用于表达来自VMD2启动子的组成型活性RAP1A的方法和组合物

用于表达来自vmd2启动子的组成型活性rap1a的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年9月25日提交的美国临时申请第62/905,880号的权益，所述美国临时申请特此通过引用整体并入本文。
3.关于联邦政府资助的研究的声明
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的授权编号ey017011和ey015130在政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。
5.对序列表的参考
6.创建于2019年9月24日并且大小为4,5,47字节的以命名为“21101_0402u1_sequence_listing.txt”的文本文件于2019年9月25日提交的序列表根据37c.f.r.
§
1.52(e)(5)特此通过引用并入。
技术领域

背景技术：

7.年龄相关性黄斑变性(amd)仍然是全世界老年人法定失明的主要原因。有证据表明，视网膜色素上皮(rpe)功能障碍先于amd的新生血管和萎缩形式，并且可能在这些终末期amd的发病机制中很重要。rpe是单层极化细胞，其在视网膜稳态中至关重要。rpe维持外层血-视网膜屏障，同时调节向外层视网膜输送营养物和氧气，以及从光感受器中清除代谢废物。rpe还产生支持视网膜和脉络膜毛细血管的生理水平的生长因子。随着衰老和病理应激的增加，rpe可能失去这些功能的效率。结果，布鲁赫膜(bruch's membrane)内的碎屑累积在rpe下方显示为玻璃疣。随着功能障碍的进展，rpe的屏障完整性受到损害，并且应激的rpe会释放病理水平的生长因子，从而导致晚期amd。因此，维持或恢复rpe功能的策略可能是amd疗法的潜在目标。
8.因此，本文公开了用于治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的组合物和方法。


技术实现要素：

9.公开了核酸构建体，其包括编码卵黄样黄斑营养不良-2(vmd2)启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码活性rap1a的核酸序列
10.公开了包括本文公开的核酸构建体的载体。
11.公开了包括本文公开的核酸构建体或载体的组合物。
12.公开了包括一种或多种本文公开的核酸构建体或载体的重组细胞。
13.公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所述核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者。
14.公开了抑制脉络膜新生血管(cnv)的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种本文公开的核酸构建体、载体或组合物。
15.公开了减少脉络膜组织中的炎症信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种本文公开的核酸构建体、载体或组合物。
16.公开了减少脉络膜组织中的vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用一种或多种本文公开的核酸构建体、载体或组合物。
17.所公开的方法和组合物的另外优点将部分地在下述描述中阐述，并且部分地将从描述中理解，或者可通过实践所公开的方法和组合物来学习。借助于所附权利要求中特别指出的元素和组合，将实现且获得所公开的方法和组合物的优点。应理解，前述一般描述和下述详细描述两者均仅为示例性和说明性的，并不是所要求保护的本发明的限制。
附图说明
18.并入本说明书中且构成本说明书的部分的附图示出了所公开的方法和组合物的若干实施例，并且连同说明书一起，作用于解释所公开的方法和组合物的原理。
19.图1a和1b示出了自身互补型腺相关病毒2(sc-aav2)载体的示意图，所述载体递送由(a)rpe65启动子(sc-aav2-rpe65-carap1a和sc-aav2-rpe65-gfp)或(b)vmd2启动子(sc-aav2-vmd2-carap1a和sc-aav2-vmd2-gfp)驱动的组成型活性rap1a(carap1a)。
20.图2a和2b示出了对野生型小鼠的rpe中sc-aav2转导的体内分析。在以5x108个病毒颗粒/μl的剂量注射sc-aav2-rpe65-gfp或sc-aav2-vmd2-gfp载体5周后，野生型小鼠的视网膜冷冻切片中(a)gfp的micron iv视网膜成像和(b)gfp和rpe65的免疫染色。
21.图3a、3b和3c示出了sc-aav2-vmd2载体在rpe中显示出更具特异的gfp转导和更大的rap1表达。注射sc-aav2-rpe65或sc-aav2-vmd2的野生型小鼠的(a)视网膜冷冻切片中gfp的ihc(b-c)rpe/脉络膜中rap1和β-肌动蛋白的蛋白质印迹(b，代表性凝胶图像；以及c，光密度测定的量化)(**p《0.01，对比sc-aav2-vmd2-gfp，n＝5-6)。
22.图4a和4b显示在激光诱导的cnv模型中，通过sc-aav2-vmd2-carap1a在rpe中表达活性rap1a可减少野生型小鼠的脉络膜新生血管(cnv)。(a)rpe/脉络膜扁平支架的代表性图像和(b)cnv病变的量化(*p《0.05，对比sc-aav2-vmd2，n＝来自12只小鼠的40个点)。
23.图5a-5d显示，通过sc-aav2-vmd2-carap1a在rpe中表达活性rap1a可减少rpe/脉络膜中的炎症和vegf。激光治疗后7天，在注射了sc-aav2-vmd2的野生型小鼠的rpe/脉络膜中(a-b)磷酸化nf-κb和(c-d)vegf的蛋白质印迹(a和c，代表性凝胶图像；以及b和d，光密度测定的量化；*p《0.05，**p《0.01，对比sc-aav2-vmd2-gfp；n＝5-6)。
24.图6a-6d显示，通过sc-aav2-vmd2-carap1a在rpe中表达活性rap1a不会激活细胞凋亡和自噬。激光治疗后7天，在注射了sc-aav2-vmd2的野生型小鼠的rpe/脉络膜中(a-b)胱天蛋白酶3和(c-d)lc3a/b的蛋白质印迹(a和c，代表性凝胶图像；以及b和d，光密度测定的量化；*p《0.05，对比sc-aav2-vmd2-gfp；n＝5-6；cc，经细胞色素c处理的细胞裂解物)。
25.图7a-7k显示通过腺病毒转导在rpe中表达活性rap1a可减少vegf和nf-κb活化而不增加自噬和细胞死亡。(a)病毒转导的rpe以及(b-c)rap1蛋白、(d-e)vegf蛋白、(f)磷酸化nf-κb(p-nf-κb)和总nf-κb、(g-h)lc3a/b蛋白和(i)胱天蛋白酶3和切割的胱天蛋白酶3的蛋白质印迹；和(k)用表达gfp(ad-gfp)或gfp和组成型活性rap1a(ad-63e)的腺病毒转导的人rpe中的tunel染色(*p《0.05，**p《0.01，对比ad-gfp；n＝3；i中的cc是指经细胞色素c处理的细胞裂解物)。
具体实施方式
26.通过参考其中包含的具体实施例和实例的下述详细描述以及附图及其之前和之后的描述，可更容易地理解所公开的方法和组合物。
27.应理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物并不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特定的试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在进行限制。
28.公开了可用于所公开的方法和组合物，可与所公开的方法和组合物结合使用，可用于制备所公开的方法和组合物，或者是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些材料和其它材料，并且应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能未明确公开这些化合物的每个不同个体以及共同组合和排列的特定提及，但各自在本文中特别考虑且描述。因此，如果公开了一类分子a、b和c以及一类分子d、e和f以及组合分子的例子a-d，则即使每个并未个别叙述，每个也个别且共同加以考虑。因此，在该实例中，组合a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f各自特别加以考虑，并且应该视为由a、b和c；d、e和f；以及示例组合a-d的公开内容公开。同样地，还特别考虑且公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，a-e、b-f和c-e的亚组特别加以考虑，并且应该视为由a、b和c；d、e和f；以及示例组合a-d的公开内容公开。该概念适用于本专利申请的所有方面，包含但不限于制备且使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可执行的各种另外步骤，则应理解，这些另外步骤各自可用所公开方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行，并且每个这样的组合特别加以考虑并且应该视为公开的。
29.a.定义
30.应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能会有所不同。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，所述本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
31.必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包含复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“核酸序列”包含多个此类核酸序列，提及“载体”是提及本领域技术人员已知的一种或多种载体及其等价物等。
32.表述“可操作地连接”是指启动子序列相对于所关注基因的编码序列定位，使得转录能够开始。这意味着启动子位于编码序列的上游，距离能够表达编码序列。
33.术语“同源性百分比(％)”在本文中与术语“同一性百分比(％)”可互换使用，并且是指使用序列比对程序与野生型序列比对时的核酸或氨基酸序列同一性水平。例如，如本文所使用的，80％同源性意指与通过定义的算法确定的80％序列同一性相同的事物，并且因此，给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同一性。如本文所述，序列同一性的示例性水平包含但不限于与给定序列(例如，任何本发明多肽的编码序列)的80、85、90、95、98％或更大序列同一性。可用于确定两个序列之间同一性的示例性计算机程序包含但不限于可在互联网上公开获得的blast程序套件，例如，blastn、blastx和tblastx、blastp和tblastn。另见，altschul等人,1990和altschul等人,1997。在评估与genbank dna序列和其它公共数据库中的核酸序列相对的给定核酸序列时，通常使用blastn程序进行序列搜索。对于在genbank蛋白质序列和其它公共数据库中针对氨基酸序列搜索已经在所有阅读框中翻译的核酸序列，优选blastx程序。blastn和blastx两者均使
