件包括极化场强0.1-10kv/mm，优选1-5kv/mm，例如2v/mm、3v/mm、4v/mm；极化时间5-60min，优选10-50min，更优选15-40min，例如，20、25、30、35min等。
82.在具体实施方案中，首先将钛片基材表面去除油污和灰尘，保持钛片基材表面光洁，并置于待切割样品台。然后设计上述的哑铃型、米字型或滑翔机型三维模型文件。根据三维模型文件设定切割过程的行走路线，其中行走路线构成上述的哑铃型、米字型或滑翔机型，从而机械手沿哑铃型、米字型或滑翔机型的边缘进行切割。进行激光切割的工艺参数不特别限定，例如切割速度、激光功率、气体压力、离焦量、工作距离、切割气体等参数本领域技术人员可以根据需要进行调整。
83.形成膜结构的过程优选通过下述步骤实现：称取铁电高分子聚合物，加入到有机溶剂dmf中，搅拌3h-6h至完全溶解，得到聚合物溶液；所得溶液的浓度为1-5g/ml；所述铁电高分子聚合物为聚偏氟乙烯或聚偏氟-三氟乙烯；将聚合物溶液真空除气泡后，倒在石英板上烘干，待有机溶剂完全挥发后，可以得到厚度10-500μm的高分子膜；将钛支架或多巴胺处理后的钛支架置于两张高分子膜之间，使用例如dmf溶解表层高分子将上下两层膜粘接，经热压处理待两者充分结合后得到复合膜材料。
84.需要注意的是，在对应于所述分叉末端的位置或其附近固定所述膜结构，从而在所述膜结构的四个角或其附近位置形成固定位点，在满足应力情况下为新骨再生提供充足的三维空间，促进成骨。示例性固定位点与支架末端的关系，参见下述：由于滑翔机型钛支架两端的支撑较多，有利于应力从受力点传导到两端的固定螺栓上，所以滑翔机型钛支架整体上刚度更高。哑铃型与米字型结构类似，横架虽然加入到了米字型结构，但横架两侧通常不会加入固定螺栓，无法传导应力，所以帮助并不明显，甚至因为跟随变形，导致刚度更低。
85.本发明中，优选采用分步浇铸法构建电活性钛增强复合膜，通过调控退火和极化处理条件，实现钛增强复合膜的仿生带电。还优选地，极化处理参数为：极化场强1kv/mm、极化时间30min，即可得到电活性钛支架增强复合膜。
86.本发明中，材料的力学性质测定，例如拉伸模量、抗弯强度、弹性模量等可以通过本领域已知的测定方法进行测定。
87.实施例1本实施例为电活性钛支架增强复合膜的制备，具体如下：(1)将纯钛板固定在夹具上，保证平整；(2)按照设计好的三维模型文件，利用激光进行切割；(3)将步骤(2)获得的钛支架在去离子水中超声清洗3次，每次5min；再放入无水乙醇中超声清洗3次，每次5min。烘干。即得到一种钛支架，其中钛支架为哑铃型、米字型或滑翔机型之一。
88.哑铃型支架如图1和图12所示，其为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架
110和沿宽度方向延伸的两个次架120。主架110为细长的条状结构，两个次架120分别位于主架110的两端，由此形成哑铃型。该结构具有上下对称结构和左右对称结构。每个次架120分别由两个分支结构构成。如上方次架120由第一分支结构121和第二分支结构122构成。下方次架120由第三分支结构123和第四分支结构124构成。每两个分支结构所形成的角度为25度。主架110的长度大致为次架宽度(即两个分支结构末端之间的距离)的2倍。
89.基于哑铃型钛支架制备的用于牙槽骨垂直增量修复膜在使用时在对应于第一分支结构121、第二分支结构122、第三分支结构123和第四分支结构124的位置设置固定位点。基于哑铃型钛支架的修复膜特别适用于单颗前牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是两端向任一对称轴方向进行弯曲使用。
