人参皂苷Re在制备抗抑郁药物中的应用

人参皂苷re在制备抗抑郁药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及人参皂苷re在制备抗抑郁药物中的应用。


背景技术：

2.抑郁症是由多种原因引起的以抑郁为主要特征的一种常见的情感性精神障碍类疾病，其以持久且显著的心情低落为主要特征，临床表现为广泛的精神、情感或躯体方面的障碍和痛苦，例如情绪低落、心情沮丧、失眠乏力、自责自罪、思维迟钝、疲乏无力、闭门独居、回避社交、记忆力减退等症状。如近年来世卫生组织数据显示，抑郁症患病人数仅次于心脏病、艾滋病等疾病，到2030年，将成为世界负担最大的疾病之一。
3.目前，药物治疗大多以化学合成的西药为主，如五羟色胺再摄取抑制剂以及五羟色胺和去甲肾上腺素双重再摄取抑制剂等。这些药的主要作用与增加突触间隙神经递质含量密切相关。但这些化学合成抗抑郁药普遍具有见效慢、周期长、副作用大的缺点，而传统中药因具有副作用小，来源丰富，靶点广泛等的优点，使得中药在抑郁症治疗方面的应用日益广泛，因此，有必要开发出更多能治疗抑郁症的中药。
4.除了单胺类神经递质之外，brain derived neurotrophic factor(bdnf)的功能下调与抑郁的发病密切相关。研究报道，在临床抑郁患者的前额叶皮质和海马出现萎缩，此现象与bdnf的表达下调相关。而抗抑郁药物的使用能够上调抑郁所致的bdnf的表达减少，并产生抗抑郁样作用。tyrosine kinase receptor b(trkb)，作为bdnf的功能性受体，高度分布在脑中通过与bdnf结合，通过系列反应启动第二信使途径。而k252a,作为选择性trkb受体阻断剂，广泛用于药理学研究。在抑郁患者死后脑研究中发现前额叶皮质和海马中trkb表达下调。bdnf 通过trkb受体被激活后发生构象变化并自主磷酸化酪氨酸残基，进一步引起下游信号通路信号级联反应。主要影响丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，mapk)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated proteinkinases，erk)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，pi3k)/蛋白激酶b(protein kinase b，akt)途径，这些信号通路最终通过激活核转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(camp-response element binding protein，creb)来调控多种基因的转录和表达。利血平诱导的抑郁模型造模周期短，病理机制明确，如单胺类神经递质减少，而且bdnf，trkb和creb的表达减少，所以作为中药或西药的药效筛查的动物模型。
5.人参盛产于中国东北，是五加科人参属多年生宿根性草本植物，是中国重要的宝藏，被称为百草之王，具有补脾益肺、大补元气和安神益智等功效，是天然药材的首选。人参皂苷是人参主要的生物活性物质。到目前为止，已分离鉴定60 余种人参皂苷单体，其中5种主要皂苷(人参皂苷rb1、rb2、rc、re和rg1) 占总皂苷的80％以上。人参皂苷re含量丰富，提取分离纯化工艺成熟，单体容易获得，具有较好的成药性。人参皂苷re是四环三萜类衍生物，为无色针状结晶。人参皂苷re主要分布在人参的根、茎、叶，尤其在人参侧根中含量最为丰富。大量研究均证明了人参皂苷re在抗氧化应激损伤，抗炎，抗过敏，抗癌，抗衰老以及提高免疫力等多个方面的药理活性。同时研究表明，人参皂苷re对神经炎症和神经退行性疾
病有一些作用。尤其在中枢神经系统中人参皂苷re通过抗氧化和抗炎作用提高脑功能。这进一步提示了人参皂苷re的药用价值。但是未见研究报道人参皂苷re对利血平诱导的抑郁模型中的抗抑郁作用及其作用机制。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的问题是如何起效快和疗效持久地进行抗抑郁治疗，研究人参皂苷re的抗抑郁作用及其trkb信号通路介导的抗抑郁作用机制。
7.为解决上述问题，本发明首先提出了人参皂苷re在制备动物抗抑郁药物中的应用。
8.本发明所述抑郁是由于动物大脑海马中t-trkb表达被抑制后出现的抑郁样行为。
9.本发明所述抑郁样行为不动时间延长或学习记忆能力下降。
10.本发明所述抑郁样行为为使用利血平后出现的。
11.本发明所述动物为哺乳动物。
12.本发明所述哺乳动物为人或小鼠。
13.本发明所述人参皂苷re用于小鼠抑郁模型的剂量为30mg/天/kg，用药时间为7-14天。
14.本发明所述小鼠抑郁模型是由利血平诱导得到。
15.本发明所述小鼠抑郁模型的抑郁样行为是不动时间的减少、学习记忆能力下降、小鼠眼睑下垂或体温下降中的一种或几种。