用开放间隙罚分11.0和扩展间隙罚分1.0的默认参数运行，并使用blosum-62矩阵。(参见例如，altschul,s.f.等人,《核酸研究(nucleic acids res.)》25:3389-3402,1997)。为了确定两个或更多个序列之间的“同一性％”，使用例如mac vector版本13.0.7中的clustal-w程序对选定的序列进行优选的比对，所述程序使用默认参数进行操作，所述默认参数包含10.0的开放间隙罚分、0.1的扩展间隙罚分和blosum 30相似度矩阵。
34.如本文所使用的，术语“野生型”是指当从天然来源分离时具有该基因或基因产物的特性的基因或基因产物。
35.术语“变体”和“突变体”在本文中可互换使用。如本文所使用的，术语“突变体”是指经修饰的核酸或蛋白质，其与参考核酸或蛋白质序列相比显示出相同的特性。变体可以与参考序列具有至少65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性。在一些方面，参考序列可以是carap1a核酸序列或活性rap1a蛋白序列。变体还可以包含与本文公开的mirna序列基本上相似的核苷酸序列。“变体”可以指与参考序列在某种方式上的差异，而不仅仅是n端和/或c端核苷酸的简单缺失。变体还可以或可替代地包含至少一个取代和/或至少一个添加，也可以存在至少一个缺失。可替代地或此外，变体可以包括修饰，如相对于参考核酸或蛋白质在一个或多个位置处的非天然残基。
36.取代、缺失、插入或其任何组合可用于获得最终衍生物或变体。通常，这些改变是在几个核苷酸上完成的，以尽量减少分子的改变。然而，在某些情况下可以容忍较大的变化。
37.通常，各个变体序列之间的核苷酸同一性可以为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。因此，“变体序列”可以是与本发明的亲本或参考序列(例如野生型序列)具有指定同一性并且共享生物学功能的序列，所述生物学功能包含但不限于亲本序列的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的特异性和/或活性。例如，“变体序列”可以是与本发明的亲本或参考序列相比含有1个、2个或3个、4个核苷酸碱基变化并且共享或改善亲本序列的生物学功能、特异性和/或活性的序列。因此，“变体序列”可以是与本发明的亲本序列具有指定同一性并且共享生物学功能的序列，所述生物学功能包含但不限于亲本序列的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的特异性和/或活性。变体序列还可以共享参考序列(例如野生型序列、carap1a核酸序列或活性rap1a蛋白序列)的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的特异性和/或活性。
38.如本文所使用的，短语“核酸”是指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是dna或rna或dna-rna杂合体，单链或双链，有义或反义，其能够通过沃森-克里克碱基配对(watson-crick base-pairing)与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包含核苷酸类似物(例如，brdu)和非磷酸二酯核苷间键(例如，肽核酸(pna)或硫代二酯键)。具体地说，核酸可以包含但不限于dna、rna、cdna、gdna、ssdna、dsdna或其任何组合
39.本文提供的组合物的“有效量”意指足以提供所需效果的组合物的量。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、正在治疗的疾病(或潜在的遗传缺陷)的严重程度、所使用的特定组合物、其施用模式等。因此，不可能指定确切的“有
效量”。然而，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定适当的“有效量”。
[0040]“治疗”是指将本发明的肽、核酸、载体或组合物施用于对发生年龄相关性黄斑变性的易感性增加或患有年龄相关性黄斑变性的受试者，如人或其它哺乳动物(例如，动物模型)，以预防或延缓疾病或病状的影响的恶化，或部分或完全逆转疾病的影响。
[0041]“预防”是指将受试者发生年龄相关性黄斑变性的易感性增加的机会最小化。
[0042]“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、环境或材料可能或可能不发生或存在，并且该描述包含其中事件、环境或材料发生或存在的情况，以及其中它不发生或不存在的情况。
[0043]
范围在本文中可表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还特别考虑和认为公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解，除非上下文另有明确说明，否则该特定值形成应被视为公开的另一个特别考虑的实施例。还应理解，除非上下文另有明确说明，否则每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。最后，应当理解，除非上下文另有明确说明，否则还明确考虑了包含在明确公开的范围内的所有个别值和值的子范围，并且应当视为公开。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施例中的一些或全部，前述都适用。
[0044]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料都可用于本方法和组合物的实践或测试，但特别有用的方法、装置和材料如所述的。本文引用的出版物和对于其引用的材料在此以引用的方式并入。本文中的任何内容均不应视为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开内容。不承认任何参考文献构成现有技术。对参考文献的讨论陈述了其作者的主张，并且申请人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文提及了许多出版物，但此类参考文献并不构成承认这些文件中的任一形成本领域公知常识的部分。
[0045]
在本说明书的说明书和权利要求书自始至终，单词“包括(comprise)”和单词的变体，如“包括(comprising和comprises)”，意指“包含但不限于(including but not limited to)”，并且不旨在排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。具体地说，在描述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别考虑的是，每个步骤包括所列出的内容(除非该步骤包含限制性术语，如“由...组成”)，这意味着每个步骤不旨在排除例如未在步骤中列出的其它添加剂、组分、整数或步骤。
[0046]
b.核酸
[0047]
公开了核酸构建体，其包括编码卵黄样黄斑营养不良-2(vmd2)启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码rap1a的核酸序列。还公开了核酸构建体，其包括编码卵黄样黄斑营养不良-2(vmd2)启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到组成型活性rap1a核酸序列。还公开了核酸构建体，其包括编码卵黄样黄斑营养不良-2(vmd2)启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码活性rap1a的核酸序列。
[0048]
在一些方面，vmd2启动子是人vmd2启动子。在一些方面，人vmd2启动子可以是
[0049]
caattctgtcattttactagggtgatgaaattcccaagcaacaccatccttttcagataagggcactgaggctgagagaggagctgaaacctacccggcgtcaccacacacaggtggcaaggctgggaccagaaaccaggactg
ttgactgcagcccggtattcattctttccatagcccacagggctgtcaaagaccccagggcctagtcagaggctcctccttcctggagagttcctggcacagaagttgaagctcagcacagccccctaacccccaactctctctgcaaggcctcaggggtcagaacactggtggagcagatcctttagcctctggattttagggccatggtagagggggtgttgccctaaattccagccctggtctcagcccaacaccctccaagaagaaattagaggggccatggccaggctgtgctagccgttgcttctgagcagattacaagaagggaccaagacaaggactcctttgtggaggtcctggcttagggagtcaagtgacggcggctcagcactcacgtgggcagtgccagcctctaagagtgggcaggggcactggccacagagtcccagggagtcccaccagcctagtcgccagacc(seq id no:1)。
[0050]
在一些方面，vmd2启动子是seq id no:1的变体。在一些方面，vmd2启动子与seq id no:1具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性。
[0051]
在一些方面，编码的rap1a蛋白是活性rap1a蛋白。在一些方面，活性rap1a蛋白由组成型活性rap1a(carap1a)核酸序列编码。如本文所使用的，术语“carap1a”、“组成型活性rap1a”和“组成型活性rap1a核酸”可互换使用。换言之，组成型活性rap1a核酸序列可以编码活性rap1a蛋白。如本文所使用的，术语“活性rap1a蛋白”和“活性rap1a”可互换使用。如本文所使用的，在一些方面，活性rap1a蛋白是人rap1a蛋白。在一些方面，编码人活性rap1a的组成型活性rap1a核酸序列可以是
[0052]
atgcgggaatacaagcttgtggtgctgggctctggaggcgtgggaaagagtgcgttaaccgtccagtttgtgcagggcatctttgtggagaagtatgatcccactatagaggactcctaccggaaacaggtggaggtcgactgtcagcaatgtatgctggagatcttagacactgcaggtacagaagaatttactgccatgcgggacctgtacatgaagaacgggcagggcttcgctctggtatattccatcaccgctcagtcaacctttaacgaccttcaggatcttcgcgagcagatcctacgcgtgaaagatacagaggacgtcccaatgatactagtgggcaacaagtgtgacctggaggatgaacgggttgtgggcaaggagcagggtcagaacctggccaggcagtggtgcaactgtgcctttctggaatctagcgccaagtccaagatcaacgtaaacgagatcttctacgacctagtacgtcagattaaccggaagacacctgtggagaagaagaaacctaagaagaaatcctgcctgcttctctga(seq id no:2)。
[0053]