90.米字型钛支架如图2和图12所示，其为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架210和沿宽度方向延伸的两个次架220。主架210和次架220均由宽度相同的钛片构成。主架210为细长的条状结构钛片，两个次架220分别位于主架210的两端。每个次架220分别由第一分支结构221、第二分支结构222和第三分支结构223三个钛片构成，其中第一分支结构221和第二分支结构222之间的夹角为25度，第三分支结构与主架210对接，并形成为主架210延伸端。在主架210中间沿垂直于主架210方向上进一步设置有横架211。横架211的长度与主架210的长度基本相等。主架210的长度大致为次架220宽度(即第一分支结构221和第二分支结构222末端之间的距离)的2倍。
91.基于米字型钛支架制备的用于牙槽骨垂直增量修复膜在使用时在对应于第一分支结构221、第二分支结构222以及与这两个分支结构对称的另一端的两个分支结构的位置设置固定位点。基于米字型钛支架的修复膜特别适用于单颗后牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是两端向任一对称轴方向进行弯曲使用。
92.滑翔机型钛支架如图3和图12所示，其为一体成型结构，包括沿长度方向延伸的主架310和沿宽度方向延伸的两个次架320。主架310和次架320均由宽度相同的钛片构成。主架310为细长的条状结构钛片，两个次架320分别位于主架310的两端。每个次架320分别由第一分支结构321和第二分支结构322两个钛片构成，其中第一分支结构321和第二分支结构322之间的夹角为25度。在主架310中间沿垂直于主架310方向上进一步设置有第一横架311和第二横架312。第一横架311的长度与第二横架312的长度相等，均与主架310的长度基本相当。主架310的长度大致为次架320宽度(即第一分支结构321和第二分支结构322末端之间的距离)的2倍。
93.基于滑翔机型钛支架制备的用于牙槽骨垂直增量修复膜在使用时在对应于次架320的四个分支结构的位置设置固定位点。基于滑翔机型钛支架的修复膜特别适用于多颗相邻前/后牙缺失后的修复。使用时可以沿任意方向，特别是两端向任一对称轴方向进行弯曲使用。
94.(4)将一定量pvdf或其衍生物如p(vdf-trfe)倒入2ml有机溶剂dmf中溶解并搅拌12小时混匀，真空除气泡后，倒在石英板上烘干，待有机溶剂完全挥发后，可以得到厚度50μm的高分子膜。
95.(5)在高分子膜还未完全干时，将步骤(2)获得的钛支架放置于步骤(4)获得的高分子层上，之后再倒入混合溶液，使上下两层膜完全包裹钛支架，两者充分结合，得到钛支架增强复合膜。
96.(6)将步骤(5)获得的钛支架增强复合膜，以3.3℃/分钟速率升温至120℃后，保持60分钟，然后自然冷却至室温。通过此退火辅助电晕极化方式进行极化处理，极化处理参数为：极化场强1kv/mm、极化时间30min，即可得到电活性钛支架增强复合膜(如图13所示)。
97.(7)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的电活性钛支架增强复合膜上，通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化通过免疫荧光显微镜重点观察粘附指标(粘着斑蛋白)和成骨指标(骨形态发生蛋白)的蛋白变化，可以观察到电活性钛支架增强复合膜表面的骨髓来源间充质干细胞的粘着斑蛋白和骨形态发生蛋白显著高表达，之后将通过实施例1制备的材料应用于比格犬临界颌骨缺损处，通过micro ct定量分析和h&e染色观察三个月时的骨再生效果，可以观察到电活性钛支架增强复合膜覆盖的缺损区域有大量新骨再生。
98.实施例2本实施例为另一示例性的电活性钛支架增强复合膜的制备，与实施例1不同的是，步骤(2)中采用冲压法进行加工，步骤(5)中采用热压方式使两张高分子材料层充分结合，步骤(6)中极化处理参数为：极化场强2 kv/mm、极化时间10 min。支架为滑翔机型。
