一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片及其制备方法

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片及其制备方法。


背景技术：

2.1型糖尿病是一种会导致非常严重的继发性并发症的慢性疾病，且不可治愈，胰岛素是这类患者终身赖以生存的药物。无论是短效、中效还是长效胰岛素，都需要依赖注射器进行皮下注射或输送，且往往伴随着频繁的血糖监测。长此以往，患者们都会面临感染或低血糖的风险。由于微针具有无痛和微创的优势，有望取代皮下注射作为糖尿病患者的治疗方案。
3.在过去对胰岛素微针的研究中，研究者们致力于解决如何快速响应和控释胰岛素的问题，大都以葡萄糖氧化酶和苯硼酸衍生物为响应元件，制备出对缺氧响应、ph响应、过氧化氢响应以及多重响应的智能胰岛素聚合物微针。然而，这些微针中的响应元件大都以囊泡或微球为载体，且组成成分过于复杂，这极大的限制了微针的载药量，也增加了很多非有效成分在皮肤甚至是体内的残留。在生产制造方面，这些具有敏感响应能力的囊泡或微球在实验室中小规模制备尚且困难，更加难以大规模生产而走向临床和市场。因此，一种既能够实现快速响应和控释药物，又能够以简单的方式大批量制造生产的胰岛素微针亟待研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有智能胰岛素微针产品存在的问题，提供一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片及其制备方法。本发明的葡萄糖响应胰岛素微针贴片是一种制备方法简单、智能释放、高载药量、低残留的胰岛素微针贴片。
5.为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明的一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片，包括微针针体和基底；在基底上设置有微针针体，微针针体包括骨架载体、葡萄糖敏感因子和葡萄糖酸胰岛素；微针针体作为葡萄糖响应控释元件和葡萄糖酸胰岛素的载体；
7.所述的骨架载体选用的材料为苯硼酸或苯硼酸衍生物修饰的甲基丙烯酰化透明质酸，其中，甲基丙烯酸接枝率为30％-100％；苯硼酸或苯硼酸衍生物的接枝率为20％-70％；
8.所述的葡萄糖敏感因子为基于接枝在甲基丙烯酰化透明质酸上的苯硼酸或苯硼酸衍生物和葡萄糖酸胰岛素上的邻二醇形成可逆共价键；
9.基底选用苯硼酸或苯硼酸衍生物修饰的甲基丙烯酰化透明质酸、或甲基丙烯酰化透明质酸。
10.所述的葡萄糖响应胰岛素微针贴片，其微针针体能够通过葡萄糖响应控释元件智能调节胰岛素释放，其释放量为0-70％。
11.所述的葡萄糖响应胰岛素微针贴片，其载药量为能够通过调整葡萄糖酸胰岛素用量调整，载药量为4u～20u。
12.所述的葡萄糖响应胰岛素微针贴片中，其微针针体为阵列分布，优选的阵列分布为：10
×
10，微针针体的针长500-1000μm，微针针体的底部直径150-350μm。
13.本发明的葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
14.s1：甲基丙烯酰化透明质酸的合成
15.将透明质酸和甲基丙烯酸酐作为原料，在极性溶剂中发生反应，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
16.作为优选，所述的透明质酸选用的重均分子量的范围为40-5000kd。
17.作为优选，所述的s1中，反应条件为0～10℃，反应过程中控制ph为8～10，反应时间24～30h。
18.作为优选，所述的s1中，极性溶剂选用水和二甲基甲酰胺的混合溶液，按体积比，水：二甲基甲酰胺＝(1～2)：1。
19.作为优选，所述的s1中，按摩尔比，甲基丙烯酸酐：透明质酸＝(1-10)：1，更优选为(1-6)：1。
20.所述的s1中，甲基丙烯酰化透明质酸的重均分子量为90-500kd。
21.s2：苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的合成
22.将苯硼酸或苯硼酸衍生物、甲基丙烯酰化透明质酸在极性溶剂中反应，得到苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸；
23.作为优选，反应选用的催化剂为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉，按摩尔比，催化剂：苯硼酸＝(1-3)：1。
24.作为优选，苯硼酸衍生物优选为3-氨基苯硼酸。
25.作为优选，所述的s2中，反应条件为弱酸性条件，ph为5～7。
