一种
β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。
背景技术：
2.β-烟酰胺单核苷酸，简称nmn，分子量334.22，分子式c
11h15
n2o8p，结构如下：
3.nmn作为前体可用于合成人体代谢必不可少的辅酶i。研究表明，其对人体细胞修复，减缓衰老有重要作用。近年来，nature、cell等顶级期刊刊登了多篇nmn功效研究的文章，哈佛大学实验证实补充nmn可将哺乳动物寿命延长30％以上，日本、美国等几所大学及企业已相继开展了人体临床实验，nmn被看作是“长生不老药”，倍受保健品药品市场的追捧。
4.现有的nmn生产方法有化工法、酶促法等方法。化工法主要通过缩合、脱乙酰基、磷酸化及氨解等步骤合成nmn，过程较复杂，中间产物较多，后期纯化过程中需使用有机溶剂萃取的方法，污染较严重。酶促法使用酶作为催化剂，反应路线为生物体内固有的nmn合成路线，催化活性高、速度快、专一性强，但是目前如离子交换和过滤等常规方法纯化效果不佳。
5.因此，急需设计一种针对nmn更有效的制备方法以解决上述技术难题。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是提供一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其克服了现有技术的上述缺陷，该方法能快速有效的分离出nmn，产品纯度高。
7.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
8.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)样品预处理：将含有β-烟酰胺单核苷酸(nmn)的溶液进行浓缩，得浓缩液；
10.(2)将步骤(1)得到的浓缩液通过制备液相，分离出nmn部分，所述制备液相的色谱条件如下：
11.色谱柱：填料为氨基键合硅胶；
12.流动相：由无机相和有机相混合得到，无机相为醋酸盐缓冲液，有机相为甲醇；
13.检测波长：266nm；
14.流速：500ml/min；
15.柱温：25～30℃；
16.(3)收集步骤(2)的含nmn的洗脱液，结晶，干燥，得nmn纯品。
17.优选地，上述技术方案中，所述氨基键合硅胶的直径为20-40μm。
18.优选地，上述技术方案中，所述醋酸盐缓冲液浓度为5～20mm，ph值3～5，所述甲醇使用浓度为5～30％。
19.优选地，上述技术方案中，所述无机相和有机相的体积比为70:30～95:5。
20.优选地，上述技术方案中，所述醋酸盐缓冲液使用浓度10mm；所述甲醇使用浓度为10％。
21.优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，含有多种杂质的nmn溶液是指化工合成nmn后的水相，或者酶促合成nmn后去除酶后的溶液。
22.优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，浓缩采用纳滤浓缩或减压浓缩。
23.优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中洗脱方式为等度洗脱。
24.优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)中，结晶的条件为乙醇结晶，结晶温度为5～10℃；干燥为真空干燥。。
25.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
26.(1)制备过程不需要反复通过离子交换等色谱柱，过程简单，耗时短；后期通过结晶、干燥的步骤即可制成纯品，操作简单。
27.(2)制备出的nmn纯度高，能实现nmn与其它有机杂质的精确分离，nmn纯度99％以上。
28.(3)制备步骤收率高，通常95％以上，最高接近100％。
29.(4)本方法nmn与其它杂质分离度高，因此上样量较大；且由于使用等度洗脱，可连续多次上样。
30.(5)本方法平衡液中不需要加入离子对试剂，成本低且环保；平衡液的中醋酸盐有缓冲作用，ph值稳定，重复性好。
31.(6)本纯化方法对化工法或酶促法合成nmn均适用。
32.(7)本纯化方法可同时分离nmn和nad
等物质。
具体实施方式
33.下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
34.实施例1
35.使用制备液相纯化nmn，条件如下：
36.制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
37.色谱柱：氨基键合硅胶制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
38.流动相：10mm醋酸盐缓冲液，ph值5.0，含10％甲醇。
39.检测波长：266nm。
40.流速：500ml/min。
41.上样样品及进样量：约含200g nmn的浓缩液。
42.温度25～30℃。
43.等度洗脱，收集nmn目的峰。
44.此步nmn收率接近98％，nmn纯度(hplc)大于99％。
45.将收集液加入乙醇，5～10℃进行结晶。40℃真空干燥后，检测nmn纯度(hplc)大于99％。
46.实施例2
47.按照实施例1中条件对nmn浓缩液进行纯化，色谱柱大小不变，为500
×
