先天性肾上腺皮质增生症诊断模型及其构建方法和应用

1.本发明属于先天性肾上腺皮质增生症诊断技术领域，具体涉及一种基于液相色谱-串联质谱检测的13种类固醇激素，以该13种类固醇激素为基础构建的诊断模型，以及诊断模型的构建方法，该诊断模型对于先天性肾上腺皮质增生症3种亚型都具有很好的诊断效果，特别适合于非经典型先天性肾上腺皮质增生症的诊断。


背景技术：

2.先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,cah)是由于肾上腺皮质类固醇激素合成通路中所需的酶或辅因子缺陷导致肾上腺皮质激素合成障碍、肾上腺增生及类固醇激素代谢紊乱的一组常染色体隐性遗传疾病，以21α羟化酶缺陷症(21α-hydroxylase deficiency,21ohd)最为常见，占90-95％，其次为11β羟化酶缺陷症(11β-hydroxylase deficiency,11βohd)、17α-羟化酶缺陷症(17α-hydroxylase/17,20lyase deficiency,17ohd)及其它罕见亚型。根据临床表型的轻重程度，可分为经典型和非经典型。经典型患儿发病率为1/15000，出生时即可表现为严重的肾上腺皮质功能不全，在开展新生儿筛查之前，患儿常常于早期夭折。非经典型患者发病率可高达1/200，是最常见的隐性遗传病之一，患者发病迟，病情隐匿，常因肾上腺功能早现、青春期发育异常就诊，成人多表现为不孕不育、多囊卵巢、性腺肿物、肾上腺意外瘤等就诊，临床易漏诊、误诊
1.。目前，对cah的新生儿筛查和诊断方法主要基于单个激素的水平，且仅存在针对21ohd的诊断标准，存在假阳性率高，对非经典型的诊断敏感性差，其它亚型cah均无统一的诊断标准。
3.1977年，美国阿拉斯加率先以17α-羟孕酮(17α-hydroxyprogesterone,17ohp)为诊断标志物开展21ohd的新生儿筛查，大大提高了患者的检出率并降低了cah患儿的死亡率。21α羟化酶缺陷症的临床诊治指南以基线或促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,acth)兴奋后17ohp大于10ng/ml作为临床诊断21ohd的标准，灵敏度较高
2.。但该方法仍存在一些不足。一方面，对部分非经典型患者而言，需行acth兴奋实验，延长了患者就诊时间，增加了检验成本；另一方面，17ohp较高的假阳性率对特异度的干扰不容忽视。多种内分泌疾病均可表现出不同程度17ohp水平的升高，如11β羟化酶缺陷症，肾上腺肿物、氧化还原酶缺陷症等。部分cyp21a2杂合致病突变携带者17ohp水平升高，与非经典型cah患者难以鉴别。而对于其它cah亚型，如11βohd和17ohd等，目前缺乏临床诊断标准，也没有相关指南或共识发表。cah虽然是一种罕见病，但我国人口基数庞大，病患总数可观，且因临床诊治复杂，存在巨大的医患供需缺口。
4.随着液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,
5.lc-ms/ms)技术的发展，lc-ms/ms已被应用于临床诊断标志物、生理病理代谢、药物成分检测与研究等多个方面。与传统的免疫测定法相比较，lc-ms/ms灵敏度更好，重现性更好，通量大，所需样本量少，而且具有高效、快速分离效能，可广泛应用于极性化合物和大分子物质(包括蛋白质、多肽等)分析。1997年，rashed等人首次将质谱技术应用于新生儿先天性代谢异常筛查
3.。2007年，janzen等提出采用lc-ms/ms检测，结合17ohp、21脱氧皮质醇
sequencing for molecular diagnosis of congenital adrenal hyperplasia.the journal of steroid biochemistry and molecular biology.2021apr 14；211:105899.
13.[7]bialk er,lasarev mr,held pk:wisconsin's screening algorithm for the identification of newborns with congenital adrenal hyperplasia.international journal of neonatal screening 2019,5(3):33.