16.本发明所述人参皂苷re剂量为30mg/天/kg，用药时间为7-14天。
17.本发明所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂中的一种。
18.本发明还提出了一种抗抑郁药物组合物，所述药物组合物中人参皂苷re作为所述药物组合物的单一活性成分或是其他激活trkb信号通路的化合物作为共同的活性成分。
19.本发明所述治疗动物抑郁药物为激活trkb信号通路的调节剂。单体人参皂苷re可以通过激活trkb信号通路对利血平诱导的抑郁起到治疗作用，单体人参皂苷re给药显著增加了trkb蛋白的表达。
20.本发明首次发现单体人参皂苷re对利血平诱导的抑郁的治疗作用，从人参皂苷re的给药剂量和给药时间两个方面阐述了其对利血平抑郁样行为的作用，证明了单体人参皂苷re能够对由利血平诱导得到小鼠抑郁模型具有的作用是缩短强迫游泳和悬尾试验中的不动时间、恢复小鼠的学习记忆能力、降低了小鼠眼睑闭合程度和提高体温。
21.本发明所述单体人参皂苷re是从传统中药人参中提取的天然中药单体，对人体具有较低的毒副作用，具有较高的生物安全性，适合长期用药，且疗效显著，且对于明确化学结构的中药单体的研究能够更好的了解中药的作用机制，为中药的广泛应用或与其他中药配伍比例的优化奠定了基础，具有重大意义。
22.本发明所述人参皂苷re对抑郁症继发的学习记忆能力下降等具有明显的缓解作用。
具体实施方式
23.下面结合实施例进一步描述本发明，但本发明的应用范围不限于以下实施方式。
对于本领域技术人员而言，本发明不限于以下示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
24.本发明中使用的人参皂苷re购至吉林大学化学学院，其纯度为99％。人参皂苷re属于四环三萜类的衍生物，呈无色针状结晶，人参皂苷re分子式为 c
48h82o18
，分子量为947.14，其化学结构式如下：
[0025][0026]
实施例1、人参皂苷re给药7天对利血平诱导的小鼠抑郁模型的抑郁样行为的影响。
[0027]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)。
[0028]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0029]
主要实验仪器：小鼠旷场行为测试仪(自制，直径48.8cm，直径16cm，底部19等分)，小鼠强迫游泳行为测试仪(自制，高25cm，直径11cm，水深12cm，水温25
±
1℃)，电子天平(cnshp上海衡平仪器仪表厂)。
[0030]
分组与给药：将小鼠随机分为7组，每组7只，分别为对照组(control)，利血平模型组(reserpine，i.p，2mg/kg)，利血平 人参皂苷re低剂量组(10mg/kg)，利血平 人参皂苷re中剂量组(30mg/kg)，利血平 人参皂苷re高剂量组(90 mg/kg)，利血平 氟西汀
(fluoxetine)10mg/kg组，利血平 fluoxetine 20mg/kg 组；人参皂苷re，氟西汀，0.3％羧甲基纤维素钠(cmc，溶媒)灌胃前两小时禁食，灌胃1小时后腹腔注射生理盐水或利血平。人参皂苷re溶于0.3％羧甲基纤维素钠，氟西汀溶于双蒸水，利血平溶于生理盐水，连续给药7天后进行检测。
[0031]
一、旷场实验
[0032]
将连续给药7天后的小鼠放在旷场实验箱(聚丙烯材料制作，直径48.8cm，高16cm)中央，实验装置的底部分为19个相等的区域，在每只小鼠实验后擦净实验装置并用酒精消毒，以达到除去小鼠残留气味的目的，防止对下一只鼠的运动产生影响。实验时间为6分钟，在实验过程中，用摄像机记录小鼠的水平运动 (穿格次数)和竖直运动(小鼠前肢的抬举)次数。结果用平均值
±
se表示。
[0033]
二、强迫游泳实验
[0034]
准备透明圆柱体有机玻璃容器(高25cm、直径11cm)，装入温水(水深 12cm，水温25
±
1℃)。将单只小鼠单放入玻璃容器中强迫其游泳，每只小鼠的游泳时间为6分钟。实验期间，用摄像机记录全程并从第三分钟开始统计小鼠的不动时间，小鼠不动指的是小鼠停止挣扎或只通过微小的肢体运动来保持头部浮在水面。游泳实验结束后，用干净的毛巾将小鼠身体擦干，并将其放回原来鼠笼。每测试一只小鼠更换一次干净的水，减少因上一只小鼠遗留的排泄物和气味造成的影响。
[0035]
三、悬尾实验
[0036]
将小鼠尾巴(距离尾巴尖约1cm)粘贴在支架上，使小鼠倒挂在实验台上，头部离实验平台约15cm，每只小鼠两侧用木板隔开防止小鼠直接相互注视对实验产生干扰，悬挂6分钟，用摄像机记录，统计小鼠在后4min内的不动时间。
[0037]
