一种HPLC-MS联用检测干血斑中25-羟基维生素D的方法与流程

一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法
技术领域
1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地，本发明涉及一种hplc-ms联用检测干血斑中25-羟基维生素d的方法。


背景技术：

2.维生素d是一类脂溶性固醇类衍生物，参与维持人体钙磷浓度稳定，能与钙一起促进儿童骨骼的发育，并能维持成人骨骼的强度。缺乏维生素d会导致一系列疾病，包括儿童佝偻病、骨质疏松症、成人软骨病等，也有研究显示，维生素d缺乏还与肿瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病等慢性疾病相关。
3.维生素d主要包括维生素d2和d3两种形式，大部分人的体内维生素d来源于阳光照射下合成的维生素d3和来源于食物的维生素d2。两者在肝脏中代谢形成25-羟基维生素d，在肾脏中进一步合成1，25-羟基维生素d。在血液中，25-羟基维生素d是维生素d最主要的存在形式，性质稳定，是国际公认的衡量维生素d水平的最佳标准。
4.维生素d参与体内钙磷调节，对维持身体健康起重要作用，通过检测体内维生素d的真实含量，了解人体内维生素d的状态，对于是否需要补充或者辅助诊断其他疾病具有重要参考价值。
5.然而，现有技术中检测维生素d检测方法存在易受到基质干扰、不能区分同分异构体、结果差异大、灵敏度不够高、通量小等缺点，从而限制维生素的准确测定和对人体内维生素d营养状况的准确健康评估。
6.因此，本领域需要开发一种准确、快速、高精度的测定维生素d的方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种准确、快速、高精度的测定维生素d的方法。
8.本发明第一方面，提供一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素d的方法，所述的方法包括步骤：
9.将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25-羟基维生素d；
10.所述的高效液相色谱条件包括；
11.色谱柱：反相色谱柱；
12.流动相：流动相a 流动相b；流动相a为0.1-10mm甲酸铵水溶液，流动相b为0.1-10mm甲酸铵甲醇溶液；
13.流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
14.15.其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(15-25)：(85-75)匀速渐变至(5-15)：(95-85)；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(5-15)：(95-85)匀速渐变至(15-25)：(85-75)；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为(15-25)：(85-75)。
16.在另一优选例中，所述的反向色谱柱的填料为c4-c18烷基硅烷键合硅胶，较佳地c12-c18烷基硅烷键合硅胶。
17.在另一优选例中，所述的反向色谱柱为c4-c18烷基硅烷键合硅胶柱，较佳地c12-c18烷基硅烷键合硅胶。
18.在另一优选例中，所述的c4-c18烷基硅烷键合硅胶选自下组：c4烷基硅烷键合硅胶、c6烷基硅烷键合硅胶、c8烷基硅烷键合硅胶、c12烷基硅烷键合硅胶、c16烷基硅烷键合硅胶、c18烷基硅烷键合硅胶，或其组合。
19.在另一优选例中，所述的反相色谱柱为c4烷基硅烷键合硅胶色谱柱、c6烷基硅烷键合硅胶色谱柱、c8烷基硅烷键合硅胶色谱柱、c12烷基硅烷键合硅胶色谱柱色谱柱、c16烷基硅烷键合硅胶色谱柱、c18烷基硅烷键合硅胶色谱柱，或其组合。
20.在另一优选例中，所述的色谱柱为xbridge beh c18。
21.在另一优选例中，流动相a为0.5-10mm甲酸铵水溶液，较佳地0.5-5mm甲酸铵水溶液，更佳地1-3mm甲酸铵水溶液；和/或
22.流动相b为0.5-10mm甲酸铵甲醇溶液，较佳地0.5-5mm甲酸铵甲醇溶液，更佳地1-3mm甲酸铵甲醇溶液。
23.在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
[0024][0025]
其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(18-22)：(82-78)匀速渐变至(8-12)：(92-88)；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(8-12)：(92-88)匀速渐变至(18-22)：(82-78)；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为(18-22)：(82-78)。
[0026]
在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
[0027][0028]
其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积
百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为20:80。
[0029]
在另一优选例中，所述的方法为定量、定性和/或杂质检测方法。