在一些方面，组成型活性rap1a是seq id no:2的变体。在一些方面，组成型活性rap1a与seq id no:2具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性。在一些方面，组成型活性rap1a的变体必须包括上文seq id no:2中下划线所示的gaa。因此，在一些方面，组成型活性rap1a的变体的百分比同一性可以是与seq id no:2具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性，并且包括上文seq id no:2中所示的带下划线的gaa序列。在一些方面，存在于带下划线的gaa处的密码子编码谷氨酸。在一些方面，组成型活性rap1a的变体可以包括在seq id no:2中带下划线的gaa位置处编码谷氨酸的任何密码子。野生型rap1a核酸序列在与seq id no:2中的gaa位置对应的序列处编码谷氨酰胺。因此，在一些方面，包括导致氨基酸从谷氨酰胺变为谷氨酸的核酸突变的核酸序列可以是组成型活性rap1a核酸序列。
[0054]
在一些方面，组成型活性rap1a是seq id no:3的变体。
[0055]
atgcgtgagtacaagctagtggtccttggttcaggaggcgttgggaagtctgctctgacagttcagtttgtcagggaatttttgttgaaaaatatgacccaacgatagaagattcctacagaaagcaagttgaagtcgattgccaacagtgtatgctcgaaatcctggatactgcagggacagagcaatttacagcaatgagggatttgtatatgaagaacggccaaggttttgcactagtatattctattacagctcagtccacgtttaacgacttacaggacctgagggaacagattttacgggttaaggacacggaagatgttccaatgattttggttggcaataaatgtgacctggaagatgagcgagtagttggcaaagagcagggccagaatttagcaagacagtggtgtaactgtgcctttttagaatcttctgcaaagtc
aaagatcaatgttaatgagatattttatgacctggtcagacagataaataggaaaacaccagtggaaaagaagaagcctaaaaagaaatcatgtctgctgctctag(seq id no:3)
[0056]
在一些方面，组成型活性rap1a与seq id no:3具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性。在一些方面，组成型活性rap1a的变体必须包括对gaa的caa(seq id no:3中带下划线)突变。在一些方面，除了caa到gaa突变之外，还可能存在其它突变。因此，在一些方面，组成型活性rap1a的变体的百分比同一性可以是与seq id no:3具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性，并且至少包括带下划线的caa到gaa序列的突变。因此，经编码的活性rap1a包括谷氨酰胺到谷氨酸的突变。
[0057]
在一些方面，组成型活性rap1a编码活性rap1a。活性rap1a的实例可以是
[0058]
mreyklvvlgsggvgksaltvqfvqgifvekydptiedsyrkqvevdcqqcmleildtagteeftamrdlymkngqgfalvysitaqstfndlqdlreqilrvkdtedvpmilvgnkcdledervvgkeqgqnlarqwcncaflessakskinvneifydlvrqinrktpvekkkpkkksclll(seq id no:4)。
[0059]
在一些方面，活性rap1a与seq id no:4具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性。在一些方面，活性rap1a的变体必须包括第63位的谷氨酸(e)，如上文seq id no:4中粗体所示。因此，在一些方面，活性rap1a的变体的百分比同一性可以是与seq id no:4具有65、70、75、80、85、90、95或99％的同源性，并且至少包括上文seq id no:4中所示的加粗的e氨基酸。在某些方面，活性rap1a和野生型rap1a是相同的，除了活性rap1a中第63位的q
→
e突变。
[0060]
在一些方面，任何公开的核酸构建体可以进一步包括编码标志物的核酸序列。例如，公开了包括编码vmd2启动子的核酸序列的核酸构建体，所述启动子可操作地连接到编码活性rap1a的核酸序列，所述核酸构建体进一步包括编码标志物的核酸序列。
[0061]
在一些方面，标志物可以是标签。在一些方面，标志物基因可以是编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacz基因，或编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。在一些方面，标志物可以是可选择标志物。适用于哺乳动物细胞的可选择标志物的实例是二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物g418、水霉素和嘌呤霉素。
[0062]
在一些方面，vmd2启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。诱导型启动子是其活性可以通过特定环境条件或特定化合物的存在来控制的启动子；因此，它们可以控制所关注基因(例如组成型活性rap1a)的表达。在一些方面，启动子可以来源于天然基因或者它们可以包含合成的dna片段。
[0063]
在一个方面，本文公开了在本文公开的构建体内包括诱导型启动子的组合物，使得可以打开和关闭所选基因(例如，组成型活性rap1a)的转录。这可以最大限度地减少有时可能由细胞毒性病毒蛋白的表达引起的细胞毒性，从而增加含有载体的细胞的稳定性。例如，vsv-g(包膜蛋白)和vpr的高水平表达可能具有细胞毒性(yee,j.-k.等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)》,91:9654-9568(1994)并且因此，这些蛋白质在本发明的包装细胞中的表达可以由诱导型操纵子系统控制，如诱导型tet操纵子系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的gibco brl公司(gibco brl,carlsbad,california))，从而允许通过培养基中四环素的浓度来严格调节基因表达(即，逆转录病毒颗粒的产生)。也就是说，使用tet操纵子系统，在存在四环素的情况下，四环素与tet反式激活子融合蛋白(tta)结合，从而防止tta与tet操纵子序列结合并允许基因在tet操纵子序列控制下的表达(gossen等人
(1992)《美国国家科学院院刊(pnas)》89:5547-5551)，由于其对tta的教导和允许基因在tet操纵子序列控制下的表达，所述文献通过引用整体并入本文。在不存在四环素的情况下，tta与tet操纵子序列结合，从而阻止基因在tet操纵子控制下的表达。
[0064]
可用于蛋白质受控表达的其它诱导型操纵子系统的实例可以包含1)响应于金属离子的诱导型真核启动子(例如，金属硫蛋白启动子)、糖皮质激素和2)大肠杆菌的lacswitch
tm
诱导型哺乳动物表达系统(stratagene)(加利福尼亚州拉荷亚市(la jolla,california))。简而言之，在大肠杆菌乳糖操纵子中，lac阻遏物作为同源四聚体与lac操纵子结合，从而阻断lac2基因的转录。如异乳糖(一种生理诱导剂)或异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，一种合成诱导剂)等诱导剂与lac阻遏物结合，从而引起构象变化并有效降低阻遏物对操纵子的亲和力。当从操纵子中移除阻遏物时，乳糖操纵子的转录恢复。
[0065]
c.载体
[0066]
公开了包括本文公开的任何核酸构建体的载体。
[0067]
术语“表达载体”包含含有处于适合细胞表达的形式(例如，连接到转录控制元件)的基因构建体的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的常用形式。此外，本发明旨在包含用于等效功能的其它载体。
[0068]
在一些方面，载体可以是病毒载体。例如，病毒载体可以是腺相关病毒载体。在一些方面，载体可以是非病毒载体，如基于dna的载体。
[0069]
i.病毒和非病毒载体
[0070]
有许多组合物和方法可用于在体外或体内将所公开的核酸递送至细胞。这些方法和组合物可以主要分为两类：基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如，核酸可以通过许多直接递送系统(如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒)进行递送，或通过在细胞或载体(如阳离子脂质体)中转移遗传物质进行递送。合适的转染方法，包含病毒载体、化学转染子或物理-机械方法(如电穿孔和dna的直接扩散)，描述于以下文献中：例如，wolff,j.a.等人,《科学(science)》,247,1465-1468,(1990)；和wolff,j.a.《自然(nature)》,352,815-818,(1991)。此类方法在本领域中是众所周知的并且很容易适用于与本文所述的组合物和方法一起使用。在某些情况下，这些方法将被修改为专门用于大dna分子。进一步地，这些方法可以用于通过利用载体的靶向特性来靶向某些疾病和细胞群。
[0071]
表达载体可以是用于将基因或基因片段递送到细胞中的任何核苷酸构建体(例如，质粒)，或作为递送基因或基因片段的一般策略的一部分，例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(ram等人《癌症研究(cancer res.)》53:83-88,(1993))。例如，本文公开了包括能够编码vmd2启动子的核酸序列的表达载体，所述启动子可操作地连接到编码rap1a的核酸序列。
[0072]
表达载体中存在的“控制元件”是载体的那些非翻译区
–
增强子、启动子、5'和3'非翻译区
–
它们与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可能有所不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包含组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，如pbluescript噬菌粒(加利福尼亚州拉荷亚市的stratagene公司(stratagene,la jolla,calif.))或psport1质粒(马里兰州盖瑟斯堡市的gibco brl公司(gibco brl,
gaithersburg,md.))等的杂合lacz启动子。如果需要产生含有编码多肽的序列的多个拷贝的细胞系，则基于sv40或ebv的载体可以有利地与适当的可选择标志物一起使用。
[0073]