99.可以观察到电活性钛支架增强复合膜表面的骨髓来源间充质干细胞的粘着斑蛋白和骨形态发生蛋白显著高表达，之后将通过实施例2制备的材料应用于比格犬临界颌骨缺损处，通过micro ct定量分析和h&e染色观察三个月时的骨再生效果，可以观察到电活性钛支架增强复合膜覆盖的缺损区域有大量新骨再生。
100.实施例3本实施例为另一示例性的电活性钛支架增强复合膜的制备，与实施例1不同的是，步骤(2)中采用线锯进行切割，步骤(6)中极化处理参数为：极化场强5 kv/mm、极化时间60 min。支架为滑翔机型。
101.可以观察到电活性钛支架增强复合膜表面的骨髓来源间充质干细胞的粘着斑蛋白和骨形态发生蛋白显著高表达，之后将通过实施例3制备的材料应用于比格犬临界颌骨缺损处，通过micro ct定量分析和h&e染色观察三个月时的骨再生效果，可以观察到电活性钛支架增强复合膜覆盖的缺损区域有大量新骨再生。
102.实施例4本实施例为另一示例性的电活性钛支架增强复合膜的制备，与实施例1不同的是，步骤(2)中采用金属3d打印技术进行加工，支架为滑翔机型。钛表面进行粗糙化处理，且步骤(5)中采用热压方式使两张高分子材料层充分结合，步骤(6)中极化处理参数为：极化场强10 kv/mm、极化时间60 min。
103.实施例5本实施例为另一示例性的电活性钛支架增强复合膜的制备，与实施例1不同的是，步骤(2)中采用金属3d打印技术进行加工，支架为滑翔机型。钛表面进行多巴胺处理，且步骤(5)中采用热压方式使两张高分子材料层充分结合，步骤(6)中极化处理参数为：极化场强10 kv/mm、极化时间60 min。
104.比较例1本比较例与实施例1不同的是，步骤(6)中不进行退火和极化处理。
105.将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的钛支架增强复合膜上，
通过对比例1制备的材料诱导干细胞成骨分化通过免疫荧光显微镜重点观察粘附指标(粘着斑蛋白)和成骨指标(骨形态发生蛋白)的蛋白变化，可以观察到钛支架增强复合膜表面的骨髓来源间充质干细胞不能更好的诱导干细胞铺展粘附及成骨分化，之后将通过对比例1制备的材料应用于比格犬临界颌骨缺损处，通过micro ct定量分析和h&e染色观察三个月时的骨再生效果，可以观察到只有少量新骨生成。
106.比较例2本比较例与实施例1不同的是，制备过程不进行步骤(4)的高分子膜制备。
107.将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的钛支架上，通过对比例3制备的材料诱导干细胞成骨分化通过免疫荧光显微镜重点观察粘附指标(粘着斑蛋白)和成骨指标(骨形态发生蛋白)的蛋白变化，可以观察到钛支架表面的骨髓来源间充质干细胞不能更好的诱导干细胞铺展粘附及成骨分化，之后将通过对比例2制备的材料应用于比格犬临界颌骨缺损处，通过micro ct定量分析和h&e染色观察三个月时的骨再生效果，可以观察到只有少量新骨生成。
108.测试例1本测试例对不同形状钛支架的受力情况进行了三维有限元分析，结果如图4-6所示。研究结果表明，对于哑铃型支架，其法向刚度取决于主架的长度以及次架与主架的夹角，主架与次架的夹角越小，主架的长度越长，在30度角以上的区域变化较为缓慢，25度角主架具有更高的刚度。对于米字型支架，中间增加横架，同时，两端增加了中间的支撑，刚度更高。类似于单个前牙的特点，较长的主架、较小的角度(25度角)提升了结构的法向刚度。对于滑翔机型支架，能够抵抗较大侧向力及垂直向力，横架接近于两端时(30度角)，其刚度更高。