[0030]
在另一优选例中，所述的方法为体外和/或辅助性方法。
[0031]
在另一优选例中，所述的方法为非诊断性方法。
[0032]
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
[0033]
流动相流速：0.1-1.2ml/min，较佳地0.2-1.0ml/min，更佳地0.2-0.8ml/min，更佳地0.3-0.6ml/min；
[0034]
柱温：35-45℃，较佳地40℃；
[0035]
进样体积：5～40μl，更佳地5-20μl；
[0036]
运行时间：1-3min，更佳地2-3min，更佳地2-2.5min；和/或
[0037]
所述色谱柱的规格为(2.1
×
50mm，2.5μm)。
[0038]
在另一优选例中，所述的样品为血样。
[0039]
在另一优选例中，所述的血样为全血、血清、血浆或干血斑。
[0040]
在另一优选例中，所述的血样为人或非人哺乳动物(如猪、狗、猫、羊或牛)血样。
[0041]
在另一优选例中，所述的样品为全血、血清、血浆或干血斑。
[0042]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d选自下组：25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3，或其组合。
[0043]
在另一优选例中，依次通过高效液相色谱和质谱联用检测样品中的25-羟基维生素d。
[0044]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d依次经过hplc和ms后进行检测。
[0045]
在另一优选例中，所述的方法包括：
[0046]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d的荷质比，测定得到25-羟基维生素d的含量；或
[0047]
所述的方法包括：
[0048]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素d的含量。
[0049]
在另一优选例中，所述的方法包括：
[0050]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d的荷质比，测定得到25-羟基维生素d的含量。
[0051]
在另一优选例中，所述的方法包括：
[0052]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素d的含量。
[0053]
在另一优选例中，所述的内标包括同位素内标。
[0054]
在另一优选例中，所述的同位素内标选自下组：25-羟基维生素d2-2h3、25-羟基维生素d3-2h3，或其组合。
[0055]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d2的同位素内标为25-羟基维生素d2-2h3。
[0056]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d3的同位素内标为25-羟基维生素d3-2h3。
[0057]
在另一优选例中，通过标准曲线法或内标对比法测定样品中25-羟基维生素d的含量。
[0058]
在另一优选例中，所述的干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径》10mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0059]
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0060]
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0061]
在另一优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去。将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存。
[0062]
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
[0063]
向干血斑加入提取剂进行提取后，加入萃取液萃取，离心取上清液，吹干，加入衍生化试剂衍生后，加入终止反应试剂，吹干，复溶剂复溶。
[0064]
在另一优选例中，所述提取剂包括含内标甲醇溶液。
[0065]
在另一优选例中，所述萃取液包括正己烷。
[0066]
在另一优选例中，所述衍生化试剂包括4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(ptad)。
[0067]
在另一优选例中，所述终止反应试剂包括乙醇。
[0068]
在另一优选例中，所述复溶剂包括甲醇水溶液。
[0069]
在另一优选例中，所述复溶剂包括30-80％甲醇水溶液。
[0070]
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
[0071]
用打孔器取干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入含内标混合液的提取剂，超声提取，样本中加入萃取液，涡旋离心后取上清液，氮气吹干，加入衍生化试剂，室温条件下衍生，加入终止反应试剂，氮气吹干，复溶剂复溶。
[0072]
