多功能纳米粒及其制备方法、应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种多功能纳米粒及其制备方法、应用。


背景技术：

2.静脉血栓是临床医学中的常见病症，但是传统的成像技术如核磁并不能精准诊断病人是否患有血栓，也无法判别所患血栓是属于早期血栓还是晚期血栓，更无法分析出血栓的成分。
3.另外，对于需要采用影像确定是否患有血栓病症的病人，往往存在血栓发生的高危风险，即使尚未发病也很有必要预防其产生血栓。现临床上常用的预防血栓的药物如阿司匹林和氯吡格雷虽然具有一定的预防血栓的效果，但是存在改变病人的凝血-抗凝系统，增加病人出血的风险。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种能够增强成像能力，且能够有助于辅助分析和鉴别血栓成分、血栓发病程度，并能够提高血栓预防效果的多功能纳米粒及其制备方法、应用。
5.本发明提供一种多功能纳米粒，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂、光敏剂以及靶向配体蛋白，所述肥大细胞脱颗粒抑制剂、所述磁共振造影剂和所述光敏剂由所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物包覆在内或嵌入在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的外部表面具有端羧基，所述靶向配体蛋白与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物外部的端羧基共价连接。
6.在其中一个实施例中，所述肥大细胞脱颗粒抑制剂为富马酸酮替芬以及奈多罗米中的一种或多种的混合；和/或
7.所述磁共振造影剂为油酸四氧化三铁以及油酸二氧化锰中的一种或多种的混合；和/或
8.所述光敏剂为ir780、ir830以及ce6中的一种或多种的混合；和/或
9.所述靶向配体蛋白为纤维蛋白。
10.在其中一个实施例中，所述多功能纳米粒为球状结构，所述肥大细胞脱颗粒抑制剂、所述磁共振造影剂和所述光敏剂包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的内部；和/或
11.所述多功能纳米粒具有超顺磁性；和/或
12.所述多功能纳米粒的平均粒径为268.87
±
14.00nm，在水中的分散系数为0.06
±
0.02；和/或
13.所述多功能纳米粒的平均表面电位为0.46
±
0.21mv；和/或
14.所述肥大细胞脱颗粒抑制剂在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物内的包封率为60％以上。
15.本发明还提供一种如上述任一实施例中所述的多功能纳米粒的制备方法，包括如
下步骤：
16.将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述肥大细胞脱颗粒抑制剂、所述磁共振造影剂以及所述光敏剂在溶剂中混合，超声乳化，形成初乳液；
17.向所述初乳液中加入聚乙烯醇水溶液，超声乳化，形成复乳液；
18.向所述复乳液中加入异丙醇水溶液，搅拌，离心弃上清，形成第一中间产物；
19.向所述第一中间产物中加入edc、nhs以及第一mes缓冲液，孵育，离心弃上清，形成第二中间产物；
20.向所述第二中间产物中加入第二mes缓冲液和所述靶向配体蛋白，孵育，离心弃上清，形成所述多功能纳米粒。
21.在其中一个实施例中，将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述肥大细胞脱颗粒抑制剂、所述磁共振造影剂以及所述光敏剂在溶剂中混合的步骤还包括：
22.先将所述肥大细胞脱颗粒抑制剂以及所述光敏剂在二甲基亚砜中溶解，将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物在二氯甲烷中溶解；
23.将溶解后的所述肥大细胞脱颗粒抑制剂以及所述光敏剂加入含有所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液中；
24.向所述二氯甲烷溶液中加入所述磁共振造影剂。
25.在其中一个实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述肥大细胞脱颗粒抑制剂、所述磁共振造影剂、所述光敏剂以及所述靶向配体蛋白的投料质量比为(80～120)：(8～12)：(8～12)：(0.8～1.2)：(8～12)。
26.在其中一个实施例中，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为1％～5％；和/或
27.所述异丙醇水溶液的质量浓度为1％～3％。
28.在其中一个实施例中，在形成所述第一中间产物的过程中，离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃；和/或
29.在形成所述第二中间产物的过程中，孵育是指向所述第一中间产物中加入edc、nhs以及第一mes缓冲液后，将其置于低温摇床中孵育，摇速为60rpm～100rpm，温度为3℃～5℃；和/或
30.在形成所述第二中间产物的过程中，离心的转速为离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃；和/或
31.在形成所述多功能纳米粒的过程中，孵育是指向所述第二中间产物中加入第二mes缓冲液和所述靶向配体蛋白后，将其置于低温摇床中孵育，摇速为60rpm～100rpm，温度为3℃～5℃；和/或
32.在形成所述多功能纳米粒的过程中，离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃。
33.在其中一个实施例中，所述第一mes缓冲液的ph值为5～6；和/或
34.所述第二mes缓冲液的ph值为7.5～8.5。
35.本发明还提供一种如上述任一实施例中所述的多功能纳米粒在制备血栓成像制剂中的应用。
36.上述的多功能纳米粒的外部表面连接了能够靶向血栓中的纤维蛋白的靶向配体蛋白，能够实现将多功能纳米粒聚集在血栓部位，多功能纳米粒中还负载有肥大细胞脱颗