109.由于滑翔机型钛支架两端的支撑较多，有利于应力从受力点传导到两端的固定螺栓上，所以滑翔机型钛支架整体上刚度更高。哑铃型与米字型结构类似，横架虽然加入到了米字型结构，但因横架两侧通常不会加入固定螺栓，无法传导应力，所以帮助并不明显，甚至因为跟随变形，导致刚度更低。针对以上三种形态的钛支架进行仿真模拟，在相同尺寸的钛支架中央加载相同的法向载荷，其法向刚度分别为66.2、60.9和83.9n/mm，可见滑翔机型钛支架具备最高的法向刚度，滑翔机型钛支架预期产生最佳的力学支撑效果。
110.测试例2本测试例为钛支架的力学性能表征，结果如图7所示。图7中左图为不同形态钛支架拉伸强度结果，右图是不同形态钛支架弯曲强度结果。适用于后牙区缺损修复的米字型钛支架和滑翔机型钛支架的力学性能包括弯曲强度和拉伸强度均显著高于哑铃型钛支架。钛支架复合膜与商品钛网复合膜的性能比较数据，结果如图33-36所示，哑铃型、米字型、滑翔机型复合膜与商品钛网复合膜相比，滑翔机型复合膜的弹性模量、断裂伸长率、抗拉强度、弹性极限比商品钛网复合膜高。不同形态仿生电活性钛增强复合膜的抗弯强度比商品钛网复合膜低。传统钛网制备成的复合膜由于强度过大不易弯曲，在临床应用中不容易根据骨缺损外形进行塑型，同时钛网与高分子的结合效果差、容易发生钛网暴露。
111.测试例3由于钛支架的机械强度远大于铁电聚合物p(vdf-trfe)基体，因此仿生电活性钛增强复合膜的机械强度主要取决于钛支架。根据前述研究确定滑翔机型钛支架的力学性能
最佳，故用于仿生电活性的钛增强复合膜材料的设计构建。
112.为了探究电活性钛增强复合膜的力学性能受钛支架在铁电聚合物膜中的面积占比所影响，对钛支架在聚合物膜中的面积占比进行了设计优化，经过模拟计算，发现在电活性钛增强复合膜中钛支架占比越小，复合膜的力学支撑越差，其比例与力学强度呈现非线性负相关，占比为1:1时其力学支撑最佳(图8-11)。
113.测试例4本测试例对钛支架在复合膜中的厚度进行了性能优化，通过设置不同厚度钛支架，制备成钛支架复合膜，极化处理后测量d
33
，综合考虑材料带电性(成骨诱导性)和塑形性(维持骨缺损区的形态)，选择50
µ
m厚的钛箔进行后续实验。在此基础上，本发明对钛增强复合膜的总体厚度进行优化筛选，分别制备出厚度为100μm、150μm和180μm的钛增强复合膜，设置退火时间分别为0、15、30、45和60min，对其压电常数进行检测，发现膜厚为150微米在退火时间为60min条件下其压电常数最高(图14)，且电学水平符合生理量级范围，故将该参数条件作为后续研究最佳参数。
114.测试例5本测试例对钛支架在聚合物基体中的界面性能进行了优化处理，以进一步提升钛支架与聚合物基体的兼容性，以提升材料电学稳定性。采用绝缘处理剂对将钛支架表面进行绝缘处理，与未绝缘处理相比，结果发现非绝缘处理组的d
33
显著高于绝缘处理组(图15)，且其压电常数d
33
符合仿生量级水平。
115.测试例6本测试例为电活性钛支架增强复合膜的理化性能研究。
116.1. 电活性钛支架增强复合膜的力学性能钛支架与电活性膜材料复合不仅可以赋予材料良好的可塑性，而且还可有效提升材料的力学性能，起到更好的力学支撑作用。本发明对不同处理工艺的电活性钛增强复合膜的力学性能进行系统表征，结果显示，退火处理及其结合电晕极化处理均可以明显提升复合膜的力学性能，包括拉伸强度、弹性模量和弯曲强度(图16-17)。
117.2. 电活性钛支架增强复合膜材料的电学性能2.1 电活性钛支架增强复合膜材料的力电响应性为进一步考察电活性钛增强复合膜的电学响应性，本发明对电活性钛增强复合膜的力电响应性进行评价，首先将钛增强复合膜固定在聚丙烯酰胺上，在其上下表面制备电极，采用加载马达对样品进行往复弯折运动，利用示波器表征材料的电压信号输出情况，可以看到，极化后的钛网增强复合膜表现出更强的电压输出信号(图18-20)。