在另一优选例中，所述经过预处理的干血斑按照如下方法制备：用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入200μl含内标甲醇溶液，超声30min提取，样本中加入1ml正己烷，涡旋5min后，在14000～15000r/min，4～20℃离心5～10min后取上清液，氮气吹干，加入50μl衍生化试剂ptad，室温条件下衍生1小时，加入100μl乙醇终止反
应，氮气吹干，50％甲醇复溶。
[0073]
在另一优选例中，所述含内标甲醇溶液按照如下方法制备：
[0074]
称取各同位素内标物25-羟基维生素d2-2h3和25-羟基维生素d3-2h3，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/ml、0.1mg/ml的同位素内标母液；
[0075]
上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含2μg/ml 25-羟基维生素d2-2h3和2μg/ml 25-羟基维生素d3-2h3有同位素内标is溶液；
[0076]
取200μl同位素内标is溶液，加入甲醇6ml，混合均匀即得含内标甲醇溶液。
[0077]
在另一优选例中，所述衍生化试剂ptad如下方法制备：
[0078]
称取ptad2mg至容量瓶中，加入5ml乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10ml，即得衍生化试剂ptad。
[0079]
在另一优选例中，所述标准品按照如下方法制备：
[0080]
称取各待测物标准品，包括25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3；
[0081]
上述各标准品母液再以用甲醇溶液配制成包含有2μg/ml25-羟基维生素d2和4μg/ml25-羟基维生素d3混合标准ws07溶液；
[0082]
将上述混合标液ws07溶液以空白替代基质配制成七个不同浓度点的校准品干血斑，所述校准品干血斑的7个浓度点为：
[0083]
25-羟基维生素d2的浓度依次为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml；
[0084]
25-羟基维生素d3的浓度依次为4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。
[0085]
在另一优选例中，空白替代基质干血斑为牛全血。
[0086]
在另一优选例中，在所述的方法中，通过内标法测定样品中的25-羟基维生素d的含量。
[0087]
在另一优选例中，在所述的方法中，先建立25-羟基维生素d(优选为标准品)峰面积与内标峰面积的比值和25-羟基维生素d的浓度的标准曲线，再通过内标法测定样品中的25-羟基维生素d的含量。
[0088]
在另一优选例中，25-羟基维生素d(优选为标准品)峰面积与内标峰信号的比值为纵坐标，25-羟基维生素d的浓度为横坐标。
[0089]
在另一优选例中，对于25-羟基维生素d2，标准曲线的线性范围为2-200ng/ml。
[0090]
在另一优选例中，对于25-羟基维生素d3，标准曲线的线性范围为4-200ng/ml。
[0091]
在另一优选例中，所述的质谱的条件为：
[0092]
在电喷雾电离(esi)模式下，采用多反应监测(mrm)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kv(esi )；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900l/h，锥孔气流速为200l/h。
[0093]
在另一优选例中，所述的质谱同时检测25-羟基维生素d和任选地25-羟基维生素d相对应的内标。
[0094]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d和任选地25-羟基维生素d相对应内标的质谱采集参数如下所示：
[0095][0096]
其中：25-ohvd2为25-羟基维生素d2；
[0097]
25-ohvd3为25-羟基维生素d3；
[0098]
25-ohvd2-is为25-ohvd2的同位素内标25-羟基维生素d2-2h3；
[0099]
25-ohvd3-is为25-ohvd3的同位素内标25-羟基维生素d3-2h3。
[0100]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选地技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0101]
图1为干血斑样本中的25-羟基维生素d2的hplc色谱图，其中保留时间1.40min为25-羟基维生素d2峰。
[0102]
图2为干血斑样本中的25-羟基维生素d3的hplc色谱图，其中保留时间1.34min为25-羟基维生素d3峰。
具体实施方式
[0103]
本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种通过hplc-ms联用检测干血斑25羟基维生素d的方法。在本发明所述的方法中，可采用干血斑样品，不受地域和时间限制，样本便于储存，且本发明所述的方法具有检测灵敏度和精密度高、重复性和稳定性好、特异性强、能区分其它体内物质产生的干扰和降低了假阳性率和假阴性率、样本用量低、且样品如干血斑经简单预处理即可进样检测、分析时间短和速度快、分析成本低，可用于快速大批量化和大通量检测。基于以上发现，发明人完成了本发明。