26.作为优选，所述的s2中，极性溶剂选用水、或水和二甲基甲酰胺的混合物。
27.作为优选，所述的s2中，苯硼酸或苯硼酸衍生物：甲基丙烯酰化透明质酸＝(1-5)：1，更优选为(1-3)：1。
28.s3：葡萄糖酸胰岛素的合成
29.将葡萄糖酸活化处理后，得到活化后的葡萄糖酸；
30.将活化后的葡萄糖酸和胰岛素，在极性溶剂中，通过酰胺化反应连接，得到葡萄糖酸胰岛素；
31.所述的s3中，葡萄糖酸活化处理的工艺为：以葡萄糖酸为原料，二甲基亚砜溶剂为溶剂，催化剂为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
32.其中，按摩尔比，催化剂：葡萄糖酸＝1：(1-3)，按摩尔比，n-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐＝1：(1～1.5)；
33.所述的s3中，酰胺化反应中，采用弱碱性混合溶液包括的成分及各个成分的体积比为：0.5～1mol/l的碳酸氢钠水溶液：水：二甲基甲酰胺＝2:3:4。
34.s4：制备葡萄糖响应胰岛素微针贴片
35.将苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸和葡萄糖酸胰岛素混合，并加入光引发剂，得到载药水凝胶；
36.将载药水凝胶加入微针模具的针体部分中，将甲基丙烯酰化透明质酸加入微针模具的基底部分中，将装有物料的模具，干燥脱模，再置于紫外灯下照射交联固化，得到葡萄糖响应胰岛素微针贴片。
37.所述的s4中，加入到模具的方法选用离心或真空的方法。
38.所述的s4中，光引发剂优选为光引发剂2959，紫外光照射时间优选为1-30分钟，更优选为5-30分钟。
39.本发明的一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片及其制备方法，其有益效果在于：
40.1、本发明的葡萄糖响应胰岛素微针贴片是一种基于苯硼酸的葡萄糖响应型控制胰岛素释放的微针贴片，其中，葡萄糖响应胰岛素微针贴片由智能调节胰岛素释放的微针针体和不含药物的基底组成；在制备过程中，通过紫外交联的方法进行固化，减少微针针体材料在皮肤中的残留；整个微针针体的骨架载体作为葡萄糖响应控释元件和药物的载体，从而大幅提高载药量，简化制备工艺。
41.2、本发明的葡萄糖响应胰岛素微针贴片能够通过依赖于葡萄糖浓度而释放药物的智能调节血糖微针贴片。
42.3、本发明是一种无酶的、无囊泡的葡萄糖响应型降糖微针贴片，极大的简化了控释胰岛素降糖微针贴片的制备工艺，更便于临床应用和大规模生产。
附图说明
43.图1为本发明中葡萄糖响应胰岛素微针贴片的释药示意图。
44.图2为实施例2中苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的核磁共振氢谱图。
45.图3为实施例2中葡萄糖酸胰岛素的质谱图(a)和圆二色谱图(b)。
46.图4为实施例2中微针贴片的数码相机照片和光学显微镜下的放大照片；(a)为微针在数码相机下的照片，(b)为微针在显微镜下阵列排布，(c)为微针在显微镜下针体情况，(d)为微针针长。
47.图5为实施例2中微针贴片的机械强度图(a)和透皮效果图(b-c)。
48.图6是不同微针或给药方式对糖尿病大鼠的体内血糖调节能力的比较结果图，红色箭头表示喂食大鼠的时间点。
49.图7是不同微针或给药方式在糖尿病大鼠体内血药含量-时间曲线图，红色箭头表示喂食大鼠的时间点。
具体实施方式
50.本发明的目的是制备一种制备工艺简单、智能释放、高载药量、低残留的胰岛素微针贴片用于糖尿病治疗。本发明中的微针贴片是基于苯硼酸及其衍生物实现智能葡萄糖响应释放药物的微针贴片，在高葡萄糖浓度环境下，胰岛素快速释放；在低葡萄糖环境下，胰岛素释放减慢。
51.下面将结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
52.实施例1
53.一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片，包括微针针体和基底；在基底上设置有微针针体，微针针体包括骨架载体、葡萄糖敏感因子和葡萄糖酸胰岛素；
54.其微针针体部分含有基于苯硼酸和邻二醇形成可逆共价键的葡萄糖敏感因子；微针的针体和基底均采用紫外交联的方式减少微针骨架载体在皮肤中的残留；整个微针针体作为葡萄糖响应控释元件和葡萄糖酸胰岛素的载体，从而大幅提高载药量，简化制备工艺；葡萄糖响应胰岛素微针贴片由载药的针体和不载药的基底组成，提高药物的利用率。其中，微针针体的骨架载体材料为苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化的透明质酸，甲基丙烯酸接枝率为30％-100％；葡萄糖响应控释元件由接枝在甲基丙烯酰化透明质酸上的苯硼酸衍生物和葡萄糖酸胰岛素上的邻二醇组成的可逆共价键组成，苯硼酸的接枝率为20％-70％。