人参皂苷re反复给药7天对旷场实验自发运动量的影响试验见表1a和1b 所示，连续给予小鼠7天人参皂苷re(10，30和90mg/kg)和氟西汀(10、20mg/kg)，在旷场实验中，小鼠自发活动与利血平对照组相比，没有明显变化，表明人参皂苷re给药没有改变小鼠的自发活动量，其抗抑郁作用具有特异性。
[0038]
表1a人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验水平运动的影响
[0039]
实验分组剂量(mg/kg)穿格次数空白对照组-181.0
±
23.4利血平模型组1.574.3
±
27.6***利血平 低剂量组1075.14
±
19.1利血平 中剂量组30110.6
±
40.3利血平 高剂量组9092.04
±
22.4利血平 盐酸氟西汀组1068.0
±
27.1利血平 盐酸氟西汀组2090.4
±
35.3
[0040]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001。
[0041]
表1b人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验垂直运动的影响
[0042]
实验分组剂量(mg/kg)穿格次数空白对照组-59.1
±
10.7
利血平模型组1.532.8
±
14.2**利血平 低剂量组1024.9
±
12.8利血平 中剂量组3038.7
±
10.9利血平 高剂量组9032.0
±
11.6利血平 盐酸氟西汀组1025.7
±
10.7利血平 盐酸氟西汀组2030.4
±
14.6
[0043]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， **p《0.01。
[0044]
人参皂苷re反复给药7天对绝望模型小鼠强迫游泳不动时间的影响如表2 所示，与对照组相比，利血平反复给药7天显著增加了小鼠不动时间，与模型组相比，人参皂苷re中等剂量(30mg/kg)组连续给药7天可明显缩短小鼠悬尾实验中的不动时间。而低剂量和高剂量组(10mg/kg、90mg/kg)没有明显的不动时间改善作用。盐酸氟西汀阳性对照组(10mg/kg)显著减少不动时间。
[0045]
表2人参皂苷re对利血平诱导小鼠强迫游泳不动时间的影响
[0046]
实验分组剂量(mg/kg)不动时间(s)空白对照组-67.1
±
40.6利血平模型组1.597.5
±
58.1*利血平 低剂量组1082.7
±
48.3利血平 中剂量组3050.6
±
47.1#利血平 高剂量组9054.9
±
65.7利血平 盐酸氟西汀组1052.4
±
45.1#利血平 盐酸氟西汀组20101.4
±
64.8
[0047]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， *p《0.05，与利血平模型组比较，#p《0.05。
[0048]
人参皂苷re反复给药7天对小鼠悬尾实验不动时间的影响如表3所示，与对照组相比，利血平反复给药7天显著增加了小鼠不动时间。与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天显著降低了小鼠不动时间，氟西汀10mg/kg反复给药7天也显著降低了小鼠不动时间。
[0049]
表3人参皂苷re对利血平诱导小鼠悬尾实验不动时间的影响
[0050]
[0051][0052]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001，与利血平模型组比较，#p《0.05。
[0053]
实施例1说明人参皂苷re中剂量组在对利血平诱导小鼠连续给药7天可显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁作用。
[0054]
实施例2、人参皂苷re反复给药7天对利血平诱导的抑郁模型小鼠抑郁样行为影响的机制。
[0055]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)，抗trkb抗体购自美国cell signaling technology公司，抗gapdh抗体和hrp 抗体购自sigma。
[0056]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0057]
主要实验仪器：蛋白电泳仪(jy600c/jy-spct，君意公司)、蛋白印迹电转移仪(tjy-zy5，君意公司)
[0058]
分组与给药：实验分组和给药方法同实施例1相同。
[0059]
一、免疫印迹实验
[0060]
首先，进行小鼠脑组织样品收集。在行为测试后立即将小鼠断头，使用手术刀迅速切取前额叶皮质，并用镊子剥取海马，将取出的海马和前额叶皮质放在实验前准备好的离心管内称重，并将离心管放在冰上。将样品迅速放在-80℃冰箱内冷冻备用。然后用配制好的蛋白裂解液裂解组织，用匀浆机研磨使组织裂解充分，离心取上清得到蛋白，进行免疫印迹实验。