118.2.2 电活性钛支架增强复合膜材料的电学稳定性考虑到电活性钛增强复合膜材料植入缺损处需要一段时间修复缺损，因此评价电活性钛增强复合膜的电学稳定性对其骨诱导功能至关重要。本发明采取体外37℃条件下在无血清细胞培养基中孵育的方式模拟体内生理条件，在不同时间点取出材料样品进行压电常数检测，结果显示，退火结合电晕极化处理后的电活性钛增强复合膜压电常数d
33
为6-9 pc/n，符合骨组织生理压电常数量级水平，且将电活性钛增强复合膜在体外模拟胜利条件下孵育28天后，其压电常数d
33
仍保持良好的电学稳定性(图21)。
119.3. 电活性钛支架增强复合膜的体外生物学性能评价
3.1 电活性钛支架增强复合膜材料促进bmscs黏附和细胞骨架重排为评价电活性钛增强纳米复合膜材料对bmscs早期粘附的促进作用，本发明对黏着斑(vinculin)和细胞骨架(f-actin)进行染色。首先将骨髓间充质干细胞接种至材料表面6小时后观察细胞铺展面积及细胞黏附状态，使用4%多聚甲醛固定细胞，0.3% triton-x100对细胞进行通透化处理，接着使用3% bsa封闭细胞非特异性结合位点，然后加入黏着斑抗体标记特异性抗原，dapi标记细胞核，fritc标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白细胞骨架。处理后的样本在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果显示，极化的钛增强复合膜和极化的p(vdf-trfe)纯膜表面bmscs黏着斑形成增强，细胞铺展呈多角形，铺展面积增加，均优于未极化钛增强复合膜组(图22和23)。结果表明，电活性钛增强复合膜材料可明显促进骨髓间充质干细胞的粘附和细胞骨架重组，有利于间充质干细胞后期的成骨功能分化。黏着斑作为细胞与材料接触的重要媒介，对于之后的细胞黏附、增殖和功能分化具有重要意义。
120.3.2 电活性钛支架增强复合膜材料诱导bmscs成骨分化为了探索电活性钛支架增强复合膜对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，本发明利用免疫荧光技术对成骨分化相关标志物进行了蛋白水平的检测。将大鼠骨髓间充质干细胞与电活性钛增强复合膜共培养3天后，利用免疫荧光对细胞成骨分化标志物bmp2进行了检测。使用4%多聚甲醛固定细胞，0.3% triton-x100对细胞进行通透化处理，接着使用3% bsa封闭细胞非特异性结合位点，然后加入bmp2抗体标记特异性抗原，dapi标记细胞核，fitc标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白细胞骨架。处理后的样本在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果显示，极化钛增强复合膜和极化纯膜均可促进bmp2高表达(图24)，结果表明电活性钛增强复合膜可以促进间充质干细胞成骨分化。
121.本发明在基因水平进一步检测了成骨分化标志物。将骨髓间充质干细胞与电活性钛增强复合膜共培养4天和10天后，通过实时荧光定量pcr对大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因(runx2、bmp2、alp、opn)的表达水平进行检测。结果显示，在第4天时极化的钛增强复合膜促进runx2和bmp2高表达，而成骨基因alp和opn的表达量在第10天明显上调(图25)，表明电活性钛增强复合膜显示出优异的成骨诱导活性，在早期和中晚期都均可有效诱导间充质干细胞成骨分化。