[0104]
术语
[0105]
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0106]
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
[0107]
如本文所用，术语“25-ohvd”是指25-羟基维生素d。
[0108]
如本文所用，术语“25-ohvd2”是指25-羟基维生素d2。
[0109]
如本文所用，术语“25-ohvd3”是指25-羟基维生素d3。
[0110]
如本文所用，术语“ptad”是指4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮。
[0111]
如本文所用，术语“高效液相色谱”简称hplc。
[0112]
如本文所用，术语“质谱”简称ms。
[0113]
方法
[0114]
本发明提供一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素d的方法，所述的方法包括步骤：
[0115]
将样品通过高效液相色谱与质谱联用检测25-羟基维生素d；
[0116]
所述的高效液相色谱条件包括；
[0117]
色谱柱：反相色谱柱；
[0118]
流动相：流动相a 流动相b；流动相a为0.1-10mm甲酸铵水溶液，流动相b为0.1-10mm甲酸铵甲醇溶液；
[0119]
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：
[0120][0121]
其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(15-25)：(85-75)匀速渐变至(5-15)：(95-85)；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(5-15)：(95-85)匀速渐变至(15-25)：(85-75)；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为(15-25)：(85-75)。
[0122]
本发明所述的方法可以为定量、定性、杂质检测方法。优选地，所述的方法为体外和/或辅助性方法。优选地，所述的方法为非诊断性方法。
[0123]
在本发明所述的方法中，所述的反向色谱柱的填料优选为为c4-c18烷基硅烷键合硅胶，较佳地c12-c18烷基硅烷键合硅胶。
[0124]
代表性地，所述的c4-c18烷基硅烷键合硅胶包括(但不限于)：c4烷基硅烷键合硅胶、c6烷基硅烷键合硅胶、c8烷基硅烷键合硅胶、c12烷基硅烷键合硅胶、c16烷基硅烷键合硅胶、c18烷基硅烷键合硅胶，或其组合。
[0125]
典型地，所述的色谱柱为xbridge beh c18。
[0126]
在本发明的一个优选例中，流动相a为0.5-10mm甲酸铵水溶液，较佳地0.5-5mm甲酸铵水溶液，更佳地1-3mm甲酸铵水溶液。
[0127]
在本发明的一个优选例中，流动相b为0.5-10mm甲酸铵甲醇溶液，较佳地0.5-5mm甲酸铵甲醇溶液，更佳地1-3mm甲酸铵甲醇溶液。
[0128]
如本文所用，当甲酸铵水溶液含有浓度(如mm)限定时，指的是甲酸铵的浓度，例如在0.5-10mm甲酸铵水溶液中，甲酸铵的浓度为0.5-10mm。
[0129]
如本文所用，当甲酸铵甲醇溶液含有浓度(如mm)限定时，指的是甲酸铵的浓度，例如在0.5-10mm甲酸铵甲醇溶液中，甲酸铵的浓度为0.5-10mm。
[0130]
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的ph。本发明在流动相a添加了甲酸铵，可以提高某些目标化合物的离子化效率的同时，使不同化合物的分离效果更好，较现
有技术中采用lc-ms/ms方法相比，所检测25羟基维生素d的灵敏度高，样品前处理方法简易，无需蛋白沉淀处理，萃取吹干衍生化，样本用量小，分析时间短，2分钟检测完成。
[0131]
在本发明的一个优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
[0132][0133]
其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(18-22)：(82-78)匀速渐变至(8-12)：(92-88)；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由(8-12)：(92-88)匀速渐变至(18-22)：(82-78)；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为(18-22)：(82-78)。
[0134]
代表性地，所述的梯度洗脱的顺序为：
[0135][0136]
其中，％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为20:80。
[0137]
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
[0138]
流动相流速：0.1-1.2ml/min，较佳地0.2-1.0ml/min，更佳地0.2-0.8ml/min，更佳地0.3-0.6ml/min；
[0139]
柱温：35-45℃，较佳地40℃；
[0140]
进样体积：5～40μl，更佳地5-20μl；
[0141]
运行时间：1-3min，更佳地2-3min，更佳地2-2.5min；和/或