[0061]
western blot法检测trkb蛋白的表达水平：
[0062]
分别制备浓度为10％分离胶及5％浓缩胶来进行聚丙烯酰胺凝胶。电泳结束后进行转膜，进行抗体反应，4℃孵育过夜、洗涤，在室温下孵育二抗1小时，用tbst洗涤。用tanon-5200凝胶成像系统成像，用image j软件分析系统测定条带灰度值。
[0063]
人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天上调了利血平诱导抑郁模型小鼠的海马中t-trkb总蛋白(t-trkb)表达水平如表5所示，并未影响前额叶皮层中t-trkb 表达水平如表4所示。
[0064]
表4人参皂苷re给药7天对利血平诱导小鼠前额叶皮层中t-trkb表达水平的影响
[0065]
实验分组剂量(mg/kg)t-trkb/β-actin比值空白对照组-1.8
±
0.4利血平模型组1.51.6
±
0.2利血平 低剂量组102.3
±
0.3
利血平 中剂量组301.8
±
0.4利血平 高剂量组901.8
±
0.3利血平 盐酸氟西汀组101.9
±
0.3利血平 盐酸氟西汀组201.9
±
0.4
[0066]
表5人参皂苷re给药7天对利血平诱导小鼠海马中t-trkb表达水平的影响
[0067][0068][0069]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001，与利血平模型组比较，#p《0.05，##p《0.01。
[0070]
实施例2表明人参皂苷中剂量(30mg/kg)组反复给药7天上调了利血平诱导抑郁模型小鼠的海马中t-trkb总蛋白(t-trkb)表达水平，表现出抗抑郁作用。
[0071]
实施例3、人参皂苷re给药14天对利血平诱导的小鼠抑郁模型的抑郁行为，眼睑下垂和体温的影响。
[0072]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)
[0073]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0074]
主要实验仪器：主要实验仪器同上
[0075]
分组与给药：将icr雄性小鼠随机分为5组(每组10只)，对照组(control)，利血平模型组(reserpine；i.p，2mg/kg)；利血平 人参皂苷re 30mg/kg剂量组，利血平 人参皂苷re 60mg/kg剂量组；利血平 氟西汀(fluoxetine)10mg/kg剂量组；人参皂苷re，氟西汀，羧甲基纤维素钠(cmc,溶媒)灌胃两小时前撤退食物，灌胃1小时后腹腔注射生理盐水或利血平。人参皂苷re溶于0.3％羧甲基纤维素钠，氟西汀溶于双蒸水，利血平溶于生理盐水。实验分组如下：
[0076]
一、旷场实验
[0077]
实验方法同实施例1。
[0078]
二、强迫游泳实验
[0079]
实验方法同实施例1。
[0080]
三、悬尾实验
[0081]
实验方法同实施例1。
[0082]
四、眼睑下垂程度和体温下降程度评估
[0083]
每一只小鼠的眼睑下垂程度被评估如如下评分标准：0分，正常睁眼；1分，眼睑下垂1/4；2分，眼睑下垂1/2；3分，眼睑下垂3/4；4分，眼睑完全闭合。采用红外非接触电子体温计测量小鼠肛门体温，避免由于体温计插入肛门对小鼠造成刺激从而产生误差。利血平最后一次给药(第七天)1小时后观测眼睑下垂程度，两小时后测量肛温。
[0084]
人参皂苷re反复给药14天对旷场实验自发运动量的影响实验结果见表6a 和6b所示。与利血平对照组相比和模型组相比，各个给药组没有改变小鼠的水平跨格数和竖直站立次数，说明人参皂苷re和氟西汀给药没有改变小鼠的自发活动量，其抗抑郁作用具有特异性。
[0085]
表6a人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验水平运动的影响
[0086]
实验分组剂量(mg/kg)穿格次数空白对照组-117.3
±
25.6利血平模型组1.559.5
±
22.7***利血平 中剂量组3060.6
±
21.5利血平 高剂量组6064.0
±
29.1利血平 盐酸氟西汀组1056.7
±
27.7
[0087]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001。
[0088]
表6b人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验竖直运动的影响
[0089][0090][0091]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001。