增强子通常是指在距离转录起始位点无固定距离处发挥作用并且可以位于转录单位的5'(laimins,l.等人,《美国国家科学院院刊》78:993(1981))或3'(lusky,m.l.等人,《分子细胞生物学(mol.cell bio.)》3:1108(1983))的dna序列。此外，增强子可以在内含子内(banerji,j.l.等人,《细胞(cell)》33:729(1983))以及在编码序列本身内(osborne,t.f.等人,《分子细胞生物学》4:1293(1984))。增强子的长度通常介于10bp与300bp之间，并且增强子以顺式发挥作用。增强子用于增加来自附近启动子的转录。增强子还通常含有介导转录调节的应答元件。启动子还可以含有介导转录调节的应答元件。增强子通常决定基因表达的调节。虽然现在已知许多来自哺乳动物基因的增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素)，但通常会使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选的实例是复制起点后侧的sv40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
[0074]
启动子或增强子可以通过触发其功能的光或特定化学事件而被特异性地激活。系统可以通过如四环素和地塞米松等试剂进行调节。还有一些方法可以通过暴露于辐射(如γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达。
[0075]
任选地，启动子或增强子区域可以充当组成型启动子或增强子以使本发明的多核苷酸的表达最大化。在某些构建体中，启动子或增强子区域在所有真核细胞类型中都具有活性，即使它仅在特定时间在特定类型的细胞中表达。
[0076]
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可以含有可能影响mrna表达的转录终止所必需的序列。这些区域被转录为编码组织因子蛋白的mrna的非翻译部分中的多腺苷酸化片段。3'非翻译区还包含转录终止位点。优选的是，转录单位还含有多腺苷酸化区域。该区域的一个好处是它增加了转录单元像mrna一样被加工和运输的可能性。表达构建体中多聚腺苷酸化信号的鉴定和使用已被充分确立。优选的是，在转基因构建体中使用同源多聚腺苷酸化信号。在某些转录单位中，多腺苷酸化区域源自sv40早期多腺苷酸化信号，并且由约400个碱基组成。
[0077]
表达载体可以包含编码标志物产物的核酸序列。该标志物产物可用于确定基因是否已被递送至细胞并且一旦递送即被表达。标志物基因可以包含但不限于编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacz基因和编码绿色荧光蛋白的基因。
[0078]
在一些实施例中，标志物可以是可选择标志物。适用于哺乳动物细胞的可选择标志物的实例是二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物g418、水霉素和嘌呤霉素。当此类可选择标志物被成功地转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性应激下，经转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类基于细胞的新陈代谢并使用缺乏独立于补充培养基生长的能力的突变细胞系。两个实例是cho dhfr细胞和鼠ltk细胞。这些细胞在不添加如胸苷或次黄嘌呤等营养物的情况下缺乏生长能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成通路所必需的某些基因，因此除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的另一种替代方案是将完整的dhfr或tk基因引入缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长要求。未用dhfr或tk基因转化的单个细胞将无法在未添加补充剂的培养基中存活。
[0079]
可以与本文公开的组合物和方法一起使用的另一种类型的选择是显性选择，其是指在任何细胞类型中使用的选择方案并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞会表达一种传递耐药性的蛋白质，并能在选择中存活下来。这种主要选择的实例使用药物新霉素(southern p.和berg,p.,《分子与应用遗传学杂志(j.molec.appl.genet.)》1:327(1982))、霉酚酸(mulligan,r.c.和berg,p.《科学》209:1422(1980))或潮霉素(sugden,b.等人,《分子细胞生物学》5:410-413(1985))。这三个实例分别采用真核控制下的细菌基因来传递对适当药物g418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它包含新霉素类似物g418和普拉霉素。
[0080]
如本文所使用的，质粒或病毒载体是在无降解的情况下将所公开的核酸(如能够编码一种或多种所公开的肽的核酸序列)运输到细胞中并且包含启动子的药剂，所述启动子在基因被递送到的细胞中产生该基因的表达。在一些实施例中，本文公开的核酸序列源自病毒或逆转录病毒。病毒载体是例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、aids病毒、神经元营养病毒、辛德毕斯(sindbis)病毒和其它rna病毒，包含具有hiv骨架的这些病毒。还优选共享这些病毒的性质的任何病毒家族，所述性质使它们适合用作载体。逆转录病毒包含鼠马洛尼白血病病毒、mmlv和表达mmlv的期望性质的逆转录病毒作为载体。与其它病毒载体相比，逆转录病毒载体能够携带更大的遗传有效载荷，即转基因或标志物基因，因此是常用的载体。然而，它们在非增殖细胞中没有那么有用。腺病毒载体相对稳定且易于使用，具有高滴度，并且可以以气雾调配物形式递送，并且可以转染非分裂细胞。痘病毒载体很大，并且有几个插入基因的位点，它们是热稳定的并且可以在室温下储存。优选的实施例是病毒载体，所述病毒载体经过工程改造以抑制由病毒抗原引发的宿主生物体的免疫应答。这种类型的优选载体将携带白细胞介素8或10的编码区。
[0081]
与将基因引入细胞中的化学或物理方法相比，病毒载体可以具有更高的交易能力(即，引入基因的能力)。通常，病毒载体含有非结构性早期基因、结构性晚期基因、rna聚合酶iii转录物、复制和衣壳化所必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组转录和复制的启动子。当被工程改造为载体时，病毒通常会去除一个或多个早期基因，并且将基因或基因/启动子盒插入病毒基因组中以代替去除的病毒dna。这种类型的构建体可以携带多达约8kb的外来遗传物质。去除的早期基因的必要功能通常由细胞系提供，所述细胞系经过工程改造以反式表达早期基因的基因产物。
[0082]
通常，逆转录病毒载体由以下文献描述：verma,i.m.,“用于基因转移的逆转录病毒载体(retroviral vectors for gene transfer.)”《微生物学(microbiology)》,美国微生物学会(amer.soc.for microbiology),第229-232页,华盛顿(washington),(1985)，所述文献特此通过引用整体并入。用于使用逆转录病毒载体进行基因疗法的方法的实例描述于以下文献中：美国专利第4,868,116号和第4,980,286号；pct申请wo 90/02806和wo 89/07136；和mulligan(《科学》260:926-932(1993))；由于其对用于使用逆转录病毒载体进行基因疗法的方法的教导，所述文献的教导通过引用整体并入本文。
[0083]
逆转录病毒本质上是一种包装，其中已装入核酸货物。核酸货物携带一个包装信号，所述包装信号确保复制的子分子将被有效地包装在包装外壳内。除了包装信号外，还有许多顺式所需的分子，用于复制和包装复制的病毒。通常，逆转录病毒基因组含有参与蛋白质外壳形成的gag、pol和env基因。通常被外源dna替代的gag、pol和env基因将被转移到靶
细胞。逆转录病毒载体通常含有用于掺入包装外壳的包装信号、指示gag转录单位的开始的序列、逆转录所必需的元件，包含：引物结合位点，其用于结合逆转录的trna引物；末端重复序列，其在dna合成过程中指导rna链的转换；富含嘌呤的序列5'到3'ltr，其用作合成dna合成的第二链的引发位点；以及靠近ltr末端的特定序列，其使逆转录病毒的dna状态能够插入宿主基因组中。取决于每个转录物的大小，该数量的核酸足以递送一对多的基因。优选的是，在插入物中包含阳性或阴性可选择标志物以及其它基因。
[0084]
由于大多数逆转录病毒载体中的复制机器和包装蛋白已被去除(gag、pol和env)，因此通常通过将它们置于包装细胞系中来产生载体。包装细胞系是已经用含有复制和包装机器但缺乏任何包装信号的逆转录病毒转染或转化的细胞系。当携带所选dna的载体被转染到这些细胞系中时，通过辅助细胞以顺式方式提供的机器，含有所关注基因的载体被复制并包装成新的逆转录病毒颗粒。用于机器的基因组没有被包装，因为它们缺乏必要的信号。
[0085]
已经描述了复制缺陷型腺病毒的构建(berkner等人.,《病毒学杂志(j.virology)》61:1213-1220(1987)；massie等人,《分子细胞生物学》6:2872-2883(1986)；haj-ahmad等人,《病毒学杂志》57:267-274(1986)；davidson等人,《病毒学杂志》61:1226-1239(1987)；zhang“通过脂质体介导的转染和pcr分析产生和鉴定重组腺病毒(generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and pcr analysis)”《生物技术(biotechniques)》15:868-872(1993))。使用这些病毒作为载体的好处是它们可以传播到其它细胞类型的程度受到限制，因为这些病毒可以在初始感染的细胞内复制，但不能形成新的感染性病毒颗粒。已显示重组腺病毒在体内直接递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、cns实质和许多其它组织部位后实现高效基因转移(morsy,《临床研究杂志(j.clin.invest.)》92:1580-1586(1993)；kirshenbaum,《临床研究杂志》92:381-387(1993)；roessler,《临床研究杂志》92:1085-1092(1993)；moullier,《自然遗传学(nature genetics)》4:154-159(1993)；la salle,《科学》259:988-990(1993)；gomez-foix,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》267:25129-25134(1992)；rich,《人类基因疗法(human gene therapy)》4:461-476(1993)；zabner,《自然遗传学》6:75-83(1994)；guzman,《循环研究(circulation research)》73:1201-1207(1993)；bout,《人类基因疗法》5:3-10(1994)；zabner,《细胞》75:207-216(1993)；caillaud,《欧洲神经科学杂志(eur.j.neuroscience)》5:1287-1291(1993)；和ragot,《普通病毒学杂志(j.gen.virology)》74:501-507(1993))，由于其对用于使用逆转录病毒载体进行基因疗法的方法的教导，所述文献的教导通过引用整体并入本文。重组腺病毒通过与特定细胞表面受体结合来实现基因转导，然后病毒通过受体介导的内吞作用以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式内化(chardonnet和dales,《病毒学(virology)》40:462-477(1970)；brown and burlingham,《病毒学杂志》12:386-396(1973)；svensson和persson,《病毒学杂志》55:442-449(1985)；seth等人,《病毒学杂志》51:650-655(1984)；seth等人,《分子细胞生物学》,4:1528-1533(1984)；varga等人,《病毒学杂志》65:6061-6070(1991)；wickham等人,《细胞》73:309-319(1993))。