122.4. 电活性钛支架增强复合膜促进骨缺损修复效果的评价4.1 比格犬牙槽骨垂直骨增量模型构建及材料植入本发明以比格犬为实验动物模型，构建牙槽骨拔牙后垂直骨增量模型。取10只12月龄健康雄性比格犬，术前12小时禁食，小型猪行速眠新 戊巴比妥钠复合麻醉。全身麻醉起效后，常规备皮、消毒、铺巾。术区4%阿替卡因肾上腺素注射液局部麻醉，分龈，沟内切口 垂直切口切开牙龈，翻全厚瓣，动力系统自根分叉区将前磨牙分为近远中两部分，牙周膜分离器离断牙周膜，微创牙钳牙合向牵引拔牙，搔刮牙槽窝，无菌生理盐水冲洗，制备受植床。术后动物清醒方可进食。15天内予以流食，饭后喂清水，每周前3天服用镇痛药物(布洛芬/曲马多，50 mg/ml，3 mg/kg q12 h)，前5天服用抗炎药物(美洛西康，2 mg/20 kg)，前10天服用抗生素(螺旋霉素750,000 iu/10 kg和甲硝唑125 mg/10 kg)。0.12% 氯己定漱口控制菌斑，避免影响伤口愈合。拔牙术后3个月，在双侧下颌骨拔牙位点制备垂直向为8mm、近远中为11mm、颊舌向为10 mm的临界尺寸牙槽骨缺损模型(图26)，然后填充bio-oss骨粉，覆盖实验膜材料，以单纯带电膜p(vdf-trfe)膜和国外商品膜钛增强ptfe复合膜为对照，4-0可
吸收线严密缝合。术后动物清醒方可进食。15天内予以流食，饭后喂清水，每周前3天服用镇痛药物(布洛芬/曲马多，50 mg/ml，3 mg/kg q12 h)，前5天服用抗炎药物(美洛西康，2 mg/20 kg)，前10天服用抗生素(螺旋霉素750,000 iu/10 kg和甲硝唑125 mg/10 kg)。0.12% 氯己定漱口控制菌斑，避免影响伤口愈合。在植入材料术后4周及12周，以致死量注射戊巴比妥钠处死动物，取动物下颌骨标本经10%中性福尔马林溶液固定，以备后续检测。
123.4.2 电活性钛支架增强复合膜体内植入后的μct分析从μct结果可以看到，电活性钛支架增强复合膜组的垂直骨增量与新生骨量，都比其余三组有显著提升(图27和28)。统计学分析结果显示，术后一个月，空白组、ptfe膜组、p(vdf-trfe)膜组和电活性钛支架增强复合膜组四组的垂直骨增量分别是1.36mm、2.07mm、1.80mm和3.86mm，四组的新生骨量分别是57.7 mm3、96.9 mm3、102.8 mm3、107.4 mm3，电活性钛支架增强复合膜的垂直骨增量和新生骨量均比其余三组有显著提升。术后三个月，四组的垂直骨增量分别是2.01mm、3.35mm、3.64mm和5.81mm，四组的新生骨量分别是136.3 mm3、220.5 mm3、226.1 mm3和274.2mm3，三组材料组的垂直骨增量和新生骨量均比空白组有显著提升，同时电活性钛增强复合膜组的垂直骨增量和新生骨量与纯膜组和ptfe组相比也有显著提升。电活性钛支架增强复合膜组较植入前骨增量增加了72.6%，较ptfe产品膜组的骨增量提高了24.32%，显著提升垂直骨增量效果(图29)。
124.众所周知，垂直骨增量是口腔临床上种植修复中的关键技术难题，本发明在大动物模型上实现了电活性钛增强复合膜良好的骨增量效果，这表明电活性钛支架增强复合膜具有可预期的骨增量效果和良好的临床应用前景。
125.4.3 电活性钛支架增强复合膜促进垂直骨增量的组织学分析组织学染色结果显示(图30和图31)，3个月后植入电活性钛支架增强复合膜的新生骨组织处于重塑阶段，新形成的骨组织已经占据了整个缺损，新骨的矿化更加活跃，形成了更多的板层骨，并且板层骨更厚。纯膜组和钛ptfe组在整个缺损的区域中新形成的骨组织较对比电活性钛增强复合膜膜更少，而空白组的骨缺损处没有填充骨粉，可以发现填充了大量结缔组织，同时可以观察到较少的新生骨组织。此外，本发明的复合膜具有优异的防组织黏连性能，尤其是动物实验结果的显微ct和组织学标本都容易去除复合膜后，仍然保留所修复的骨组织完整性，同时复合膜表面未有残留组织，这说明本发明的复合膜可以有效防止组织黏连，因此，克服了现有技术中单纯钛网或现有膨体高分子修复膜材料容易和组织黏连的缺点。
126.尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。