技术实现要素：

[0014]
针对现有技术中cah诊断标准仅适用于21ohd，主要基于17ohp及其代谢物水平在普通人群、cah患者及cah相关基因致病突变携带者中变化，且诊断假阳性率高、覆盖范围有限，不能实现其它cah亚型快速诊断，本发明一改以往的研究思路，首次提出采用类固醇激素谱构建诊断模型诊断多种cah亚型的想法，建立了适合cah筛查和诊断的模型，该诊断方法对21ohd、11βohd、17ohd三种亚型均有较好的灵敏度和特异度，对于cah的早期诊断，预防早期并发症，提高患者生活质量有重要的临床意义。
[0015]
本发明的首要目的是提供一种cah诊断模型的构建方法。
[0016]
本发明的次要目的是提供上述cah诊断模型。
[0017]
本发明的最后目的是提供上述cah诊断模型的应用。
[0018]
为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：
[0019]
一种cah诊断模型的构建方法，其包括如下步骤：
[0020]
(1)、分别收集cah受试者、类cah受试者、健康受试者的血清样本作为分析样本，其中，cah受试者包括11βohd受试者、17ohd受试者和21ohd受试者；
[0021]
(2)、将每个分析样本采用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)技术进行分析，得到各血清样本的原始类固醇激素谱，使用python语言采用级联logistic回归方法建立分类模型，分别生成11βohd评分、17ohd评分和21ohd评分；
[0022]
(3)、根据受试者操作特征曲线下面积，分别计算得到11βohd评分、17ohd评分和21ohd评分的临界值。
[0023]
进一步地，步骤(1)中，类cah受试者包括但不限于多囊卵巢综合征、月经不规则、不孕、性早熟、多毛症、两性畸形、不明原因的高血压和/或低钾血症、肾上腺肿物、先天性肾上腺皮质功能不全。
[0024]
进一步地，步骤(2)中，类固醇激素谱中类固醇激素包括孕烯醇酮、17-羟基孕烯醇酮、17-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、皮质素、孕酮、11-脱氧皮质酮、皮质酮、醛固酮、雄烯二酮、睾酮和雌二醇。
[0025]
进一步地，步骤(3)中，操作特征曲线下面积中，11βohd评分的临界值为-0.810，若11βohd评分大于-0.81，则该受试者诊断为11βohd；若11βohd评分小于-0.81，则该受试者排除11βohd；17α-羟化酶缺陷症的临界值为-0.073，若17ohd评分大于-0.073，则该受试者诊断为17ohd；若17ohd评分小于-0.073，则该受试者排除17ohd；21ohd的临界值为0.096，若21ohd评分大于0.096，则该受试者诊断为21ohd；若21ohd评分小于0.096，则该受试者排除21ohd。
[0026]
为达到上述次要目的，本发明的解决方案是：
[0027]
一种cah诊断模型，其由上述的构建方法得到。
[0028]
为达到上述最后目的，本发明的解决方案是：
[0029]
一种如上述的cah诊断模型在诊断cah亚型(11βohd、17ohd和21ohd)中的应用。
[0030]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0031]
第一、本发明采用液相色谱串联质谱技术以及数据统计分析技术得到适合于cah诊断的诊断模型，该模型不仅适用于最常见的21ohd的诊断，而且使用于17ohd和11βohd的诊断。本发明诊断模型构建方法简单，所得诊断模型效果良好，灵敏度高，特异性好，不仅适合经典型cah的诊断，更有益于非经典型cah的检出，缩减了待检人员的痛苦。另外，本发明仅通过取血就能实现诊断，无创、花费低，能够很好缩减患者就诊流程，降低患者就诊成本，且仅需一次采血，减轻了受试者痛苦，且诊断过程简洁、快速，所需时间短，提高了工作效率，有利于cah的早发现、早治疗，具有良好的临床使用和推广价值。
[0032]
第二、本发明使用了类固醇激素谱的检测方法，该方法检测准确率高，该类固醇谱对cah不同亚型都具有很好的灵敏度和特异度，尤其适用于非经典型cah的诊断。
[0033]