[0092]
人参皂苷re反复给药14天对绝望模型小鼠强迫游泳不动时间的影响如表7 所示，与对照组相比，模型组显著增加了小鼠不动时间，与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg反复给药14天显著降低了小鼠不动时间。与模型组相比，氟西汀 10mg/kg反复给药14天显著降低了小鼠不动时间。
[0093]
表7人参皂苷re对利血平诱导小鼠强迫游泳不动时间的影响
[0094]
实验分组剂量(mg/kg)不动时间(s)
空白对照组-105.1
±
32.6利血平模型组1.5171.5
±
21.5***利血平 中剂量组30130.4
±
38.4#利血平 高剂量组60188.3
±
28.0利血平 盐酸氟西汀组10118.1
±
37.2##
[0095]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001，利血平模型组比较，#p《0.05，##p《0.01。
[0096]
人参皂苷re反复给药14天对小鼠悬尾实验不动时间的影响如表16所示，与对照组相比，模型组利血平显著增加了小鼠不动时间。与模型组利血平相比，其它给药组没有改变小鼠不动时间。
[0097]
利血平对小鼠体温和眼睑下垂的作用结果如表8a、8b所示，与对照组相比，利血平组小鼠体温有所下降，在人参皂苷re 30mg/kg反复给药14天明显升高了体温，使体温恢复到正常水平。与对照组相比，利血平模型组小鼠眼睑闭合程度得分显著增高。与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg显著降低了小鼠眼睑闭合程度。
[0098]
表8a人参皂苷re对利血平诱导小鼠肛门温度的影响
[0099]
实验分组剂量(mg/kg)体温差空白对照组-0.11
±
0.2利血平模型组1.50.01
±
0.1利血平 中剂量组300.11
±
0.1利血平 高剂量组600.13
±
0.1利血平 盐酸氟西汀组100.12
±
0.2
[0100]
表8b人参皂苷re对利血平诱导小鼠眼睑下垂的影响
[0101]
实验分组剂量(mg/kg)评分空白对照组
‑‑
利血平模型组1.52.2
±
0.5利血平 中剂量组301.5
±
0.7#利血平 高剂量组601.9
±
0.7利血平 盐酸氟西汀组101.5
±
0.5##
[0102]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与利血平模型组比较， #p《0.05，##p《0.01。
[0103]
实施例3表明与对照组相比，模型组小鼠经过利血平反复给药7天后眼睑下垂程度显著增加，人参皂苷re 30mg/kg和氟西汀10mg/kg反复给药14天逆转了小鼠眼睑下垂。在强迫游泳实验中，人参皂苷re 30mg/kg和氟西汀10mg/kg反复给药14天显著降低了由利血平延长的不动时间。进一步表明了人参皂苷re 30mg/kg和氟西汀10mg/kg反复给药14天具有抗抑郁样作用。旷场实验中，与模型组相比，所有试验药物均不影响小鼠的自发活动。因此，人参皂苷re和氟西汀的抗抑郁样作用并不是通过刺激运动活动中枢来减少不动时间。
[0104]
实施例4、人参皂苷re对利血平诱导小鼠学习记忆功能的作用。
[0105]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)
[0106]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0107]
主要实验仪器：y-mazey迷宫自发交替实验装置、塑料箱(自制，40cm
×
40 cm
×
40cm)
[0108]
分组与给药：将icr雄性小鼠随机分为5组(每组10只)，对照组(control)，利血平模型组(reserpine；i.p，2mg/kg)；利血平 人参皂苷re 30mg/kg剂量组，利血平 人参皂苷re 60mg/kg剂量组；利血平 氟西汀(fluoxetine)10mg/kg 剂量组；人参皂苷re，氟西汀，羧甲基纤维素钠(cmc,溶媒)灌胃两小时前撤退食物，灌胃1小时后腹腔注射生理盐水或利血平。人参皂苷re溶于0.3％羧甲基纤维素钠，氟西汀溶于双蒸水，利血平溶于生理盐水。
[0109]
一、y-mazey迷宫自发交替实验：y-mazey迷宫自发交替实验装置由3等长黑臂(30cm
×
8cm
×
15cm)组成，每两个臂之间夹角为120度，将小鼠放y迷宫任意一臂末端，任其自由探索8min，摄像系统记录动物8min的行为变化，记录以下各项指标：
①
总进臂次数：小鼠进入迷宫臂的次数(以小鼠四只脚均进入臂算作一次进臂)；
②
轮流(交替)一次：依次连续进入y迷宫全部三个臂一次。
③