55.葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
56.(1)合成甲基丙烯酰化透明质酸：在10℃，ph9弱碱性条件下，透明质酸和甲基丙烯酸酐在极性溶剂中发生反应，得到甲基丙烯酰化透明质酸。其中，本实施例所述透明质酸分子量范围为40-5000kd，极性溶剂选自水和二甲基甲酰胺按体积比为1.5：1的比例混合，甲基丙烯酸酐和透明质酸的投料摩尔比为6：1。
57.(2)苯硼酸对甲基丙烯酰化透明质酸的修饰：在催化剂和弱酸性条件下，苯硼酸及其衍生物和甲基丙烯酰化透明质酸在极性溶剂中发生反应，得到苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸。其中，所述苯硼酸衍生物为3-氨基苯硼酸，所述催化剂为氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉，弱酸性条件为ph 5-7。极性溶剂选自水，苯硼酸及其衍生物与甲基丙烯酰化透明质酸的投料摩尔比为3：1。
58.(3)合成葡萄糖酸胰岛素：首先在催化剂和极性溶剂条件下，将葡萄糖酸活化处理后，活化后的葡萄糖酸和胰岛素在弱碱性溶剂中通过酰胺化反应连接，得到葡萄糖酸胰岛素。其中，所述催化剂为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，按摩尔比，n-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐＝1：1，葡萄糖酸活化过程在二甲基亚砜溶剂中进行。活化的葡萄糖酸和胰岛素反应所需的弱碱性条件溶剂由1mol/l碳酸氢钠溶液、水和二甲基甲酰胺按2:3:4体积比混合制备而成。
59.(4)制备葡萄糖响应胰岛素微针贴片：将苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂加入到葡萄糖酸胰岛素药物溶液中，制成载药水凝胶。根据葡萄糖酸胰岛素加入的量可以调节载药溶液的浓度，即微针的载药量，单片微针最高载药量为20u。通过离心，将载药水凝胶溶液加至微针模具的针体中，并刮去上层多余载药水凝胶溶液，将不含药物的甲基丙烯酰化透明质酸的水凝胶溶液加到微针模具的基底部分。干燥后脱模，经过紫外照射交联固化，即可得到葡萄糖响应胰岛素微针贴片。优选的，所述光引发剂选自光引发剂2959，紫外光照射时间优选为5-30分钟。
60.在本实施例中，采用的微针模具的阵列规格为：针长500-1000μm，底部直径150-350μm，微针阵列10
×
10。
61.实施例2
62.一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
63.(1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：将1g透明质酸(ha)溶于50ml去离子水中，搅拌充分溶解后，加入34ml n,n-二甲基甲酰胺，然后缓慢滴加7.5mmol的甲基丙烯酸酐(ma)，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，在之后的4h内继续用1mol/l的氢氧化钠溶液调节
ph保持在8到9之间，在4℃下反应24h。反应结束后，加入氯化钠固体使反应液中氯化钠浓度为0.5mol/l，随后加入1.5倍反应液体积的无水乙醇，析出白色沉淀，为甲基丙烯酰化透明质酸(ma-ha)粗产物。将所获得的甲基丙烯酰化透明质酸粗产物溶于水中，使用截留分子量8000-14000的透析袋透析3天，冻干，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
64.(2)苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的制备：将1g上述甲基丙烯酰化透明质酸产物溶解于100ml去离子水中，加入2.5mmol氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉，在室温下活化甲基丙烯酰化透明质酸上的羧基半小时后，加入2.5mmol的3-氨基苯硼酸(3-apba)，用1mol/l盐酸溶液调节ph至6.5，室温反应72小时。之后体转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析3天，冻干，得到苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸(ma-ha-pba)。