总之，本发明提供了一种采用lc-ms/ms技术及机器学习方法构建的cah分类诊断的诊断模型及模型构建方法。该模型构建方法简单，可操作性强，诊断准确率高，对三种cah亚型均具有良好的敏感度和特异度，适用于cah的诊断，尤其是非经典型患者的诊断。本发明仅通过一次采血检测就能实现诊断，无需多次采血，无需其它试验，缩减了患者的就诊流程，降低了就诊成本，可提高患者的主动性和依从性，为cah的早诊早治提供了有效的技术支持，具有很好的临床使用和推广价值。
附图说明
[0034]
图1为本发明的13种类固醇激素的色谱分离顺序图(其中，1为醛固酮，2为皮质素，3为皮质醇，4为皮质酮，5为11-脱氧皮质醇，6为孕烯醇酮，7为雄烯二酮，8为11-脱氧皮质酮，9为睾酮，10为17-羟孕酮，11为孕酮，12为17-羟基孕烯醇酮，13为雌二醇)。
[0035]
图2为本发明的226例受试样本的评分图。
[0036]
图3为本发明的cah诊断模型在外部验证队列中诊断的roc曲线图。
具体实施方式
[0037]
本发明提供了一种先天性肾上腺皮质增生症诊断模型及其构建方法和应用。
[0038]
本发明依托上海交通大学附属瑞金医院内分泌代谢疾病国家临床研究中心的cah人群队列，获得21ohd、17ohd和11βohd患者的血清样本，随机抽取其它非cah患者临床表现为类cah表型，及健康对照人群作为对照组，使用lc-ms/ms检测13种类固醇激素，通过对三种cah亚型患者、及类cah患者和健康对照组类固醇激素的比对和差异分析，采用logistic回归方法构建诊断模型，得到cah诊断模型，利用该模型可以快速诊断是否为cah(21ohd、11βohd、17ohd)，尤其是非经典型患者，灵敏度高、特异度高，具有临床使用和推广价值。
[0039]
1.研究对象：
[0040]
本发明纳入226名受试者，包括98例cah患者(21ohd 66例、17ohd 22例、11βohd 10例)作为病例组和128例受试者作为对照组，包括30例类cah表型患者和98例随机选取与病例组性别、年龄(
±
5岁)匹配的健康受试者。cah患者至少具有以下一种临床特征：(1).高雄激素血症，表现为月经不调、多毛、痤疮等；(2).异常生长和性发育，表现为假两性畸形、性
早熟、肾上腺功能初现、性发育延迟等；(3).不孕不育；(4).高血压和/或低钾血症；(5).先天性肾上腺皮质功能不全，表现为喂养困难、体重不增、嗜睡、脱水、皮肤色素沉着等；(6).肾上腺肿物，在非肾上腺指征的影像学检查中发现的无症状肾上腺影像学表现；(7).其他包括新生儿筛查示17ohp水平升高，先证者家系调查等。本发明入组患者无年龄、性别限制。
[0041]
2.样本采集、运输：
[0042]
血清样本采集要求：
[0043]
采血前一晚不喝酒、饮食清淡、不吃特殊的药物(糖皮质激素和盐皮质激素除外)，采样前不做剧烈运动，保持安静状态。采集时间为早晨8点，女性患者要求月经来潮3-5天采集。使用促凝采血管采集静脉血4-5ml(婴幼儿1-3ml)，采集后立即上下颠倒5次混匀，不可剧烈震荡，室温(15-25℃)静置45(
±
10)min后进行低温离心，离心速度4000rpm，离心时间5min。使用移液枪将离心后上层血清分装至0.6ml的ep管，每管分装400μl，不少于200μl，及时转移至-80℃保存。样本储存过程中，避免反复冻融。
[0044]
3.液相色谱-串联质谱技术：
[0045]
主要仪器与设备：
[0046]
微量移液器(gilson、eppendorf)、漩涡振荡器(kylin-bell)、超声波清洗仪(kudos)、台式离心机5457r/5810r(eppendorf)、液相色谱仪ekspertultralc 100(ab sciex)、串联式质谱仪triple quad 4500(ab sciex)、96孔板氮吹仪(cleanert)、milliq超纯水机(millipore)、制冰机(scotsman)、超低温冰箱(thermo scientific forma)。
[0047]
试剂与耗材：
[0048]