[0086]
病毒载体可以是基于去除了e1基因的腺病毒的载体，并且这些病毒在如人293细胞系等细胞系中产生。任选地，从腺病毒基因组中去除e1和e3基因。
[0087]
可用于将本发明的多核苷酸引入细胞中的另一类病毒载体基于腺相关病毒(aav)。这种有缺陷的细小病毒是一种优选的载体，因为它可以感染许多细胞类型并且对人类没有致病性。aav型载体可以运输约4到5kb，并且已知野生型aav可稳定插入第19号染色体。优选含有这种位点特异性整合性质的载体。这类载体的一个特别优选的实施例是由加利福尼亚州旧金山市的阿维根公司(avigen,san francisco,ca)生产的p4.1 c载体，其可以含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因hsv-tk或标志物基因，如编码绿色荧光蛋白gfp的基因。
[0088]
在另一种类型的aav病毒中，aav含有一对反向末端重复序列(itr)，其侧接至少一个盒，所述盒含有指导与异源基因可操作地连接的细胞特异性表达的启动子。本文中的异源是指非aav或b19细小病毒天然的任何核苷酸序列或基因。通常已删除aav和b19编码区，从而产生安全、无细胞毒性的载体。aav itr或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不赋予细胞毒性，并且启动子指导细胞特异性表达。美国专利第6,261,834号通过引用整体并入本文，用于与aav载体相关的材料。
[0089]
病毒和逆转录病毒载体中的插入基因通常含有启动子或增强子以帮助控制所需基因产物的表达。启动子通常是当相对于转录起始位点位于相对固定的位置时发挥作用的一个或多个dna序列。启动子含有rna聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和应答元件。
[0090]
其它有用的系统包含，例如，复制和宿主限制的非复制牛痘病毒载体。此外，所公开的核酸序列可以在基于非核酸的系统中递送至靶细胞。例如，所公开的多核苷酸可以通过电穿孔、或通过脂质转染、或通过磷酸钙沉淀来递送。所选择的递送机制将部分取决于所靶向的细胞的类型以及递送是在例如体内还是体外发生。
[0091]
因此，除了所公开的表达载体之外，组合物还可以包括脂质，如脂质体，如阳离子脂质体(例如，dotma、dope、dc-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体可以进一步包括有助于靶向特定细胞的蛋白质。包括肽和阳离子脂质体的组合物的施用可以施用至血液、靶器官，或被吸入呼吸道以靶向呼吸道细胞。例如，可以将包括本文所述的肽或核酸序列以及阳离子脂质体的组合物施用于受试者肺细胞。关于脂质体，参见例如，brigham等人《美国呼吸细胞与分子生物学杂志(am.j.resp.cell.mol.biol.)》1:95-100(1989)；felgner等人《美国国家科学院院刊》84:7413-7417(1987)；美国专利第4,897,355号。此外，化合物可以作为微胶囊的组分施用，所述微胶囊可以靶向特定的细胞类型，如巨噬细胞，或者其中化合物的扩散或化合物从微胶囊的递送被设计用于特定的速率或剂量。
[0092]
d.组合物
[0093]
公开了包括所公开的核酸构建体或载体的组合物。公开了包括核酸构建体的组合物，其中所述核酸构建体包括编码vmd2启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到组成型活性rap1a核酸序列。公开了包括核酸构建体的组合物，其中所述核酸构建体包括编码vmd2启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码活性rap1a的核酸序列。还公开了包括载体(如病毒载体)的组合物，所述载体包括核酸构建体，其中所述核酸构建体包括编码vmd2启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码活性rap1a的核酸序列。
[0094]
所公开的组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。
[0095]
1.组合物的递送
[0096]
在本文所述的方法中，可通过多种机制将组合物递送(或施用)至细胞。如上文所
定义的，本文公开了包括本文所述的任何一种或多种肽、核酸和/或载体的组合物，其可用于产生还可包含载体(如药学上可接受的载体)的组合物。例如，公开了包括本文所公开的肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0097]
例如，本文所述的组合物可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”是指一种材料或载体，如本领域技术人员所熟知的，所述材料或载体将被选择以使活性成分的任何降解最小化和对受试者的任何不利副作用最小化。载体的实例包含二肉豆蔻酰磷脂酰(dmpc)、磷酸盐缓冲盐水或多泡脂质体。例如，pg:pc:胆固醇:肽或pc:肽可用作本发明中的载体。在以下文献中描述了其它合适的药学上可接受的载体及其调配物：《雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》(第19版)编者：a.r.gennaro,宾夕法尼亚州伊斯顿市的麦克出版公司(mack publishing company,easton,pa)1995。通常，在配制中使用适当量的药学上可接受的盐以使调配物等渗。药学上可接受的载体的其他实例包含但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。溶液的ph可以为约5到约8，或约7到约7.5。另外的载体包含持续释放制剂，如含有该组合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品的形式，例如膜、支架(在血管成形术过程中植入血管中)、脂质体或微颗粒。对本领域技术人员来说显而易见的是，某些载体可能是更优选的，这取决于例如施用途径和所施用的组合物的浓度。这些最典型的将是用于向人类施用药物的标准载体，包含如无菌水、盐水和处于生理ph的缓冲溶液等溶液。
[0098]
药物组合物还可以包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂等，只要不损害本发明的多肽、肽、核酸、载体的预期活性。药物组合物还可以包含一种或多种活性成分(除了本发明的组合物外)，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。取决于需要局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用药物组合物。
[0099]
肠胃外施用的制剂包含无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包含水、醇性/水溶液、乳液或悬浮液，包含盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内媒剂包含流体和营养物补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的补充剂)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0100]
用于局部施用的调配物可以包含油膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。
[0101]
用于口服施用的组合物包含粉末或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。一些组合物可以潜在地作为药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐施用，所述盐通过与无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)反应形成，或通过与无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(例如单、二、三烷基胺和芳基胺以及经取代的乙醇胺)反应形成。
[0102]
所公开的递送技术不仅可以用于所公开的组合物，还可以用于所公开的核酸构建体和载体。
[0103]
e.重组细胞
[0104]
公开了包括一种或多种所公开的核酸构建体或载体的重组细胞。例如，公开了包括核酸构建体的重组细胞，其中所述核酸构建体包括编码vmd2启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码rap1a的核酸序列。
[0105]
在一些方面，细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，细胞是视网膜色素上皮(rpe)细胞。
[0106]
f.治疗方法
[0107]
公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者。
[0108]
在一些方面，组合物通过视网膜下施用来施用。在一些方面，组合物通过玻璃体内施用来施用。在一些方面，组合物通过玻璃体内施用来施用，并且组合物包括浓度为5x10
12
个病毒颗粒的7m8 aav载体构建体。其它已知的施用途径也可以与所公开的方法一起使用。
[0109]
在所公开的治疗方法的一些方面，可以增加受试者中活性rap1的表达而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，其中在受试者中增加rap1的表达而不增加受试者中自噬或细胞凋亡的标志物。在一些方面，可以增加受试者视网膜上皮细胞中活性rap1的表达，而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，其中可以在受试者的视网膜上皮细胞中增加活性rap1的表达，而不增加受试者的视网膜上皮细胞中自噬或细胞凋亡的标志物。
[0110]
在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少两倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
[0111]
在一些方面，所公开的载体之一的最佳剂量可以是用于视网膜下注射的5x108个病毒颗粒。在一些方面，剂量可以是但不限于2.5x108、3x108、3.5x108、4x108、4.5x108、5x108、5.5x108、6x108、6.5x108、7x108、7.5x108、8x108、8.5x108、9x108、9.5x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109。在一些方面，具体地说，玻璃体内注射，剂量可以更高。例如，更高的剂量可以是但不限于5x10
11
、5.5x10
11
、6x10
11
、6.5x10
11
、7x10
11
、7.5x10
11
、8x10