100mm，将其中的氨基键合硅胶粒径替换为40μm。此步nmn纯度(hplc)99％，但nmn收率下降至约90％。说明与杂质的分离度降低。
48.实施例3
49.按照实施例1方法分离nmn样品，调整平衡液中甲醇使用比例，nmn收率和纯度见下表：
50.表1
51.甲醇比例[％]5102030nmn纯度(hplc)98％99％99％98％nmn收率98％98％95％90％
[0052]
实施例4
[0053]
按照实施例1方法分离nmn样品，调整平衡液中醋酸盐浓度和ph值，nmn收率和纯度见下表：
[0054]
表2
[0055]
醋酸盐浓度[mm]510201010ph值5.05.05.04.03.0nmn纯度(hplc)99％99％98％99％98％nmn收率98％98％95％98％98％
[0056]
实施例5
[0057]
使用制备液相纯化nmn，条件如下：
[0058]
制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
[0059]
色谱柱：氨基键合硅胶制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
[0060]
流动相：10mm醋酸盐缓冲液，ph值5.0，含10％甲醇。
[0061]
检测波长：266nm。
[0062]
流速：500ml/min。
[0063]
上样样品及进样量：约含50g nmn和50g nad
的浓缩液。
[0064]
温度25～30℃。
[0065]
等度洗脱，分别收集nmn和nad
目的峰。
[0066]
此步nmn和nad
纯度(hplc)均接近99％，nmn和nad
收率均大于98％。
[0067]
对比例1
[0068]
使用制备液相纯化nmn，条件如下：
[0069]
制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
[0070]
色谱柱：反向c18制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
[0071]
流动相：10mm磷酸盐缓冲液，ph值6.0，含10％甲醇。
[0072]
检测波长：266nm。
[0073]
流速：500ml/min。
[0074]
上样样品及进样量：约含30g nmn的浓缩液(由于nmn保留时间过短，进样量少)。
[0075]
温度25～30℃。
[0076]
等度洗脱，收集nmn目的峰。
[0077]
此步nmn纯度(hplc)大于99％，nmn收率低于90％。同时检测到下样电导较高，说明nmn与盐同时穿出(纯度99％仅为hplc可检出的有机物纯度，不含盐)，需要进一步脱盐才可进行下一步纯化。
[0078]
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。
背景技术：
2.β-烟酰胺单核苷酸，简称nmn，分子量334.22，分子式c
11h15
n2o8p，结构如下：
3.nmn作为前体可用于合成人体代谢必不可少的辅酶i。研究表明，其对人体细胞修复，减缓衰老有重要作用。近年来，nature、cell等顶级期刊刊登了多篇nmn功效研究的文章，哈佛大学实验证实补充nmn可将哺乳动物寿命延长30％以上，日本、美国等几所大学及企业已相继开展了人体临床实验，nmn被看作是“长生不老药”，倍受保健品药品市场的追捧。
4.现有的nmn生产方法有化工法、酶促法等方法。化工法主要通过缩合、脱乙酰基、磷酸化及氨解等步骤合成nmn，过程较复杂，中间产物较多，后期纯化过程中需使用有机溶剂萃取的方法，污染较严重。酶促法使用酶作为催化剂，反应路线为生物体内固有的nmn合成路线，催化活性高、速度快、专一性强，但是目前如离子交换和过滤等常规方法纯化效果不佳。
5.因此，急需设计一种针对nmn更有效的制备方法以解决上述技术难题。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是提供一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其克服了现有技术的上述缺陷，该方法能快速有效的分离出nmn，产品纯度高。
7.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
8.一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)样品预处理：将含有β-烟酰胺单核苷酸(nmn)的溶液进行浓缩，得浓缩液；
10.(2)将步骤(1)得到的浓缩液通过制备液相，分离出nmn部分，所述制备液相的色谱条件如下：
11.色谱柱：填料为氨基键合硅胶；
12.流动相：由无机相和有机相混合得到，无机相为醋酸盐缓冲液，有机相为甲醇；
13.检测波长：266nm；
14.流速：500ml/min；
15.柱温：25～30℃；
16.(3)收集步骤(2)的含nmn的洗脱液，结晶，干燥，得nmn纯品。
17.优选地，上述技术方案中，所述氨基键合硅胶的直径为20-40μm。
18.优选地，上述技术方案中，所述醋酸盐缓冲液浓度为5～20mm，ph值3～5，所述甲醇使用浓度为5～30％。
19.优选地，上述技术方案中，所述无机相和有机相的体积比为70:30～95:5。
20.优选地，上述技术方案中，所述醋酸盐缓冲液使用浓度10mm；所述甲醇使用浓度为10％。