最大轮流次数：总进臂次数-2。自发轮流行为得分＝总轮流次数/最大轮流次数 (总进臂次数-2)*100％。
[0110]
二、新物体识别实验：新物体识别实验用来检测动物的学习记忆功能，特点是识别能力不受动物运动功能影响，进行新型物体的探索。准备四周封闭的塑料箱(40cm
×
40cm
×
40cm)和a、b、c 3个大小材质相同的特制立方体(5cm
×
5 cm
×
5cm)，其中a、b物体颜色完全一样，c物体颜色与a、b物体完全不同。在正式实验开始前5min，小鼠与a和b两物体放入场地内，进行5min识别，以适应测试环境。5min后将场地内的b物体换作c物体，将小鼠放回实验场地，记录5min内小鼠对新物体c(exploration time for new object，tn)和旧物体a (exploration time for former object，tf)探索的时间。最后计算新物体偏好指数，公式为：识别系数＝tn/(tn tf)，即新物体识别时间和总时间的比值。
[0111]
y-迷宫自发交替实验中人参皂苷re反复给药14天对小鼠自发轮流行为得分的影响结果如表9所示，与对照组相比，模型组小鼠自发轮流行为得分显著降低；与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg反复给药14天组小鼠自发轮流行为得分显著增加。
[0112]
表9y迷宫实验中人参皂苷re对利血平诱导小鼠自发轮流行为的影响
[0113]
实验分组剂量(mg/kg)评分空白对照组-0.57
±
0.10利血平模型组1.50.50
±
0.12*利血平 中剂量组300.54
±
0.11#利血平 高剂量组600.47
±
0.20利血平 盐酸氟西汀组100.52
±
0.10#
[0114]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， *p《0.05，与利血平模型组比较，#p《0.05。
[0115]
人参皂苷re反复给药14天对小鼠新物体识别时间的影响结果如表10所示，与对照组相比，模型组小鼠新物体识别时间显著降低；与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg反复给药14天组小鼠新物体识别时间显著增加。
[0116]
表10人参皂苷re对利血平诱导小鼠新物体识别时间的影响
[0117]
实验分组剂量(mg/kg)评分空白对照组-0.52
±
0.05利血平模型组1.50.31
±
0.11*利血平 中剂量组300.53
±
0.02#利血平 高剂量组600.55
±
0.20利血平 盐酸氟西汀组100.52
±
0.02#
[0118]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， *p《0.05，与利血平模型组比较，#p《0.05。
[0119]
实施例4表明利血平能够对小鼠学习记忆能力造成损伤，与利血平模型组相比，人参皂苷re中剂量组可明显恢复小鼠的学习记忆能力。
[0120]
实施例5、trkb抑制剂k252a对人参皂苷re反复给药7天对利血平诱导的抑郁模型小鼠抑郁样行为的影响。
[0121]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)、 k252a(sigma)
[0122]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0123]
主要实验仪器：主要实验仪器同上
[0124]
分组与给药：将icr雄性小鼠随机分为5组(每组10只)，对照组(control)，利血平模型组(reserpine；i.p，2mg/kg)；利血平 人参皂苷re 30mg/kg剂量组；利血平 人参皂苷re 30mg/kg k252a组；利血平 k252a组；人参皂苷re和羧甲基纤维素钠(cmc,溶媒)灌胃两小时前撤退食物，灌胃1小时后腹腔注射生理盐水或k252a抑制剂，在注射k252a抑制剂1小时后腹腔注射生理盐水或利血平。人参皂苷re溶于0.3％羧甲基纤维素钠，k252a和利血平溶于生理盐水。
[0125]
一、旷场实验
[0126]
实验方法同实施例1。
[0127]
二、强迫游泳实验
[0128]
实验方法同实施例1。
[0129]
三、悬尾实验
[0130]
实验方法同实施例1。
[0131]
四、眼睑下垂程度和体温下降程度评估
[0132]
实验方法同实施例3。
[0133]
在trkb抑制剂k252a的作用下，人参皂苷re反复给药7天对旷场实验自发运动量的影响实验结果见表11a和11b所示。与利血平对照组相比和模型组相比，各个给药组没有改变小鼠的水平跨格数和竖直站立次数，说明人参皂苷re 和k252a给药没有改变小鼠的自发活动量，其抗抑郁作用具有特异性。
[0134]