11
、8.5x10
11
、9x10
11
、9.5x10
11
、1x10
12
、2x10
12
、3x10
12
、4x10
12
、5x10
12
、6x10
12
、7x10
12
、8x10
12
或9x10
12
。
[0112]
公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，同时将一种或多种抗vegf剂施用于所述受试者。公开了治疗患有年龄相关性黄斑变性的受试者的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，并且所述方法进一步包括将一种或多种抗vegf剂施用于所述受试者。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以同时施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以
在单一调配物中共同施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单独的调配物中施用。因此，无论核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂是一起配制在单一调配物中还是配制在单独的调配物中，它们仍然可以同时施用。同时施用可以包含在彼此完全相同的时间，在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟之内施用核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂。
[0113]
g.抑制方法
[0114]
公开了抑制脉络膜新生血管(cnv)的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物。
[0115]
还公开了减少cnv的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物。公开了减少受试者的cnv的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者。
[0116]
在一些方面，所公开方法中的施用是视网膜下或玻璃体内施用。在一些方面，可以通过静脉内途径施用。
[0117]
在所公开的治疗方法的一些方面，可以增加受试者中活性rap1a的表达而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少受试者的cnv的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，其中在受试者中增加活性rap1的表达而不增加受试者中自噬或细胞凋亡的标志物。在一些方面，可以增加受试者视网膜上皮细胞中活性rap1的表达，而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少受试者的cnv的方法，所述方法包括将一种或多种所公开的核酸构建体、载体或组合物施用于有需要的受试者，其中在受试者的视网膜上皮细胞中增加活性rap1的表达，而不增加受试者的视网膜上皮细胞中自噬或细胞凋亡的标志物。
[0118]
在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少两倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
[0119]
在一些方面，所公开的载体之一的最佳剂量可以是用于视网膜下注射的5x108个病毒颗粒。在一些方面，剂量可以是但不限于2.5x108、3x108、3.5x108、4x108、4.5x108、5x108、5.5x108、6x108、6.5x108、7x108、7.5x108、8x108、8.5x108、9x108、9.5x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109。在一些方面，具体地说，玻璃体内注射，剂量可以更高。例如，更高的剂量可以是但不限于5x10
11
、5.5x10
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、6x10
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、7x10
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、8x10
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或9x10
12
。
[0120]
公开了抑制或减少cnv的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，并且所述方法进一步包括将一种或多种抗vegf剂施用于所述受试者。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以同时施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单一调配物中共同施用。在一些方面，核酸构建体、载
体或组合物和抗vegf剂可以在单独的调配物中施用。因此，无论核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂是一起配制在单一调配物中还是配制在单独的调配物中，它们仍然可以同时施用。同时施用可以包含在彼此完全相同的时间，在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟之内施用核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂。
[0121]
h.减少炎症信号传导的方法
[0122]
公开了减少脉络膜组织中的炎症信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物。
[0123]
在一些方面，所公开方法中的施用是视网膜下、玻璃体内或静脉内施用。
[0124]
在所公开方法的一些方面，可以增加受试者中活性rap1a的表达而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少脉络膜组织中的炎症信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，其中在受试者中增加活性rap1a的表达而不增加受试者中自噬或细胞凋亡的标志物。在一些方面，可以增加受试者视网膜上皮细胞中活性rap1a的表达，而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少脉络膜组织中的炎症信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，其中可以在受试者的视网膜上皮细胞中增加活性rap1a的表达，而不增加受试者的视网膜上皮细胞中自噬或细胞凋亡的标志物。
[0125]
在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少两倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
[0126]
在一些方面，所公开的载体之一的最佳剂量可以是用于视网膜下注射的5x108个病毒颗粒。在一些方面，剂量可以是但不限于2.5x108、3x108、3.5x108、4x108、4.5x108、5x108、5.5x108、6x108、6.5x108、7x108、7.5x108、8x108、8.5x108、9x108、9.5x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109。在一些方面，具体地说，玻璃体内注射，剂量可以更高。例如，更高的剂量可以是但不限于5x10
11
、5.5x10
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、6x10
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、6.5x10
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或9x10
12
。
[0127]
公开了减少脉络膜组织中的炎症信号传导的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，并且所述方法进一步包括将一种或多种抗vegf剂施用于所述受试者。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以同时施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单一调配物中共同施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单独的调配物中施用。因此，无论核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂是一起配制在单一调配物中还是配制在单独的调配物中，它们仍然可以同时施用。同时施用可以包含在彼此完全相同的时间，在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26
分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟之内施用核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂。
[0128]
i.减少vegf表达的方法
[0129]
公开了减少脉络膜组织中的vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物。
[0130]
在一些方面，所公开方法中的施用是视网膜下、玻璃体内或静脉内施用。
[0131]
在所公开的治疗方法的一些方面，可以增加受试者中活性rap1a的表达而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少脉络膜组织中的vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，其中在受试者中增加活性rap1a的表达而不增加受试者中自噬或细胞凋亡的标志物。在一些方面，可以增加受试者视网膜上皮细胞中活性rap1a的表达，而不增加自噬或细胞凋亡的标志物。例如，公开了减少脉络膜组织中的vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，其中可以在受试者的视网膜上皮细胞中增加活性rap1a的表达，而不增加受试者的视网膜上皮细胞中自噬或细胞凋亡的标志物。
[0132]
在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少两倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。在一些方面，活性rap1a的表达水平可以是对照受试者中活性rap1a的表达水平的至少10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。
[0133]