kinetex色谱柱c18 2.1*100mm.2.6μm.(phenomenex)、标准品(dr.ehrenstorfer gmbh)、甲醇(tedia)、灭菌去离子水、乙酸乙酯(上海凌峰)、正己烷(上海凌峰)、甲酸铵(thermo fisher scientific)、去激素血清(dr.ehrenstorfer gmbh)、质控样品(biorad)、0.6ml/1.5ml ep管(axygen)、sle 96孔板500mg/3ml(agela technologies)、促凝采血管(bd)。
[0049]
标准品工作液的配制：
[0050]
将标准品储备液稀释为100ppm和10ppm的工作液。如图1所示，标准品分别为孕烯醇酮(pregnenolone，cas：145-13-1)、17-羟基孕烯醇酮(17-ohpregnenolone，cas：1887-95-2)、17羟孕酮(17-ohprogesterone，cas：68-96-2)、11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，cas：152-58-9)、皮质醇(cortisol，cas：50-23-7)、皮质素(cortisone，cas：53-06-5)、孕酮(progesterone，cas：57-83-0)、11-脱氧皮质酮(11-deoxycorticosterone，cas：64-85-7)、皮质酮(corticosterone，cas：50-22-6)、醛固酮(aldosterone，cas：52-39-1)、雄烯二酮(androstenedione，cas：63-05-8)、睾酮(testosterone，cas：521-20-0)、雌二醇(estradiol，cas：50-28-2)。其中，17-ohprogesterone原储备工作液浓度为2mg/ml，按照50μl储备液 950μl甲醇进行稀释，其余12种类固醇均采用100μl储备液 900μl甲醇进行稀释。为克服色谱条件差异，进样量、加样不准等原因造成的测量误差，引入9个内标。将9个内标pregnenolone-d4、17-ohpregnenolone-d3、11-deoxycorticosterone-d7、11-deoxycortisol-d7、methyltestosterone、corticosterone-d8、cortisol-d8、aldosterone-d7、estradiol-d3稀释为10ppm，按照10μl储备液 990μl甲醇进行稀释。
[0051]
内标混合物配制：
[0052]
将上述9个内标(浓度10ppm)用甲醇稀释100倍至100ppb，配置成内标混合物备用。此过程中甲醇易挥发，内标混合物需计算损耗进行配制。
[0053]
标准曲线工作液配制：标准曲线最高点(std7)，按照748μl甲醇 标准品(共252μl)配制，工作液需要量如表1所示。std7配制完成后，进行倍比稀释，如std6(500μl甲醇 500μl的std7)，最终形成7个浓度(std1、std2、std3、std4、std5、std6、std7)，置于-80℃冰箱保存备用。
[0054]
其它溶液配制：
[0055]
①
洗脱液：乙酸乙酯和正己烷按照体积1:1比例配制。
②
30％甲醇水：甲醇和灭菌去离子水按照体积比为3:7比例配制。
③
流动相：a液，无机相(h2o)，含2mmol/l甲酸铵，按500ml水 1ml、1mol/l甲酸铵配制。b液，有机相(甲醇)，含2mmol/l甲酸铵，按500ml甲醇 1ml、1mol/l甲酸铵配制。配制过程中注意，有机试剂易挥发，配制溶液需在通风橱中进行。流动相两种液体配制完成后需使用超声进行脱气，频率为35khz，时间为15min。
[0056]
样品处理：
[0057]
①
预处理(配制500μl上样体系)：a.标准曲线溶液处理(7种浓度的混标工作液)，按照去激素血清380μl 标曲工作液20μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制。b.待检测血清样品处理：按照待检测血清样本400μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制，若血清样本体积不足400μl，按照倍比取样，剩余体积使用去激素血清补足，后续数据分析按照倍比计算。c.质控样品处理：取biorad质控样本，共3个浓度，分别记为qc1、qc2、qc3，按照质控样本400μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制。