65.为了证明苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的成功合成，采用利用核磁共振氢谱进行表征，如图2所示，可以看到甲基丙烯酸和苯硼酸成功接枝，甲基丙烯酸的接枝率为57.6％，苯硼酸的接枝率为25％。
66.(3)葡萄糖酸胰岛素的制备：将4g葡萄糖酸(gluconic acid)溶于10ml二甲基亚砜溶液中；同时，将1.73g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.15g n-羟基琥珀酰亚胺溶于5ml二甲基亚砜溶液中，然后将两溶液混合，在常温下搅拌反应24h。然后，将80mg胰岛素溶于3.6ml 1mol/l碳酸氢钠溶液，水和n,n-二甲基甲酰胺按2:3:4体积比混合的混合溶液中。将1.15ml活化的葡萄糖酸溶液加入到上述胰岛素溶液中，室温下搅拌反应2h。反应完成后将液体转移至截留分子量为1000的透析袋中，用去离子水透析3天，除去未反应的小分子物质。将透析后的反应产物冷冻干燥，得到白色粉末即为葡萄糖酸胰岛素(g-lusulin)。
67.为了证明葡萄糖酸胰岛素的成功合成，使用基质辅助激光解析飞行时间质谱对合成产物的分子量进行表征。如图3所示，合成产物的分子离子峰为6335.059，为分子的加钠峰，所合成产物分子量约为6312，原猪胰岛素分子量为5777.54。经计算可知，合成产物为接枝3个葡萄糖酸分子的葡萄糖酸胰岛素。
68.为了证明合成葡萄糖酸胰岛素的空间结构和活性，采用圆二色谱进行表征。结果如图3所示，合成葡萄糖酸胰岛素的空间结构和活性与原猪胰岛素相似。
69.(4)葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备：将一定量的苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸(ma-ha-pba)和光引发剂2959溶解在去离子水中，此时得到的溶液是黏稠并且具有一定流动性的液体状态。接下来将葡萄糖酸胰岛素加入到上述溶液中，充分溶解得到载药水凝胶。向微针模具的针体部分中加入载药水凝胶，在4000rpm离心10min使得载药水凝胶充分进入微针模具的针体孔洞中形成针体部分。为了节约并有效利用药物，将微针模具的针体部分外的过量的载药水凝胶刮去并收集，加入不含药物的苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸溶液再次以2000rpm离心5min装入微针模具的基底部分中作为微针基底。最后，在干燥脱模后，使用紫外光照射5min交联固化，得到葡萄糖响应胰岛素微针贴片(ma-ha-pba@gins)。本实施例中所制备微针贴片为应用于大鼠体内药效实验，载药量为4u。
70.本实施例的苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸主链和葡萄糖酸胰岛素的合成路线如下：
[0071][0072]
图4和图5显示了葡萄糖响应胰岛素微针贴片的外观形态、机械强度和皮肤插入能力。
[0073]
实施例3
[0074]
一种葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
[0075]
(1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：将0.4g透明质酸溶于20ml去离子水中，搅拌充分溶解后，加入17ml n,n-二甲基甲酰胺，然后缓慢滴加1mmol的甲基丙烯酸酐，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至9，在之后的4h内继续用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph保持在8到9之间，在4℃下反应24h。反应结束后，加入氯化钠固体使反应液中氯化钠浓度为0.5mol/l，随后加入1.5倍反应液体积的无水乙醇，析出白色沉淀，为甲基丙烯酰化透明质酸粗产物。将所获得的甲基丙烯酰化透明质酸粗产物溶于水中，使用截留分子量8000-14000的透析袋透析3天，冻干，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
[0076]