21.优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，含有多种杂质的nmn溶液是指化工合成nmn后的水相，或者酶促合成nmn后去除酶后的溶液。
22.优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，浓缩采用纳滤浓缩或减压浓缩。
23.优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中洗脱方式为等度洗脱。
24.优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)中，结晶的条件为乙醇结晶，结晶温度为5～10℃；干燥为真空干燥。。
25.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
26.(1)制备过程不需要反复通过离子交换等色谱柱，过程简单，耗时短；后期通过结晶、干燥的步骤即可制成纯品，操作简单。
27.(2)制备出的nmn纯度高，能实现nmn与其它有机杂质的精确分离，nmn纯度99％以上。
28.(3)制备步骤收率高，通常95％以上，最高接近100％。
29.(4)本方法nmn与其它杂质分离度高，因此上样量较大；且由于使用等度洗脱，可连续多次上样。
30.(5)本方法平衡液中不需要加入离子对试剂，成本低且环保；平衡液的中醋酸盐有缓冲作用，ph值稳定，重复性好。
31.(6)本纯化方法对化工法或酶促法合成nmn均适用。
32.(7)本纯化方法可同时分离nmn和nad
等物质。
具体实施方式
33.下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
34.实施例1
35.使用制备液相纯化nmn，条件如下：
36.制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
37.色谱柱：氨基键合硅胶制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
38.流动相：10mm醋酸盐缓冲液，ph值5.0，含10％甲醇。
39.检测波长：266nm。
40.流速：500ml/min。
41.上样样品及进样量：约含200g nmn的浓缩液。
42.温度25～30℃。
43.等度洗脱，收集nmn目的峰。
44.此步nmn收率接近98％，nmn纯度(hplc)大于99％。
45.将收集液加入乙醇，5～10℃进行结晶。40℃真空干燥后，检测nmn纯度(hplc)大于99％。
46.实施例2
47.按照实施例1中条件对nmn浓缩液进行纯化，色谱柱大小不变，为500
×
100mm，将其中的氨基键合硅胶粒径替换为40μm。此步nmn纯度(hplc)99％，但nmn收率下降至约90％。说明与杂质的分离度降低。
48.实施例3
49.按照实施例1方法分离nmn样品，调整平衡液中甲醇使用比例，nmn收率和纯度见下表：
50.表1
51.甲醇比例[％]5102030nmn纯度(hplc)98％99％99％98％nmn收率98％98％95％90％
[0052]
实施例4
[0053]
按照实施例1方法分离nmn样品，调整平衡液中醋酸盐浓度和ph值，nmn收率和纯度见下表：
[0054]
表2
[0055]
醋酸盐浓度[mm]510201010ph值5.05.05.04.03.0nmn纯度(hplc)99％99％98％99％98％nmn收率98％98％95％98％98％
[0056]
实施例5
[0057]
使用制备液相纯化nmn，条件如下：
[0058]
制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
[0059]
色谱柱：氨基键合硅胶制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
[0060]
流动相：10mm醋酸盐缓冲液，ph值5.0，含10％甲醇。
[0061]
检测波长：266nm。
[0062]
流速：500ml/min。
[0063]
上样样品及进样量：约含50g nmn和50g nad
的浓缩液。
[0064]
温度25～30℃。
[0065]
等度洗脱，分别收集nmn和nad
目的峰。
[0066]
此步nmn和nad
纯度(hplc)均接近99％，nmn和nad
收率均大于98％。
[0067]
对比例1
[0068]
使用制备液相纯化nmn，条件如下：
[0069]
制备液相规格：lc6000型制备高效液相色谱仪
[0070]
色谱柱：反向c18制备色谱柱，500
×
100mm，20μm。
[0071]
流动相：10mm磷酸盐缓冲液，ph值6.0，含10％甲醇。
[0072]
检测波长：266nm。
[0073]
流速：500ml/min。
[0074]
上样样品及进样量：约含30g nmn的浓缩液(由于nmn保留时间过短，进样量少)。
[0075]
温度25～30℃。
[0076]
等度洗脱，收集nmn目的峰。
[0077]
此步nmn纯度(hplc)大于99％，nmn收率低于90％。同时检测到下样电导较高，说明nmn与盐同时穿出(纯度99％仅为hplc可检出的有机物纯度，不含盐)，需要进一步脱盐才可进行下一步纯化。
[0078]
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
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