粒抑制剂、磁共振造影剂以及光敏剂，磁共振造影剂和光敏剂分别具有磁共振成像和光声成像能力，能够增强磁共振和光声仪对血栓的成像能力，并结合靶向配体蛋白能够靶向纤维蛋白的功能可以实现辅助分析血栓成分、鉴别发病程度、判断是早期血栓还是晚期血栓的功能，且肥大细胞脱颗粒抑制剂能够抑制血管内皮细胞中的肥大细胞脱颗粒，进而可以抑制血栓形成，且不会增加病人出血风险。
附图说明
37.图1为本发明实施例1、对比例1以及对比例2的结构表征结果，其中，a为对比例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-creka的透射电镜图像；b、c、d为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-creka的透射电镜图像；e为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka的透射电镜图像的元素地图分析；f为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka的vsm结果；g为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka纳米粒和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4纳米粒的粒径分布；h为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4的表面电位；i为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4的傅里叶红外图谱；j为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4中的kf的包封率；k为实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4中的kf的药物释放曲线。
38.图2为实施例1和对比例2以及对比例3的核磁成像能力表征结果，其中，a为注射对比例3中生理盐水、对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka后核磁成像结果；b为a对应的核磁信号强度统计图；c为自然状态下的t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间线型相关关系图；d为注射实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka后的t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间线型相关关系图；e为注射对比例3中生理盐水后的t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间线型相关关系图；f为注射对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4后的t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间线型相关关系图。
39.图3为实施例1、对比例2以及对比例3的光声成像能力表征结果，其中，a为注射对比例3中生理盐水、对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka后光声成像结果；b为a对应的光声成像信号强度统计图。
40.图4为实施例1、对比例3以及对比例4的血栓预防能力表征结果，其中，a注射对比例3中生理盐水、对比例4中kf和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka后核磁成像结果；b为a对应的核磁信号强度统计图。
41.图5为实施例1、对比例3对凝血功能的影响情况的表征结果。
具体实施方式
42.以下结合具体实施例对本发明的多功能纳米粒及其制备方法、应用作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
43.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
44.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
45.本发明一实施例提供一种多功能纳米粒，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂、光敏剂以及靶向配体蛋白，肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂和光敏剂由聚乳酸-羟基乙酸共聚物包覆在内或嵌入在聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的外部表面具有端羧基，靶向配体蛋白与聚乳酸-羟基乙酸共聚物外部的端羧基共价连接。
46.上述的多功能纳米粒的表面连接了能够靶向血栓中的纤维蛋白的靶向配体蛋白，能够实现将多功能纳米粒聚集在血栓部位，能够增强磁共振和光声仪对血栓的成像能力，并可以实现辅助分析血栓成分、鉴别发病程度，还可以抑制血栓形成。
47.在一个具体的示例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000da以上。聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有良好的生物相容性、无毒、可降解，采用分子量为10000da以上聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为多功能纳米粒的载体，对肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂以及光敏剂等功能性物质具有良好的负载效果。进一步地，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为12000da以上。
48.在一个具体的示例中，肥大细胞脱颗粒抑制剂是一种能够抑制血管内皮中的肥大细胞脱颗粒的药物。具体地，肥大细胞脱颗粒抑制剂可以但不限于是富马酸酮替芬以及奈多罗米中的一种或多种的混合。通过肥大细胞脱颗粒抑制剂抑制血管内皮中的肥大细胞脱颗粒，进而抑制血栓形成，从而实现预防血栓的效果，不会增加病人出血的风险。
49.在一个具体的示例中，磁共振造影剂是一种具有超顺磁性的造影剂。具体地，磁共振造影剂可以但不限于是油酸四氧化三铁以及油酸二氧化锰中的一种或多种的混合。通过油酸改性的四氧化三体和二氧化锰具有超顺磁性，在磁共振成像中具有更高的弛豫和敏感性。