[0142]
所述色谱柱的规格为(2.1
×
50mm，2.5μm)。
[0143]
在本发明所述的方法中，样品并没有特别的限定，优选所述的样品为血样。
[0144]
代表性地，所述的血样为全血、血清、血浆或干血斑。
[0145]
代表性地，所述的血样为人或非人哺乳动物(如猪、狗、猫、羊或牛)血样。
[0146]
在另一优选例中，所述的样品为全血、血清、血浆或干血斑。
[0147]
在本发明的一个优选例中，所述的25-羟基维生素d包括(但不限于)：25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3，或其组合。
[0148]
在本发明的一个优选例中，依次通过高效液相色谱和质谱联用检测样品中的25-羟基维生素d。
[0149]
优选地，所述的25-羟基维生素d依次经过hplc和ms后进行检测。
[0150]
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
[0151]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d的荷质比，测定得到25-羟基维生素d的含量。
[0152]
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
[0153]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与样品(如血样)中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素d的含量。
[0154]
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
[0155]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d的荷质比，测定得到25-羟基维生素d的含量。
[0156]
在本发明的一个优选例中，所述的方法包括：
[0157]
先利用高效液相色谱将25-羟基维生素d与干血斑中的干扰组分进行分离，再利用质谱检测25-羟基维生素d与其对应内标的荷质比，根据内标法定量分析，得到25-羟基维生素d的含量。
[0158]
在本发明的一个优选例中，所述的内标包括同位素内标。优选地，所述的内标为同位素内标。
[0159]
代表性地，所述的同位素内标包括(但不限于)：25-羟基维生素d2-2h3、25-羟基维生素d3-2h3，或其组合。
[0160]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d2的同位素内标为25-羟基维生素d2-2h3。
[0161]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d3的同位素内标为25-羟基维生素d3-2h3。
[0162]
在另一优选例中，通过标准曲线法或内标对比法测定样品中25-羟基维生素d的含量。
[0163]
在本发明的一个优选例中，所述的干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径》10mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0164]
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥4-12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0165]
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于4～-20℃条件下保存。
[0166]
在本发明的一个优选例中，所述干血斑按照如下方法制备：所述干血斑按照如下方法制备：玻璃毛细管点样法收集指尖末梢血于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内，(血
斑直径12mm)，第一滴血应用棉球拭去。将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存。
[0167]
在本发明的一个优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
[0168]
向干血斑加入提取剂进行提取后，加入萃取液萃取，离心取上清液，吹干，加入衍生化试剂衍生后，加入终止反应试剂，吹干，复溶剂复溶。
[0169]
在另一优选例中，所述提取剂包括含内标甲醇溶液。
[0170]
在另一优选例中，所述萃取液包括正己烷。
[0171]
在另一优选例中，所述衍生化试剂包括4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(ptad)。
[0172]
在另一优选例中，所述终止反应试剂包括乙醇。
[0173]
在另一优选例中，所述复溶剂包括甲醇水溶液。
[0174]
在另一优选例中，所述复溶剂包括30-80％甲醇水溶液。
[0175]
在另一优选例中，所述的干血斑经过处理后进样，所述的处理包括步骤：
[0176]
用打孔器取干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入含内标混合液的提取剂，超声提取，样本中加入萃取液，涡旋离心后取上清液，氮气吹干，加入衍生化试剂，室温条件下衍生，加入终止反应试剂，氮气吹干，复溶剂复溶。