[0058]
样品提取：
[0059]
①
取sle硅藻土(96孔亲水筛板，500mg/3ml)和匹配的96孔接收板(2ml/孔)。将预处理后的样品(500μl)用移液枪转移至sle硅藻土柱子中，待样品在重力作用下全部流至填料中后，静置20min(样品会充分渗透至硅藻土的多孔结构中)。
②
3次洗脱：按照上述步骤配制好洗脱液乙酸乙酯：正己烷(1:1，v/v)后，进行第一次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液600μl；间隔1min后，进行第二次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液600μl；间隔1min后，进行第三次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液800μl。待洗脱溶剂与样品充分接触，两相间进行微观的液液萃取，在重力作用下，用96孔接收板将流出液全部接收。
③
浓缩：待硅藻土柱子中无液体流出时，取装有洗脱液的96孔收集板置于氮吹仪96位模块内，调节氮吹仪高度，氮气吹干，时间约30min。
④
复溶：待氮气吹干后，每孔加入200μl、30％的甲醇水(3:7，v/v)，盖上配套的硅胶垫，轻微涡旋混合均匀，简短离心，静置20min使其充分溶解。
⑤
充分复溶后，用移液枪将200μl溶液转移至提前编好号的内插管中，转移过程中勿产生气泡，后将内插管置于样品瓶中，放置在超高效液相色谱自动取样器上。在电喷雾电离正模式下使用分析仪(v1.6.1，absciex)检测，数据收集采用多反应监测。
[0060]
仪器检测条件：
[0061]
所用质谱为sciex triple quad 4500，液相为exigent ultra lc100。hplc条件：色谱柱kinetex色谱柱c18 2.1*100mm.2.6μm.(phenomenex)，流速为500μl/min，柱温为40℃，进样量为20μl，满环进样。流动相：a相：2mmol/l甲酸铵的水溶液，b相：2mmol/l甲酸铵的甲醇溶液。梯度：0min-30％b，1min-45％b，6min-70％b，10min-82％b，10:30min-100％b，12:30min-100％b，13min-30％b，15min-30％b。质谱条件：扫描模式：esipositive，采集
模式：mrm。
[0062]
《cah诊断模型的构建方法》
[0063]
本发明的cah诊断模型的构建方法包括如下步骤：
[0064]
(1)、分别收集cah患者(11βohd、17ohd、21ohd三种亚型)、类cah患者(临床症状与cah患者相似但非cah患者)、健康对照组人群的血清样本作为分析样本；
[0065]
(2)、将每个分析样本采用lc-ms/ms(v1.6.1，absciex)检测13种类固醇激素水平，得到各血清样本的原始类固醇激素谱，使用python(version 3.9.5)语言采用级联logistic回归方法建立分类模型。在建模过程中，13种类固醇激素对每种亚型cah分类的效应各不相同，分别生成11βohd评分、17ohd评分和21ohd评分，分别用于11βohd、17ohd和21ohd的识别和诊断(如图2)；
[0066]
(3)、根据受试者操作特征曲线(roc曲线)下面积，分别计算得到11βohd评分、17ohd评分和21ohd评分的临界值。
[0067]
其中，在步骤(1)中，血清样本采集：要求采血前一晚不喝酒、不吃特殊的食物和药物(糖皮质激素和盐皮质激素除外)，采样前不做剧烈运动，保持安静状态。采集时间为早8点，女性患者要求月经来潮3-5天采集。采集静脉血(4-5ml，婴幼儿1-3ml)，采集后立即上下颠倒5次混匀，不可剧烈震荡，室温(15-25℃)静置45(
±
10)min后进行低温离心。低温离心要求：离心速度为4000rpm，离心时间为5min。4℃放置不超过4h，及时转移至-80℃保存。样本储存过程中，避免反复冻融。
[0068]
在步骤(1)中，本发明的非cah患者临床表现为类cah表型，类cah患者包括多囊卵巢综合征、月经不规则、不孕、性早熟、多毛症、两性畸形、不明原因的高血压和/或低钾血症、肾上腺肿物、先天性肾上腺皮质功能不全等，易于cah混淆，临床需鉴别诊断。