(2)苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的制备：将0.4g上述甲基丙烯酰化透明质酸产物溶解于40ml去离子水中，加入2mmol氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉，在室温下活化甲基丙烯酰化透明质酸上的羧基半小时后，加入1mmol的3-氨基苯硼酸，用1mol/l盐酸溶液调节ph至6.5，室温反应72小时。之后体转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析3天，冻干，得到苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸。
[0077]
该实施例中甲基丙烯酸的接枝率为16％，苯硼酸的接枝率为33.8％。
[0078]
(3)葡萄糖酸胰岛素的制备：首先在催化剂和极性溶剂条件下，将葡萄糖酸活化处理后，活化后的葡萄糖酸和胰岛素在弱碱性溶剂中通过酰胺化反应连接，得到葡萄糖酸胰
岛素。其中，所述催化剂为n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，按摩尔比，n-羟基琥珀酰亚胺：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐＝1：1，葡萄糖酸活化过程在二甲基亚砜溶剂中进行。活化的葡萄糖酸和胰岛素反应所需的弱碱性条件溶剂由1mol/l碳酸氢钠溶液、水和二甲基甲酰胺按2:3:4体积比混合制备而成。
[0079]
(4)葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备：将苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂2959加入到葡萄糖酸胰岛素药物溶液中，制成载药水凝胶。通过离心，将载药水凝胶溶液加至微针模具的针体中，并刮去上层多余载药水凝胶溶液，将不含药物的甲基丙烯酰化透明质酸的水凝胶溶液加到微针模具的基底部分。干燥后脱模，经过紫外照射交联固化30分钟，即可得到葡萄糖响应胰岛素微针贴片。
[0080]
对比例1
[0081]
非葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
[0082]
(1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：将1g透明质酸溶于50ml去离子水中，搅拌充分溶解后，加入34ml n,n-二甲基甲酰胺，然后缓慢滴加7.5mmol的甲基丙烯酸酐，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至8.5，在之后的4h内继续用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph保持在8到9之间，在4℃下反应24h。反应结束后，加入氯化钠固体使反应液中氯化钠浓度为0.5mol/l，随后加入1.5倍反应液体积的无水乙醇，析出白色沉淀，为甲基丙烯酰化透明质酸粗产物。将所获得的甲基丙烯酰化透明质酸粗产物溶于水中，使用截留分子量8000-14000的透析袋透析3天，冻干，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
[0083]
(2)葡萄糖酸胰岛素的制备：将4g葡萄糖酸溶于10ml二甲基亚砜溶液中；同时，将1.73g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1.15g n-羟基琥珀酰亚胺溶于5ml二甲基亚砜溶液中，然后将两溶液混合，在常温下搅拌反应24h。然后，将80mg胰岛素溶于3.6ml 1mol/l碳酸氢钠溶液，水和n,n-二甲基甲酰胺按2:3:4体积比混合的混合溶液中。将1.15ml活化的葡萄糖酸溶液加入到上述胰岛素溶液中，室温下搅拌反应2h。反应完成后将液体转移至截留分子量为1000的透析袋中，用去离子水透析3天，除去未反应的小分子物质。将透析后的反应产物冷冻干燥，得到白色粉末即为葡萄糖酸胰岛素。
[0084]
(3)非葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备：将一定量的甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂2959溶解在去离子水中，此时得到的溶液是黏稠并且具有一定流动性的液体状态。接下来将葡萄糖酸胰岛素加入到上述溶液中，充分溶解得到载药水凝胶。向微针模具的针体部分中加入载药水凝胶，在较高转速离心使得载药水凝胶充分进入微针模具的针体部分孔洞中形成针体部分。为了节约并有效利用药物，并将微针模具的针体部分外的过量的载药水凝胶刮去并收集，加入不含药物的甲基丙烯酰化透明质酸溶液再次以较低转速离心装入微针模具的基底部分中。最后，在干燥脱模后使用紫外光照射交联，形成药物集中于针体的非葡萄糖响应胰岛素微针贴片。
[0085]
对比例2
[0086]