表11a人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验水平运动的影响
[0135]
实验分组剂量(mg/kg)穿格次数空白对照组-94.3
±
10.4利血平模型组-64.0
±
13.5利血平 人参皂苷re组3052.8
±
7.5利血平 人参皂苷re k252a组3057.8
±
3.2利血平 k252a组-68.3
±
11.9
[0136]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20。
[0137]
表11b人参皂苷re对利血平诱导小鼠旷场实验竖直运动的影响
[0138][0139][0140]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20。
[0141]
在trkb抑制剂k252a的作用下，人参皂苷re反复给药7天对旷场实验自发运动量的影响实验结果见表12所示，与对照组相比，模型组显著增加了小鼠不动时间，与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天显著降低了小鼠不动时间。与人参皂苷治疗组相比，利血平 人参皂苷re k252a拮抗了人参皂苷 re治疗对小鼠不动时间延长的恢复作用。
[0142]
表12人参皂苷re对利血平诱导小鼠强迫游泳不动时间的影响
[0143]
实验分组剂量(mg/kg)不动时间(s)空白对照组-68.1
±
26.2利血平模型组-193.2
±
7.3**利血平 人参皂苷re组3081.3
±
12.9####利血平 人参皂苷re k252a组30148.6
±
11.3&&利血平 k252a组-182.0
±
13.1**
[0144]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， **p《0.01，利血平模型组比较，####p《0.0001，与人参皂苷治疗组相比较， &&p《0.01。
[0145]
人参皂苷re反复给药7天对小鼠悬尾实验不动时间的影响如表13所示，与对照组相比，模型组利血平显著增加了小鼠不动时间。与模型组相比，人参皂苷 re 30mg/kg反复给药7天显著降低了小鼠不动时间。与人参皂苷治疗组相比，利血平 人参皂苷治疗 k252a抑制剂组拮抗了人参皂苷治疗对小鼠不动时间延长的恢复作用。
[0146]
表13人参皂苷re对利血平诱导小鼠悬尾实验不动时间的影响
[0147]
实验分组剂量(mg/kg)不动时间(s)空白对照组-29.2
±
13.6
利血平模型组-175.2
±
15.0****利血平 人参皂苷re组3048.5
±
6.7####利血平 人参皂苷re k252a组30111.9
±
12.7&&利血平 k252a组-153.9
±
24.2**
[0148]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ****p《0.0001，**p《0.01，利血平模型组比较，####p《0.0001，与人参皂苷治疗组相比较，&&p《0.01。
[0149]
利血平对小鼠体温和眼睑下垂的作用结果如表14a、14b所示，与对照组相比，利血平组小鼠体温有所下降，在人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天明显升高了体温，使体温恢复到正常水平。与对照组相比，利血平模型组小鼠眼睑闭合程度得分显著增高。与模型组相比，人参皂苷re 30mg/kg显著降低了小鼠眼睑闭合程度，而在腹腔注射k252a抑制剂后，人参皂苷re的恢复作用受到影响， k252a抑制剂拮抗了部分人参皂苷re的作用。
[0150]
表14a人参皂苷re对利血平诱导小鼠肛门温度的影响
[0151]
实验分组剂量(mg/kg)体温空白对照组-38.4
±
0.4利血平模型组-34.2
±
0.2**利血平 人参皂苷re组3035.4
±
0.3#利血平 人参皂苷re k252a组3034.4
±
0.3&利血平 k252a组-34.3
±
0.2***
[0152]
表14b人参皂苷re对利血平诱导小鼠眼睑下垂的影响
[0153][0154][0155]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ***p《0.001，**p《0.01，利血平模型组比较，#p《0.05，与人参皂苷治疗组相比较， &p《0.05。
[0156]