在一些方面，所公开的载体之一的最佳剂量可以是用于视网膜下注射的5x108个病毒颗粒。在一些方面，剂量可以是但不限于2.5x108、3x108、3.5x108、4x108、4.5x108、5x108、5.5x108、6x108、6.5x108、7x108、7.5x108、8x108、8.5x108、9x108、9.5x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109。在一些方面，具体地说，玻璃体内注射，剂量可以更高。例如，更高的剂量可以是但不限于5x10
11
、5.5x10
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、7x10
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或9x10
12
。
[0134]
公开了减少脉络膜组织中的vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用任何所公开的核酸构建体、载体或组合物，并且所述方法进一步包括将一种或多种抗vegf剂施用于所述受试者。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以同时施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单一调配物中共同施用。在一些方面，核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂可以在单独的调配物中施用。因此，无论核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂是一起配制在单一调配物中还是配制在单独的调配物中，它们仍然可以同时施用。同时施用可以包含在彼此完全相同的时间，在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟之内施用核酸构建体、载体或组合物和抗vegf剂。
[0135]
j.试剂盒
[0136]
上述材料以及其它材料可以以任何合适的组合形式包装在一起，作为用于执行或帮助执行所公开的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计并适用于在所公开的方法中一起使用，则它是有用的。例如，公开了包括一种或多种所公开的核酸构建体、
载体或组合物的试剂盒。还公开了用于制备任何所公开的载体的试剂盒，所述试剂盒包括核酸构建体，所述核酸构建体包括编码vmd2启动子的核酸序列，所述启动子可操作地连接到编码rap1a的核酸序列。所述试剂盒还可以含有载体骨架。
[0137]
实例
[0138]
发现gtpase蛋白rap1a的活化可保护rpe的屏障功能免受炎症应激。在激光诱导的脉络膜新生血管(cnv)的小鼠模型中，rpe和脉络膜组织中的rap1活性降低，但玻璃体内递送8-cpt-2me-camp以活化内源性rap1抑制了激光诱导的cnv。基因疗法被研究为一种专门针对rpe的方法，并可能减少玻璃体内递送所需的治疗次数。由于缺乏致病性、低免疫原性、与玻璃体内中和抗体或药物相比相对长期的转基因表达以及高转导效率，腺病毒相关病毒(aav)载体正在成为治疗视网膜变性的有前景的工具。为了增加rpe中的活性rap1a，组成型活性rap1a(carap1a)在由rpe65启动子(sc-aav2-rpe65)驱动的自身互补型aav2(sc-aav2)病毒载体中递送，并被发现可减少rap1b缺陷型小鼠中的实验性cnv，但不减少野生型小鼠中的实验性cnv。
[0139]
预计野生型小鼠中通过sc-aav2-rpe65递送的carap1a不充分减少cnv与rpe65启动子的弱转录活性有关。为了测试这种可能性，将rpe65启动子与rpe的另一种特定启动子，卵黄样黄斑营养不良-2(vmd2)进行了比较。在驱动rpe中carap1a的表达和减少野生型小鼠中的实验性cnv方面比较了两种启动子rpe65和vmd2。在这项研究中，外源性carap1a表达的影响也在用两种不同启动子rpe65和vmd2治疗的眼睛中进行了评估和比较。
[0140]
1.结果
[0141]
由vmd2启动子驱动的自身互补型腺相关病毒2(sc-aav2)的产生。本研究中使用了带有绿色荧光蛋白(gfp)标签的自身互补型腺相关病毒2(sc-aav2)。产生了由单独表达gfp或活性rap1a(carap1a)(图1a)的鼠rpe65启动子驱动的sc-aav2。为了比较rpe65和vmd2启动子在rpe中递送活性rap1a的转录活性，将鼠vmd2启动子克隆到sc-aav2载体中以替代rpe65启动子，从而驱动gfp或gfp和活性rap1a(carap1a)(图1b)。
[0142]
sc-aav2转导和rap1表达的体内分析。了确定病毒转导效率，将5x108个病毒颗粒/μl的sc-aav2-rpe65或sc-aav2-vmd2病毒递送到6周龄的野生型小鼠双眼的视网膜下空间中。在注射后第5周，使用micron iv视网膜实时成像系统通过gfp可视化确定病毒转导。如图2a所示，sc-aav2-rpe65和sc-aav2-vmd2均显示出gfp表达，而注射了pbs的眼睛未显示出gfp表达。为了确认病毒转导靶向rpe，收获gfp阳性眼睛，并用gfp和rpe65抗体对rpe/脉络膜冷冻切片进行免疫标记。经sc-aav2-rpe65和sc-aav2-vmd2病毒处理的眼睛均显示出gfp与rpe65共标记(图2b)，这表明两种病毒载体都可以转导野生型小鼠的rpe。为了进一步确定aav2病毒转导的特异性，在整个视网膜冷冻切片中进行了gfp免疫染色。在经sc-aav2-rpe65处理的视网膜中，gfp免疫标记不仅位于rpe层，还位于视网膜神经节细胞和光感受器外节(pr/os)；然而，在经sc-aav2-vmd2处理的视网膜中，gfp免疫标记仅在rpe和pr/os层中发现(图3a)，这表明了sc-aav2-vmd2载体在转导rpe方面具有更高的特异性。
[0143]
通过使用针对总rap1的抗体的蛋白质印迹，在视网膜下注射5周后，在来自gfp阳性眼睛的rpe/脉络膜组织中确定rap1a蛋白水平。如图3b和c所示，与sc-aav2-vmd2-gfp相比，在经sc-aav2-carap1a处理的rpe/脉络膜裂解物中rap1蛋白显著增加。然而，与sc-aav2-rpe65-gfp相比，用sc-aav2-rpe65-carap1a治疗的眼睛并未显示出rap1蛋白增加。图
2和图3中的数据提供了以下证据：sc-aav2-rpe65和sc-aav2-vmd2均转导了野生型小鼠的rpe，但只有sc-aav2-vmd2有效地驱动了rap1a的表达。
[0144]
由sc-aav2-vmd2递送的rpe中活性rap1a的表达减少了野生型小鼠中的cnv。通过sc-aav2-rpe65在rpe中表达活性rap1a减少了rap1缺陷型小鼠中激光诱导的cnv，但在野生型小鼠中没有减少。确定与视网膜下注射sc-aav2-rpe65的小鼠相比，通过sc-aav2-vmd2增加rpe中的rap1a是否会减少野生型小鼠中激光诱导的cnv。为了比较每个实验性载体及其相应的对照，我们使用了anova分析，所述分析将每个cnv病变视为一个单独的数据点。与之前的研究结果一致，与sc-aav2-rpe65-gfp相比，sc-aav2-rpe65-carap1a并未减少cnv；然而，通过anova分析，与sc-aav2-vmd2-gfp相比，sc-aav2-vmd2-carap1a显著减少了cnv(p＝0.026)(图4)。为了进一步确认每个cnv病变是否可以被视为一个单独的数据点，使用混合效应线性回归进行统计分析以比较sc-aav2-vmd2-carap1a和sc-aav2-vmd2-gfp。用组内校正系数(icc)测量同一只眼睛内的点之间的相关性的量，icc＝0.16，95％ci(0.02，0.53)，这表明普通的两个样品anova不合适，因为它要求所有观察结果或点都是独立的。通过混合效应线性回归分析，sc-aav2-vmd2-carap1a组的平均值
±
se为619,928
±
124,932，对照sc-aav2-vmd2-gfp的平均值
±
se为952,091
±
124.932；与sc-aav2-vmd2-gfp相比，存在统计学上的显著差异(平均差异，336,162，95％ci：2,454到647,778；p＝0.05)。混合效应线性抑制分析支持sc-aav2-vmd2-carap1a显著减少野生型小鼠中的cnv。
[0145]
rpe中活性rap1a的表达可减少rpe/脉络膜组织中的炎症信号传导和vegf表达。炎症和vegf信号传导都参与amd的发病机制。先前发现激光治疗显著增加rpe/脉络膜组织中的tnfα，并且玻璃体内中和抗体对tnfα的抑制减少了cnv。通过使用tnfα介导的信号传导作为测试实例，确定通过sc-aav2-vmd2-carap1a增加rpe中的活性rap1a是否会减少炎症。通过蛋白质印迹在rpe/脉络膜裂解物中测量活化的b细胞的核因子κ(nf-κb)的磷酸化，所述nf-κb是tnfα的下游效应子。如图5a和b所示，与sc-aav2-vmd2-gfp相比，sc-aav2-vmd2-carap1a显著降低了磷酸化的nf-κb(p-nf-κb)。在相同的组织裂解物中，与sc-aav2-vmd2-carap1a相比，sc-aav2-vmd2-carap1a还显著降低了vegf蛋白(图5c和d)。
[0146]
rpe中活性rap1a的表达可减少rpe/脉络膜组织中的胱天蛋白酶3和lc3a/b。图3和4中的结果提供了证据支持这样的假设，即sc-aav2-vmd2载体有效地驱动rpe中的活性rap1a特异性表达并减少野生型小鼠中的cnv。然后确定sc-aav2-vmd2-carap1a增加rpe中的活性rap1a是否会压倒rpe稳态，因为递送蛋白质可能会压倒细胞维持其活力的能力。在来自经sc-aav2-vmd2处理的眼睛的rpe/脉络膜裂解物中测量胱天蛋白酶3和切割的胱天蛋白酶3(一种凋亡标志物)和lc3a/b(一种自噬调节剂)。如图6所示，与sc-aav2-vmd2-gfp相比，sc-aav2-vmd2-carap1a显著降低rpe/脉络膜组织中的总胱天蛋白酶3(图6a和b)和lc3a/b(图6c和d)。在来自任一组的rpe/脉络膜组织中均未检测到切割的胱天蛋白酶3。总之，图6中示出的数据表明，通过sc-aav2-vmd2在rpe中表达活性rap1a不会导致胱天蛋白酶3的活化和自噬的过度激活。
[0147]
rpe中活性rap1a的表达可在不引起细胞死亡的情况下减少vegf、tnfα诱导的nf-κb活化和lc3a/b。为了进一步评估活性rap1a对vegf表达、炎症信号传导的激活、自噬和细胞死亡的影响，在用表达组成性地活化rap1a的rap1a q63e突变体的腺病毒(ad-63e)或仅表达gfp的对照腺病毒(ad-gfp)转导的经培养的人rpe中进行了一系列实验。通过gfp可视化
监测病毒转导。病毒转导四十八小时后，约80％的rpe呈gfp阳性(图7a)，并且与ad-gfp相比，在用ad-63e转导的rpe中通过蛋白质印迹测量的总rap1蛋白增加(图7b和c)。与ad-gfp相比，在ad-63e转导的rpe中，vegf蛋白(图7d和e)、tnfα诱导的p-nf-κb(图7f)和lc3a/b(图7g和h)显著减少。在ad-gfp或ad-63e转导的rpe细胞中均未检测到切割的胱天蛋白酶3(图7i)。为了进一步确定外源性活性rap1a的表达是否会诱导细胞死亡，病毒转导48小时后在rpe中进行了tunel染色。如图7j和k所示，与ad-gfp相比，ad-63e转导不会增加tunel阳性细胞。总之，图7中示出的数据进一步支持了外源性活性rap1a的表达可减少炎症和vegf，而不增加细胞死亡和自噬。
[0148]
2.讨论
[0149]