[0069]
在步骤(2)中，类固醇激素谱中类固醇激素包括以下13种：孕烯醇酮(pregnenolone，cas：145-13-1)、17-羟基孕烯醇酮(17-ohpregnenolone，cas：1887-95-2)、17羟孕酮(17-ohprogesterone，cas：68-96-2)、11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，cas：152-58-9)、皮质醇(cortisol，cas：50-23-7)、皮质素(cortisone，cas：53-06-5)、孕酮(progesterone，cas：57-83-0)、11-脱氧皮质酮(11-deoxycorticosterone，cas：64-85-7)、皮质酮(corticosterone，cas：50-22-6)、醛固酮(aldosterone，cas：52-39-1)、雄烯二酮(androstenedione，cas：63-05-8)、睾酮(testosterone，cas：521-20-0)、雌二醇(estradiol，cas：50-28-2)。
[0070]
在步骤(2)中，lc-ms/ms血清样本分析时，每10个分析样本加入一个质量控制样品，用于实时监测分析样本从进样前处理到分析过程中的质量控制情况。
[0071]
其中，分析样本和质量控制样品进样前需进行以下预处理：
[0072]
a.标准品工作液的配制，将上述13种类固醇激素标准品储备液稀释为100ppm和10ppm的工作液。
[0073]
b.为克服色谱条件差异，进样量、加样不准等原因造成的测量误差，引入9个内标。用甲醇将9个内标pregnenolone-d4、17-ohpregnenolone-d3、11-deoxycorticosterone-d7、11-deoxycortisol-d7、methyltestosterone、corticosterone-d8、cortisol-d8、aldosterone-d7、estradiol-d3稀释为10ppm。
[0074]
c.内标混合物配制：将上述9个内标(浓度10ppm)用甲醇稀释100倍至100ppb，配置
成内标混合物备用。
[0075]
d.标准曲线工作液配制：标准曲线最高点(std7)，按照748μl甲醇 标准品(共252μl)配制，工作液需要量如下表1所示。std7配制完成后，进行倍比稀释，如std6(500μl甲醇 500μl的std7)，最终形成7个浓度(std1、std2、std3、std4、std5、std6、std7)，置于-80℃冰箱保存备用。
[0076]
e.其它溶液配制：如表2和表3所示，
①
洗脱液：乙酸乙酯和正己烷按照体积1:1比例配制。
②
30％甲醇水：甲醇和灭菌去离子水按照体积比为3:7比例配制。
③
流动相：a液，无机相(h2o)，含2mmol/l甲酸铵，按500ml水 1ml、1mol/l甲酸铵配制。b液，有机相(甲醇)，含2mmol/l甲酸铵，按500ml甲醇 1ml、1mol/l甲酸铵配制。配制过程中注意，有机试剂易挥发，配制溶液需在通风橱中进行。流动相两种液体配制完成后需使用超声进行脱气，频率为35khz，时间为15min。
[0077]
f.样品处理：
①
预处理(配制500μl上样体系)：a.标准曲线溶液处理(7种浓度的混标工作液)，按照去激素血清380μl 标曲工作液20μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制。b.待检测血清样品处理：按照待检测血清样本400μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制，若血清样本体积不足400μl，按照倍比取样，剩余体积使用去激素血清补足，后续数据分析按照倍比计算。c.质控样品处理：取biorad质控样本，共3个浓度，分别记为qc1、qc2、qc3，按照质控样本400μl 甲醇20μl 内标混合物20μl 水60μl配制。
[0078]
g.样品提取检测：
①