[0177]
在另一优选例中，所述经过预处理的干血斑按照如下方法制备：用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔样品板，向干血斑加入200μl含内标甲醇溶液，超声30min提取，样本中加入1ml正己烷，涡旋5min后，在14000～15000r/min，4～20℃离心5～10min后取上清液，氮气吹干，加入50μl衍生化试剂ptad，室温条件下衍生1小时，加入100μl乙醇终止反应，氮气吹干，50％甲醇复溶。
[0178]
在另一优选例中，所述含内标甲醇溶液按照如下方法制备：
[0179]
称取各同位素内标物25-羟基维生素d2-2h3和25-羟基维生素d3-2h3，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/ml、0.1mg/ml的同位素内标母液；
[0180]
上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含2μg/ml 25-羟基维生素d2-2h3和2μg/ml 25-羟基维生素d3-2h3有同位素内标is溶液；
[0181]
取200μl同位素内标is溶液，加入甲醇6ml，混合均匀即得含内标甲醇溶液。
[0182]
在另一优选例中，所述衍生化试剂ptad如下方法制备：
[0183]
称取ptad2mg至容量瓶中，加入5ml乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10ml，即得衍生化试剂ptad。
[0184]
在另一优选例中，所述标准品按照如下方法制备：
[0185]
称取各待测物标准品，包括25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3；
[0186]
上述各标准品母液再以用甲醇溶液配制成包含有2μg/ml25-羟基维生素d2和4μg/ml25-羟基维生素d3混合标准ws07溶液；
[0187]
将上述混合标液ws07溶液以空白替代基质配制成七个不同浓度点的校准品干血斑，所述校准品干血斑的7个浓度点为：
[0188]
25-羟基维生素d2的浓度依次为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml；
[0189]
25-羟基维生素d3的浓度依次为4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。
[0190]
在另一优选例中，空白替代基质干血斑为牛全血。
[0191]
在本发明的一个优选例中，在所述的方法中，通过内标法测定样品中的25-羟基维生素d的含量。
[0192]
在另一优选例中，在所述的方法中，先建立25-羟基维生素d(优选为标准品)峰面积与内标峰面积的比值和25-羟基维生素d的浓度的标准曲线，再通过内标法测定样品中的25-羟基维生素d的含量。
[0193]
在另一优选例中，25-羟基维生素d(优选为标准品)峰面积与内标峰信号的比值为纵坐标，25-羟基维生素d的浓度为横坐标。
[0194]
在另一优选例中，对于25-羟基维生素d2，标准曲线的线性范围为2-200ng/ml。
[0195]
在另一优选例中，对于25-羟基维生素d3，标准曲线的线性范围为4-200ng/ml。
[0196]
在本发明的一个优选例中，所述的质谱的条件为：
[0197]
在电喷雾电离(esi)模式下，采用多反应监测(mrm)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kv(esi )；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900l/h，锥孔气流速为200l/h。
[0198]
在另一优选例中，所述的质谱同时检测25-羟基维生素d和任选地25-羟基维生素d相对应的内标。
[0199]
在另一优选例中，所述的25-羟基维生素d和任选地25-羟基维生素d相对应内标的质谱采集参数如下所示：
[0200][0201][0202]
其中：25-ohvd2为25-羟基维生素d2；
[0203]
25-ohvd3为25-羟基维生素d3；
[0204]
25-ohvd2-is为25-ohvd2的同位素内标25-羟基维生素d2-2h3；
[0205]
25-ohvd3-is为25-ohvd3的同位素内标25-羟基维生素d3-2h3。
[0206]
本发明的主要优点包括：
[0207]
1.本发明提供一种通过hplc-ms联用检测干血斑25羟基维生素d的方法，采用干血斑采样方法，不受地域和时间限制，样本便于储存，且拥有很好的生物安全性。
[0208]
2.本发明所述的hplc-ms联用检测25羟基维生素d的方法具有检测灵敏度和精密度高、重复性和稳定性好、特异性强、能区分其它体内物质产生的干扰和降低了假阳性率和假阴性率、样本用量低、且样品如干血斑经简单预处理即可进样检测、分析时间短和速度快、分析成本低，可用于快速大批量化和大通量检测。
[0209]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0210]
实施例
[0211]
实施例1
[0212]
1.实验材料与仪器
[0213]
1.1材料
[0214]
样本：人全血样本。
[0215]