空白微针贴片的制备方法，包括以下步骤：
[0087]
(1)微针骨架载体的制备：方法同实施例2中步骤(1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备和实施例2中步骤(2)苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸的制备。
[0088]
(2)空白微针贴片的制备：将一定量的苯硼酸修饰的甲基丙烯酰化透明质酸和光引发剂2959溶解在去离子水中，此时得到的溶液是黏稠并且具有一定流动性的非载药溶
液。向微针模具中加入上述溶液，在4000rpm离心10min使得非载药溶液充分进入微针模具中。使用紫外光照射5min交联固化，在干燥脱模后得到包不含药物的空白微针贴片。
[0089]
对比例3
[0090]
葡萄糖响应胰岛素微针贴片的制备方法，同实施例1，不同之处在于：
[0091]
在(3)葡萄糖酸胰岛素的制备中，采用弱碱性混合溶液包括的成分及各个成分的体积比为：0.5～1mol/l的碳酸氢钠水溶液：水：二甲基甲酰胺＝1:2:5。则弱碱性混合溶液是悬浮液。不能有效的进行葡萄糖酸胰岛素的合成。
[0092]
应用例1
[0093]
葡萄糖响应胰岛素微针贴片的体内应用
[0094]
糖尿病大鼠建模：参照说明书，采用尾静脉单次高剂量(60mg/kg)注射链脲佐菌素的方法诱导1型糖尿病大鼠模型。注射链脲佐菌素48小时后，连续3天测定大鼠血糖值，空腹血糖值大于11.1mm的大鼠视为造模成功。然后将糖尿病大鼠背部局部部位脱毛，正常饲养2-3天后准备用于实验。
[0095]
将链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠分为4组，分别为空白微针组(对比例2的blank mns)、胰岛素溶液组(s.c.0.4iu)、非葡萄糖响应胰岛素微针贴片组(对比例1的me-ha@gins mns0.4iu)和葡萄糖响应胰岛素微针贴片组(实施例2的me-ha-pba@gins mns 4iu)。在正式给药前，首先将实验用大鼠禁食12h以上，以消除大鼠初始血糖值不一致带来的影响。之后，胰岛素溶液组采用皮下注射的方式给药，另外三组均将微针贴片插入到除毛的大鼠背部皮肤上，并用医用胶带进一步固定。整个给药过程无需麻醉，给药后大鼠让自由活动和饮水，给药后3h和15h进食。
[0096]
(1)微针贴片的血糖调节效果测试：分别于0时，给药后0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24h使用电子血糖仪测即时测定血糖。
[0097]
结果见图6：空白微针贴片组没有产生降糖效果。皮下注射胰岛素组中的大鼠在给药后血糖明显下降，在0.5-2h期间血糖值已经无法用血糖仪检测出，显示为l0，大鼠的状态也变得萎靡不振。当大鼠进食后，血糖值明显上升，在整个未来的6小时内始终处于一个高血糖状态。在相同剂量下非葡萄糖响应胰岛素微针贴片组对血糖的控制相对平缓得多，给药1h后，血糖水平维持在4mmol/l，在正常血糖范围内。同样的，随着大鼠的进食，餐后2小时直至8小时血糖都保持在一个高水平状态。葡萄糖响应胰岛素微针贴片组可以调节糖尿病大鼠血糖稳定在正常值超过12小时。且即使在相对于大鼠给药剂量如此高的情况下，并没有出现导致大鼠低血糖的情况。同时，在第一次进食后，到第二次进食之前血糖一直稳定在正常水平。
[0098]
(2)微针贴片中胰岛素血药浓度-时间的考察：分别于0时，给药后0.5，1，2，4，6，8，12，16，20，24h从大鼠眼眶取血200μl，使用猪胰岛素定量检测试剂盒检测血药浓度。
[0099]
结果见图7：空白微针贴片组给药后血药浓度始终为0。皮下注射胰岛素组中大鼠的血药浓度在0.5h到达巅峰，达到了120mu/l，在2h时衰减为0。在相同剂量下非葡萄糖响应胰岛素微针贴片组血药浓度在1h达到最高，为38mu/l，随后开始下降，在4h完全代谢。葡萄糖响应胰岛素微针贴片组在高血糖大鼠体内可以快速响应，在0.5小时就能达到有效血药浓度(正常大鼠血糖为22
±
5.5miu/l)，并且维持超过12小时。在第二次进食时，血药浓度已经下降到大约不到20miu/l，在16h后完全清除。
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说明本发明制备的葡萄糖响应胰岛素微针贴片能够起到很好的释药效果，对糖尿病大鼠的体内血糖调节能力强，在糖尿病大鼠体内血药含量维持时间长。其释药示意图见图1。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的基本原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。