取sle硅藻土(96孔亲水筛板，500mg/3ml)和匹配的96孔接收板(2ml/孔)。将预处理后的样品(500μl)用移液枪转移至sle硅藻土柱子中，待样品在重力作用下全部流至填料中后，静置20min(样品会充分渗透至硅藻土的多孔结构中)。
②
3次洗脱：按照上述步骤配制好洗脱液乙酸乙酯：正己烷(1:1，v/v)后，进行第一次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液600μl；间隔1min后，进行第二次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液600μl；间隔1min后，进行第三次洗脱，每孔硅藻土柱中加入洗脱液800μl。待洗脱溶剂与样品充分接触，两相间进行微观的液液萃取，在重力作用下，用96孔接收板将流出液全部接受。
③
浓缩：待硅藻土柱子中无液体流出时，取装有洗脱液的96孔收集板置于氮吹仪96位模块内，调节氮吹仪高度，氮气吹干，时间约30min。
④
复溶：待氮气吹干后，每孔加入200μl、30％的甲醇水(3:7，v/v)，盖上配套的硅胶垫，轻微涡旋混合均匀，简短离心，静置20min使其充分溶解。
⑤
充分复溶后，用移液枪将200μl溶液转移至提前编好号的内插管中，转移过程中勿产生气泡，后将内插管置于样品瓶中，放置在超高效液相色谱自动取样器上，流速为0.5μl/min。在电喷雾电离正模式下使用分析仪(v1.6.1，absciex)检测，数据收集采用多反应监测。同时对lc-ms/ms方法进行评估，包括线性度、回收率等。确定每种激素的定量上限，以便在高病理浓度下进行测量，同时需保证定量下限足够低，以便对健康个体的激素水平进行量化。
[0079]
在步骤(3)中，roc曲线下面积中，如表4和表5所示，11βohd评分的临界值(即最佳分界值)为-0.810，若11βohd评分大于-0.81，则该患者诊断为11βohd；若11βohd评分小于-0.81，则该患者排除11βohd，并按照模型流程进入后续17ohd和21ohd分类诊断。排除11βohd后，按照同样的方法，根据roc曲线下面积，计算得出17ohd的临界值(即最佳分界值)为-0.073，若17ohd评分大于-0.073，则该患者诊断为17ohd；若17ohd评分小于-0.073，则该患者排除17ohd，并进入后续21ohd的诊断。排除11βohd和17ohd后，按照同样的方法，根据roc
曲线下面积，计算得出21ohd的临界值(即最佳分界值)为0.096，若21ohd评分大于0.096，则该患者诊断为21ohd；若21ohd评分小于0.096，则该患者排除21ohd。
[0080]
表1标准工作液配制
[0081][0082]
表2 lc-ms/ms质控数据
[0083][0084][0085]
表3 mrm参数
[0086][0087]
表4 226例受试者的临床特征
[0088]
[0089][0090]
表5 cah诊断模型的诊断效能
[0091][0092]
cah诊断模型及外部验证
[0093]
将256名随机招募的外部测试样本，用上述构建的cah诊断模型进行诊断，如果评分结果大于或等于某亚型诊断临界值，则判定为诊断阳性，如果低于诊断临界值，则判定为诊断阴性。如图3和表6所示，将上述样本的模型诊断结果与基因诊断结果相比做roc曲线分析，获得诊断模型的灵敏度、特异度和roc曲线下面积auc值，可以看出上述构建的cah诊断模型效果良好，其用于诊断11βohd的roc曲线下面积auc为0.994(0.983-1.000)，灵敏度为0.900，特异度为0.992；17ohd的roc曲线下面积auc为0.993(0.985-1.000)，灵敏度为0.826，特异度为1.000；21ohd的roc曲线下面积auc为0.979(0.964-0.994)，灵敏度为0.976，特异度为0.931。
[0094]
表6诊断模型在前瞻队列中识别cah的诊断效能
[0095][0096]
上述对具体实施方式的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些具体实施方式做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施方式中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。