(1)仪器：xevo tq-d三重四级杆质谱仪(waters corporation)；hplc i-class高效液相色谱系统(配自动进样器，waters corporation)；h1850r高速台式离心机(湖南湘仪)；多管涡旋混合仪(mtv-100，杭州奥盛)；氮吹浓缩仪(arica v96，上海析维)；可调移液器(eppendorf 0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl)；玻璃仪器、量筒等。
[0216]
(2)试剂耗材：hplc级甲醇(fisher，美国)；蒸馏水(屈臣氏，中国)；hplc级乙腈(默克，美国)；ptad(麦克林，中国)；正己烷(国药，中国)；色谱柱：xbridge beh c18，2.1
×
50mm，2.5μm((waters)。
[0217]
(3)标准品：25-羟基维生素d2、25-羟基维生素d3及对应的同位素内标25-羟基维生素d2-2h3和25-羟基维生素d3-2h3购自甄准生物公司。
[0218]
(4)质控品：含有25-羟基维生素d的空白干血斑，分别为qc(lloq)、qc(lqc)、qc(mqc)、qc(hqc)。
[0219]
2.液质方法
[0220]
2.1高效液相色谱方法：
[0221]
流动相：流动相a 流动相b；流动相a为2mm甲酸铵水溶液，流动相b为2mm甲酸铵甲醇溶液；
[0222]
梯度洗脱：流动相梯度洗脱见表1；
[0223]
色谱柱：c18烷基硅烷键合硅胶柱(xbridge beh c18，2.1
×
50mm，2.5μm(waters))
[0224]
流速：0.45ml/min；
[0225]
柱温：40℃；
[0226]
进样体积：10μl；
[0227]
表1：高效液相色谱梯度洗脱条件
[0228][0229]
备注：％a是指流动相a占流动相的体积百分比，％b是指流动相b占流动相的体积百分比；所述洗脱梯度过程为：在0-1.5分钟内，流动相a和流动相b的体积比由20:80匀速渐变至10:90；在1.5-1.6分钟内，流动相a和流动相b的体积比由10:90匀速渐变至20:80；在1.6-2.0分钟内，流动相a和流动相b的体积比为20:80。
[0230]
2.2质谱方法：
[0231]
在电喷雾电离(esi)模式下，采用多反应监测(mrm)进行正离子模式扫描；喷雾电压为1.5kv(esi )；离子源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为900l/h，锥孔气
流速为200l/h；同时监测25-羟基维生素d及其相对应同位素内标化合物，各目标待测物的质谱采集参数见表2。
[0232]
表2：质谱参数
[0233][0234]
其中：25-ohvd2-1为25-羟基维生素d2；
[0235]
25-ohvd3-1为25-羟基维生素d3；
[0236]
25-ohvd2-is为25-ohvd2的同位素内标25-羟基维生素d2-2h3；
[0237]
25-ohvd3-is为25-ohvd3的同位素内标25-羟基维生素d3-2h3；
[0238]
3.实施操作
[0239]
步骤101：标准品配制：各称取1～2mg 25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3标准品至容量瓶，分别加入纯甲醇至完全溶解，分别制成浓度为100μg/ml和100μg/ml的标准品母液；再将各标准品母液用纯甲醇配制成混合标准ws07溶液(详见表3)，混合均匀备用。
[0240]
表3混合标准液ws07的配制
[0241][0242]
步骤102：以ws07作为第一个高浓度点，再用甲醇逐级稀释至ws01(详见表4)，各标曲点的浓度如表4中所列。
[0243]
表4：标曲的配制及浓度
[0244][0245]
步骤103：将上述混合标液标曲溶液以空白替代基质配制成7个不同浓度点的校准品样品,将校准品样品用玻璃毛细管点样法收集于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内(血斑直径＝12mm)，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存，制备成干血斑样品，各校准品浓度如表5所示。
[0246]
表5校准曲线的配制及浓度
[0247][0248]
步骤104：qc的制备：各称取1～2mg 25-羟基维生素d2和25-羟基维生素d3标准品至容量瓶，分别加入纯甲醇至完全溶解，100μg/ml和100μg/ml的标准品母液；再将各标准品母液用纯甲醇配制成混合标准ws07溶液(详见表6)，混合均匀备用。
[0249]
表6混合标准液ws07的配制
[0250][0251]
步骤107：用纯甲醇按照表7，将ws07稀释配制成qc(lloq)、qc(lqc)、qc(mqc)、qc(hqc)。
[0252]
表7 qc溶液的配制及浓度
[0253][0254]
步骤108；将上述混合标液qc溶液以空白替代基质配制成4个不同浓度点的qc样品,将qc样品用玻璃毛细管点样法收集于whatman 903号滤纸片的采样圆圈内(血斑直径＝12mm)，将采好样的滤纸片置于洁净、阴凉、避光条件下干燥12小时，密封于含有干燥剂的洁净塑料袋中，于-20℃条件下保存，制备成干血斑样品，各分析物的qc浓度如表8所示。
[0255]
表8 qc样品的配制及浓度
[0256]
[0257]
步骤109：混合内标溶液按照如下方法制备：称取1～2mg各同位素内标物25-羟基维生素d2-2h3和25-羟基维生素d3-2h3于10ml棕色容量瓶中，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成浓度依次为0.1mg/ml和0.1mg/ml的同位素内标母液。上述各同位素内标母液再以纯甲醇溶液配制成包含有2μg/ml25-羟基维生素d2-2h3和2μg/ml 25-羟基维生素d3-2h3同位素内标is溶液；