50.在一个具体的示例中，光敏剂是一种提高光声成像能力的染料。具体地，光敏剂可以但不限于是ir780、ir830以及ce6中的一种或多种的混合。其中，ir780的化学全称为11-氯-1,1'-二正丙基-3,3,3',3'-四甲基-10,12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐，ir830的化学全称为2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2h-苯并[e]吲哚-2-亚基)亚乙基]-1-环己烯-1-基]乙烯基]-1,1,3-三甲基-1h-苯并[e]吲哚4-甲基苯磺酸盐，ce6的化学全称为二氢卟吩e6。
[0051]
在一个具体的示例中，靶向配体蛋白具有靶向血栓中纤维蛋白的特异性。具体地，靶向配体蛋白可以但不限于是融合蛋白。
[0052]
在一个具体的示例中，多功能纳米粒为球状结构，肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂和光敏剂包覆在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的内部。
[0053]
在一个具体的示例中，多功能纳米粒具有超顺磁性，有利于提高多功能纳米粒的磁共振成像能力。
[0054]
在一个具体的示例中，多功能纳米粒的平均粒径为268.87
±
14.00nm，在水中的分散系数为0.06
±
0.02。
[0055]
在一个具体的示例中，多功能纳米粒的平均表面电位为0.46
±
0.21mv。
[0056]
在一个具体的示例中，肥大细胞脱颗粒抑制剂在聚乳酸-羟基乙酸共聚物内的包封率为60％以上。多功能纳米粒包封肥大细胞脱颗粒抑制剂的效果较好，能够有效预防血栓形成，减少病人出血风险。
[0057]
本发明一实施方式还提供一种如上述任一示例中的多功能纳米粒的制备方法，包括如下步骤s110～步骤s150。
[0058]
步骤s110：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂以及光敏剂在溶剂中混合，超声乳化，形成初乳液。
[0059]
具体地，步骤s110中将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂以及光敏剂在溶剂中混合的步骤可以进一步细分为步骤s111～步骤s113。
[0060]
步骤s111：先将肥大细胞脱颗粒抑制剂以及光敏剂在二甲基亚砜中溶解，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物在二氯甲烷中溶解。
[0061]
步骤s112：将溶解后的肥大细胞脱颗粒抑制剂以及光敏剂加入含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液中。
[0062]
步骤s113：向二氯甲烷溶液中加入磁共振造影剂。
[0063]
进一步地，步骤s110中超声乳化的时间为60s～180s。超声乳化采用的仪器例如可以是超声波声震仪。
[0064]
步骤s120：向初乳液中加入聚乙烯醇水溶液，超声乳化，形成复乳液。
[0065]
进一步地，聚乙烯醇水溶液的浓度为1％～5％。
[0066]
进一步地，步骤s120中超声乳化的时间为60s～180s。
[0067]
步骤s130：向复乳液中加入异丙醇水溶液，搅拌，离心弃上清，形成第一中间产物。
[0068]
进一步地，异丙醇水溶液的浓度为1％～3％。
[0069]
进一步地，搅拌至二氯甲烷完全挥发。
[0070]
进一步地，离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃，离心时间为8min～20min。
[0071]
步骤s140：向第一中间产物中加入edc、nhs以及第一mes缓冲液，孵育，离心弃上清，形成第二中间产物。
[0072]
具体地，孵育是指向第一中间产物中加入edc、nhs以及第一mes缓冲液后，将其置于低温摇床中孵育，摇速为60rpm～100rpm，温度为3℃～5℃。
[0073]
进一步地，第一mes缓冲液的ph值为5～6。
[0074]
具体地，离心的转速为离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃。
[0075]
步骤s150：向第二中间产物中加入第二mes缓冲液和靶向配体蛋白，孵育，离心弃上清，形成多功能纳米粒。
[0076]
具体地，孵育是指向第二中间产物中加入第二mes缓冲液和靶向配体蛋白后，将其置于低温摇床中孵育，摇速为60rpm～100rpm，温度为3℃～5℃。
[0077]
进一步地，第二mes缓冲液的ph值为7.5～8.5。
[0078]
具体地，离心的转速为8000rpm～12000rpm，离心的温度为3℃～5℃。
[0079]
在一个具体的示例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物、肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂、光敏剂以及靶向配体蛋白的投料质量比为(80～120)：(8～12)：(8～12)：(0.8～1.2)：(8～12)。在这一质量比范围内，所得到的多功能纳米粒中聚乳酸-羟基乙酸共聚物负载肥大细胞脱颗粒抑制剂、磁共振造影剂、光敏剂并与靶向配体蛋白连接的综合效果最佳。
[0080]
本发明一实施例还提供一种如上述任一示例中的多功能纳米粒在制备血栓成像制剂中的应用。
[0081]
上述的多功能纳米粒通过负载磁共振造影剂、光敏剂能够显著提高核磁和光声仪对血栓的成像能力，连接的靶向配体蛋白能够靶向血栓中的纤维蛋白，使多功能纳米粒在血栓部位聚集。进一步地，血栓中的纤维蛋白的含量随着发病程度的加强而不断提高，越晚期血栓中纤维蛋白越多，核磁或者光声成像的信号越强，多功能纳米粒通过磁共振或者光声仪成像，通过信号强度可以辅助鉴别血栓的发病程度，判断是早期血栓还是晚期血栓，以及辅助分析血栓成分，判断是仅需进行抗凝还是需要进行溶栓。更进一步地，多功能纳米粒还包裹了肥大细胞脱颗粒抑制剂，能够预防血栓的形成，且不会影响凝血功能，降低了出血风险。
[0082]
以下为具体实施例。以下具体实施例中，若无特殊说明，所有原料均可来源于市售。