amd是一种复杂的多因素疾病，其特征在于不可逆的中心视力损伤。尽管amd的病理生理步骤仍在阐明中，但大量证据支持amd的进展受衰老、遗传和环境因素相互作用影响的概念。这些相互作用触发涉及rpe和脉络膜内皮细胞中炎症、氧化应激、细胞死亡机制和血管生成的信号传导通路，并导致细胞变性和cnv引起的视力丧失。靶向血管内皮生长因子(vegf)的治疗大大改善了新生血管性amd的临床结果；然而，只有不到一半接受新生血管性amd治疗的患者出现视力改善，并且针对萎缩性amd的治疗仍然不足。
[0150]
基因疗法在治疗amd方面已经获得了很多关注，因为它提供了长期治疗的潜力，这将减少与玻璃体内注射抗vegf剂的局部递送相关的重复治疗的次数。基因疗法还提供了通过使用细胞特异性启动子靶向特定细胞的可能性。使用基因疗法方法，先前经报道，通过sc-aav2-rpe65载体在rpe中表达外源性活性rap1a显著减少了rap1b缺陷型小鼠中激光诱导的cnv，但在野生型小鼠中没有减少。在这项研究中，在驱动野生型小鼠rpe中活性rap1a的表达方面测试了rpe的另一种特异性启动子vmd2，并将其效果与sc-aav2-rpe65进行了比较。研究表明，与sc-aav2-rpe65相比，sc-aav2-vmd2载体有效地驱动了野生型小鼠rpe中的活性rap1a表达，并且sc-aav2-vmd2的转导在rpe中具有更高的特异性。sc-aav2-rpe65启动子并未增加野生型小鼠rpe中的活性rap1a。与用对照载体sc-aav2-vmd2-gfp处理的小鼠相比，rpe中活性rap1a增加的经sc-aav2-vmd2-carap1a处理的小鼠的cnv显著减少。这项研究的结果支持这样的假设，即vmd2在驱动rpe中的活性rap1a表达方面具有更强的活性，并且增加的活性rap1a能够减少野生型小鼠中的cnv。
[0151]
涉及炎症、氧化信号传导和血管生成的串扰和反馈回路与amd的发病机制有关。之前使用炎性细胞因子tnfα作为与amd和cnv相关的细胞因子的实例测试了炎症在实验性cnv中的作用。我们报道了，玻璃体内tnfα通过涉及在rpe中产生活性氧触发的vegf的机制促成了实验性cnv。此外，rpe中rap1a的活化减少了活性氧的产生。在这里，研究表明，与对照sc-aav2-vmd2-gfp相比，经sc-aav2-vmd2-carap1a处理的眼睛在rpe/脉络膜组织中的vegf和nf-κb磷酸化显著减少。使用经培养的人rpe进一步支持了这些发现，其中通过腺病毒转导增加的活性rap1a显著减少了vegf和p-nf-κb。然而，在经sc-aav2-rpe65-carap1a处理的眼睛中没有观察到类似的效果。这些结果支持这样的假设，即rpe中增加的活性rap1a通过减少vegf来减少cnv。炎症信号传导的减少可以减少促成cnv的刺激，正如之前使用tnfα作为炎性细胞因子所发现的那样，但也可以通过干扰导致细胞死亡的过程来减少萎缩性amd。
[0152]
引入一种具有保护作用的蛋白质的一个问题是有可能压倒细胞管理蛋白质的天然能力。自噬是细胞应对应激以维持细胞稳态的机制之一。通过自噬，错误折叠或聚集的蛋
白质和受损的细胞器可以被降解，这些蛋白质和细胞器是响应不堪重负的细胞应激而形成的。因此，增加的自噬可以间接反映细胞应激的增加。为了确定通过基因疗法引入活性rap1a是否会导致细胞应激通过细胞凋亡或自噬的过度激活引发细胞死亡，在通过sc-aav2-vmd2诱导rpe中外源性活性rap1a的表达后，将切割的胱天蛋白酶-3的表达评估为细胞凋亡的标志物并将lc3a/b的表达评估为自噬的标志物。在激光诱导的cnv模型中进行测试时，与sc-aav2-vmd2-gfp相比，sc-aav2-vmd2-carap1a在野生型小鼠的rpe/脉络膜组织中并未增加切割的胱天蛋白酶-3，但减少了胱天蛋白酶3和lc3a/b。体外人rpe细胞中活性rap1a的增加减少了lc3a/b，但不增加胱天蛋白酶3的活化和通过tunel染色确定的细胞死亡。
[0153]
总之，与rpe65启动子相比，vmd2启动子更特异性地靶向rpe并且增加了rap1表达。通过vmd2启动子增加rpe中的活性rap1a减少了与晚期amd相关的三种效应子：vegf、活化的nf-κb和lc3a/b。rap1a的活化可以防止导致炎症和血管生成的amd相关刺激，并维持rpe的完整性和功能。sc-aav2-vmd2载体可以是将遗传材料递送至rpe的一种有效且安全的工具。
[0154]
3.材料与方法
[0155]
动物。五周龄的野生型c57bl/6j(雄性和雌性)小鼠购自杰克逊实验室(jackson laboratory)(缅因州巴尔港(bar harbor,me))。所有动物程序均按照犹他大学指南(实验动物护理和使用指南)和视觉和眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明进行。所有实验方案均经过iacuc和犹他大学机构生物安全委员会批准。使用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(20mg/kg)进行麻醉，并在麻醉下进行安乐死，然后进行颈椎脱位。
[0156]
rpe65或vmd2启动子驱动的自身互补型腺相关病毒2的构建。由鼠rpe65启动子驱动的自身互补型腺相关病毒2(sc-aav2)载体由北卡罗来纳大学载体核心(北卡罗来纳州教堂山(chapel hill,nc))产生，如前所述。简而言之，将sc-aav2载体中的cmv启动子替换为鼠rpe65启动子(1507bp)(由t.michael redmond友情提供)，并将组成型活性人rap1a q63e突变体(carap1a)的合成序列克隆到带有rpe65启动子的scaav2载体中(scaav2-rpe65-carap1a-gfp)。没有carap1a序列的sc-aav2构建体用作对照载体(scaav2-rpe65-gfp)。为了比较rpe65和vmd2启动子的转导效率和特异性，由鼠vmd2启动子(624bp)驱动的sc-aav2载体由佛罗里达大学鲍威尔基因疗法中心(佛罗里达州盖恩斯维尔(gainesville,fl)产生。将carap1a的序列克隆到sc-aav2-vmd2中作为sc-aav2-vmd2-carap1a-gfp，并使用sc-aav2-vmd2-gfp载体作为对照。在fl powell基因疗法中心生产、纯化和滴定病毒。
[0157]
视网膜下注射、micron iv成像和激光诱导的cnv模型。将一微升sc-aav2(在荧光素和pbs中稀释至5x108个病毒颗粒)注射到6周龄小鼠的每只眼睛的视网膜下空间中。如前所述，使用micron iv视网膜成像系统(加利福尼亚州普莱森顿市的菲尼克斯研究实验室公司(phoenix research laboratories,inc.,pleasanton,ca))通过体内实时成像监测sc-aav2病毒转导。
[0158]
在sc-aav2病毒注射五周后，使11周龄的小鼠接受激光以诱导cnv。用一滴1％托吡卡胺滴眼液扩张每只小鼠的双眼。扩张后，使用菲尼克斯图像引导激光系统94(加利福尼亚州普莱森顿市的phoenix micron iv)在约460mw强度和100毫秒持续时间的设置下，对小鼠进行麻醉并用4个532nm激光光凝点处理，每个点距视神经约2个视盘直径。通过产生证实布鲁赫膜破裂的空化气泡来评估治疗是否充分。7激光治疗后七天，对小鼠实施安乐死，并收
100，在0.1％柠檬酸钠溶液中)在冰上温育2分钟。透化后，将一些细胞与dnase i(3000u/ml，溶于50mm tris-hcl中，ph 7.5，1mg/ml bsa)一起在15
–
25℃下温育10分钟作为阳性对照。仅用不含酶溶液的标记溶液温育的细胞用作阴性对照。为了鉴定tunel 细胞，将细胞与tunel反应混合物(10:1的标记溶液和酶溶液混合物)在37℃的加湿培养箱中避光温育60分钟。在pbs中洗涤两次后，用dapi fluoromount g安装盖玻片。使用荧光显微镜拍摄图像，每个盖玻片有五个随机图像。对通过与dapi染色细胞核共标记确定的tunel 细胞进行量化，并使用来自同一盖玻片的五个图像中的tunel 细胞的平均值进行比较。每个条件有5-6个盖玻片。
[0163]
蛋白质制备和蛋白质印迹。如前所述，从rpe/脉络膜组织中提取蛋白质裂解物。7简而言之，将rpe/脉络膜组织在放射免疫沉淀测定缓冲液(ripa)(20mm tris ph 7.4、120mm nacl、0.5％脱氧胆酸钠、1％triton x-100、0.1％sds、10％甘油)中与蛋白酶抑制剂混合物(印第安纳州印第安纳波利斯市的罗氏诊断公司)和磷酸酶抑制剂原钒酸盐(2mm，密苏里州圣路易斯市的西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich,st.louis,mo))一起在冰上均质化20分钟。通过在4℃下以13,000rpm离心5分钟来收集蛋白质裂解物。通过二辛可宁酸测定法(bca)(伊利诺伊州罗克福德市的皮尔斯公司(pierce,rockford,il))量化上清液中的蛋白质浓度。将20μg来自rpe/脉络膜组织的蛋白质装入4％到12％nupage bis-tris凝胶(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)中并转移至pvdf膜(英杰)，然后与rap1抗体(1:1000，加利福尼亚州圣何塞市的bd生物科学公司(bd biosciences,san jose,ca))、vegf(1:500，加利福尼亚州圣克鲁斯市的圣克鲁斯生物技术公司(santa cruz biotechnology,santa cruz,ca))、胱天蛋白酶3、lc3a/b或磷酸化nf-kb(1:1000，马萨诸塞州丹弗斯市的细胞信号传导技术公司(cell signaling technology inc.,danvers,ma))一起在4℃下温育过夜。用hrp缀合的β-肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术公司)作为上样对照重新探测膜。
[0164]
使用软件un-scan-it版本7.1(犹他州奥勒姆市的silk科技公司(silk scientific,orem,ut))分析密度测定。
[0165]
统计分析。方差分析(anova)用于分析蛋白质表达和tunel阳性细胞以比较实验组和对照组，每只动物观察一次或每次处理一个孔的细胞。普通anova要求所有数据点或观察结果都是独立的，如果每只动物只使用一个观察结果，就会是这种情况。当每只动物使用多个观察结果时，通常会违反假设，因为同一动物内部的观察结果往往比动物之间的更相似。组内相关系数(icc)可用于确定观察结果的相关程度。如果icc等于零，则普通anova提供了正确的分析。然而，如果icc》0，则需要使用混合效应线性回归等方法。这种方法基本上是一种anova，其中对标准误差进行了调整，以解决观察结果缺乏独立性的问题。对于cnv病变结果，我们使用混合效应线性回归来解释由于点聚集或嵌套、用同一只眼睛、每只动物一只眼睛而产生的独立性缺乏。
[0166]
结果显示为平均值
±
sem。p值≤0.05被认为具有统计学意义。对于动物研究，分析了来自12只小鼠的至少40个点的cnv体积。用于gfp染色和rap1蛋白的蛋白质印迹的视网膜切片取自3-6只不同的小鼠。
[0167]
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过例行实验确定本文所述方法和组合物的具体实施例的许多等价物。这些等价物旨在由下述权利要求涵盖。
[0168]
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