[0258]
步骤110：含内标甲醇溶液的配制，取上述200μl同位素内标is溶液，加入6ml甲醇，混合均匀，即得含内标甲醇溶液。
[0259]
步骤111：ptad衍生化试剂的配制：称取ptad2mg至容量瓶加入5ml乙腈完全溶解，用乙腈稀释至10ml,混匀，即得衍生化试ptad。
[0260]
步骤112：校准曲线样品处理：取校准曲线干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μl含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1ml正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μl0.2mg/mlptad衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μl乙醇终止反应，氮气吹干，100μl60％甲醇复溶，10μl进样。
[0261]
步骤113：qc样品处理：取qc干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μl含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1ml正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μl0.2mg/mlptad衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μl乙醇终止反应，氮气吹干，100μl60％甲醇复溶，10μl进样。
[0262]
步骤114：干血斑样品处理：取干血斑样本，用3mm打孔器取3mm干血斑样本至96孔深孔板板，向干血斑加入200μl含内标甲醇溶液，室温超声30min提取，样本中加入1ml正己烷，涡旋5min，4℃12000rpm离心5min后取上清液，氮气吹干，加入50μl0.2mg/mlptad衍生化试剂，室温条件下衍生1小时，加入100μl乙醇终止反应，氮气吹干，100μl60％甲醇复溶，10μl进样。
[0263]
步骤115：计算结果：采用masslynx进行数据处理，用线性回归加权1/x或1/x2生成标准曲线，其中x为维生素的加标浓度，y为维生素峰面积与内标峰信号的比值。
[0264]
4.方法验证：
[0265]
图1为干血斑样本中的25-羟基维生素d2的hplc色谱图；图2为干血斑样本中的25-羟基维生素d3的hplc色谱图。从图1和图2中可以看出，在检测方法中，25-羟基维生素d的标准品与干血斑样品的峰形对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
[0266]
4.1校准曲线
[0267]
采用同位素内标定量法，采用masslynx进行数据处理，用线性回归加权1/x或1/x2生成标准曲线，其中x为维生素的加标浓度，y为维生素峰面积与内标峰面积的比值，建立校准曲线，并计算出干血斑中25-羟基维生素d待测物的浓度。25-羟基维生素d在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.997以上，详见表9。
[0268]
表9 25-羟基维生素d的线性范围
[0269][0270]
4.2加标回收率考察：随机选取一例干血斑样品，其中1个不加标准品，其它2个分别加入两个浓度的qc标准品，以相同步骤重复处理并测定6次，以同位素内标法定量测定25-羟基维生素d的浓度，计算回收率结果，重复三个批次，见表10。结果显示，干血斑25-羟基维生素d的加标回收率结果85％-115％之间，均满足要求。
[0271]
表10干血斑25-羟基维生素d的加标回收率结果(单位ng/ml)
[0272][0273][0274]
4.3准确度精密度试验：取干血斑质控样本一天内重复处理6批，处理3天，以同位素内标法定量测定9种25-羟基维生素d的浓度，连续三日统计批内和批间精密度和准确度，计算结果见表11，表12。结果显示：批内/间准确度结果在85％-115％之间，rsd值小于15％，符合要求。
[0275]
表11：批内精密度和准确度(n＝6)
[0276][0277][0278]
表12：批间精密度和准确度(n＝18)
[0279][0280]
5.结论
[0281]
本实施例采用hplc-ms方法测定了人干血斑中的25-羟基维生素d，所述的方法具有灵敏度高，特异性强等特点。采用同位素内标法定量能极大的消除基质效应和其他组分的干扰，不受样品处理过程影响，能够达到准确定量。同时采用液液萃取和衍生化的方法能够用较少的血液样本，快速高效的进行样品检测，处理方便。
[0282]
考察了25-羟基维生素d在干血斑中三日的加标回收率，均在85％-115％之间，符合要求。同时考察了准确度和精密度，方法的重现性结果表明，干血斑中的25-羟基维生素d的日内精密度，日间精密度，rsd小于15％，准确度在85％-115％之间，方法的重现性良好。
[0283]
本发明的方法与其它lc-ms/ms方法相比，灵敏度较高，样本用量小，2分钟之内可完成检测25-羟基维生素d，可用于临床上干血斑25-羟基维生素d的检测。
[0284]
应当理解的是，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。