[0083]
以下具体实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物购于山东岱罡生物科技有限公司，分子质量12000da，缩写代号为plga；
[0084]
肥大细胞脱颗粒抑制剂为富马酸酮替芬，购于百灵威科技有限公司，缩写代号为kf；
[0085]
磁共振造影剂为油酸四氧化三铁，购于美国大洋生物制药有限公司，缩写代号为fe3o4；
[0086]
光敏剂为ir780，购于百灵威科技有限公司，缩写代号为ir780；
[0087]
靶向配体蛋白为融合蛋白，购于江苏强耀生物科技有限公司，缩写代号为creka。
[0088]
实施例1：
[0089]
步骤1：形成第一中间产物kf/ir780-plga-fe3o4：
[0090]
将0.5mg ir780和5mg富马酸酮替芬溶于20μl的二甲基亚砜中，将溶解后的ir780和富马酸酮替芬以及50mg plga加入至2ml的二氯甲烷中，再加入200μl的油酸四氧化三铁(25mg/ml)，用超声波声震仪对混合物声震60s，形成初乳，加入8ml的pva溶液(质量浓度为4％)超声破声震仪声震60s，得到复乳，加入10ml异丙醇(质量浓度为2％)，室温下磁力搅拌蒸干有机溶剂二氯甲烷，在转速为10000rpm，温度为4℃的条件下离心10min，得到第一中间产物kf/ir780-plga-fe3o4。
[0091]
步骤2：形成多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka：
[0092]
向得到的第一中间产物kf/ir780-plga-fe3o4中加入0.1mmoledc、0.5mmolnhs和5ml mes缓冲液(ph＝5.2)，置于低温摇床中80rpm，4℃的条件下孵育3h,在转速为10000rpm，温度为4℃的条件下离心10min，弃上清，加入0.1mmol mes缓冲液(ph＝8)和5mg creka,置于低温摇床中80rpm，4℃的条件下孵育12h,在转速为10000rpm，温度为4℃的条件下离心10min，弃上清，得到多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka。
fe3o
4-creka，用核磁对血栓成像。
[0112]
如图2所示，核磁成像结果如下：
[0113]
a和b表明实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka可以显著提高核磁对静脉血栓的成像能力，而且晚期血栓比早期血栓的核磁信号更强，表明晚期血栓中的纤维蛋白含量更多。依据以上结果表明，实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka可以帮助鉴别是早期血栓还是晚期血栓。
[0114]
c～f表明线性分析结果证实在自然状态的情况下t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间不存在线性相关关系。注射了实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka之后，t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间存在良好的线性相关关系。注射了对比例3中生理盐水和对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4之后，t2驰豫率和纤维蛋白灰度值之间几乎不存在的线性相关关系，表明实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka可以帮助分析血栓中的纤维蛋白成分的多少，有助于指导血栓的个体化治疗。
[0115]
对实施例1、对比例2以及对比例3的光声成像能力进行表征，具体地，测试方法如下：
[0116]
在sd大鼠上建立颈静脉血栓模型，分成三组，分别注射对比例3中生理盐水、对比例2中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o4和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka，用光声仪成像。
[0117]
如图3所示，成像结果如下：
[0118]
a～b表明实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka可以显著提高光声仪pi模式下对静脉血栓的成像能力，而且晚期血栓比早期血栓的信号更强，表明晚期血栓中的纤维蛋白含量更多。
[0119]
对实施例1、对比例3以及对比例4的血栓抑制能力进行表征，具体地，测试方法如下：
[0120]
将sd大鼠分为三组，分别注射对比例3中生理盐水、对比例4中kf和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka，三天后，分别诱导血栓形成，并通过核磁成像观测。
[0121]
如图4所示，血栓预防能力测试结果如下：
[0122]
a～b表明经对比例4中kf和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka处理后的血栓发生率显著降低，表明实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka可以预防血栓的形成。
[0123]
对实施例1关于凝血功能的影响情况进行表征，具体地，测试方法如下：
[0124]
将sd大鼠分为两组，分别注射对比例3中生理盐水和实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka，三小时后，分别检测两组sd大鼠的凝血常规，包括aptt，pt和tt。
[0125]
如图5所示，多功能纳米粒对凝血功能的影响情况测试结果如下：
[0126]
经多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka作用后，凝血功能并没有明显变化，表明实施例1中多功能纳米粒kf/ir780-plga-fe3o
4-creka不会增加出血风险。
[0127]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0128]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。