实施例5表明与对照组相比，模型组小鼠经过利血平反复给药7天后眼睑下垂程度显著增加，人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天逆转了小鼠眼睑下垂和体温下降的情况，但在k252a同时给药的情况下，人参皂苷re对体温下降和眼睑下垂的恢复作用受到抑制。在强迫游泳和悬尾实验实验中，人参皂苷re 30mg/kg 反复给药7天显著降低了由利血平延长的不动时间，并且这种作用会受到k252a 给药的抑制。进一步表明了人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天产生的抗抑郁样作用的作用机制和trkb受体的激活有关。
[0157]
实施例6、在trkb抑制剂k252a作用下，人参皂苷re反复给药7天对利血平诱导的抑
郁模型小鼠抑郁样行为的影响的机制。
[0158]
主要药品与试剂：人参皂苷re(ginsenoside re，gs-re)、盐酸氟西汀 (fluoxetine hydrochloride，sigma)、利血平(reserpine crystallized，sigma)，抗akt、pakt、creb、pcreb、mtor、trkb和bdnf抗体购自美国cell signalingtechnology公司，抗β-actin抗体和hrp抗体购自sigma。
[0159]
实验动物：雄性spf级icr小鼠，体重21-23g，单笼饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心屏障环境，保持12h昼夜节律，室内温度控制在22
±
1℃，给予充足的水和饲料，自由饮水摄食。所有动物实验均遵照吉林大学动物伦理委员会的相关规定进行。
[0160]
主要实验仪器：蛋白电泳仪(jy600c/jy-spct，君意公司)、蛋白印迹电转移仪(tjy-zy5，君意公司)
[0161]
分组与给药：实验分组和给药方法同实施例6相同。
[0162]
一、免疫印迹实验
[0163]
样本的收集和制备同实施例6相同。
[0164]
western blot法检测akt、pakt、creb、pcreb、和trkb蛋白的表达水平：
[0165]
方法同实施例6相同。
[0166]
人参皂苷re 30mg/kg反复给药7天上调了利血平诱导抑郁模型小鼠的海马中t-trkb总蛋白(t-trkb)表达水平如表15所示。
[0167]
表15在k252a抑制剂同时给药情况下，人参皂苷re给药7天对利血平诱导小鼠海马中t-trkb表达水平的影响
[0168]
实验分组剂量(mg/kg)t-trkb/β-actin比值空白对照组-1.39
±
0.1利血平模型组-0.78
±
0.1**利血平 人参皂苷re组301.29
±
0.1#利血平 人参皂苷re k252a组300.81
±
0.1&利血平 k252a组-0.81
±
0.1**
[0169]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20。
[0170]
表16人参皂苷re给药7天对利血平诱导小鼠海马中creb表达水平的影响。
[0171][0172][0173]
表17人参皂苷re给药7天对利血平诱导小鼠海马中akt表达水平的影响
[0174]
实验分组剂量(mg/kg)pakt/akt比值
空白对照组-1.32
±
0.06利血平模型组-0.80
±
0.03**利血平 人参皂苷re组301.19
±
0.09#利血平 人参皂苷re k252a组300.39
±
0.08&&&&利血平 k252a组-0.47
±
0.1****
[0175]
注：数据用平均值士标准误(mean se)表示，n＝10-20，与空白对照组比较， ****p《0.0001，**p《0.01，*p《0.05，利血平模型组比较，#p《0.05，与人参皂苷治疗组相比较，####p《0.0001，&p《0.05。
[0176]
实施例7表明人参皂苷中剂量(30mg/kg)组反复给药7天上调了利血平诱导抑郁模型小鼠的海马中trkb、akt、creb蛋白表达水平，而抑制剂k252a 降低了这些蛋白的表达水平，说明人参皂苷的抗抑郁作用和trkb信号通路激活相关。
[0177]
人参皂苷re中剂量组在对小鼠连续给药7天或14天均可显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间，表现出一定的抗抑郁作用，且在同时给药trkb抑制剂k252a的情况下，阻断人参皂苷re的抗抑郁作用，说明人参皂苷re的抗抑郁作用机制是由于激活了trkb信号通路。
[0178]
本发明的实施例从人参皂苷re的给药剂量和给药时间两个方面说明其对利血平诱导的抑郁样行为的作用，由试验结果可知中等剂量的人参皂苷re 30mg/kg (i.g)能够逆转由利血平导致的眼睑下垂，在强迫游泳和悬尾实验中降低由利血平延长的不动时间，是通过激活trkb(bdnf高亲和力受体)通路引起的，并能够改善小鼠的学习记忆能力。在给予trkb抑制剂k252a七天后，人参皂苷对抑郁的治疗作用下降，进一步证明了人参皂苷对抑郁的作用通过激活trkb通路产生。
[0179]
本发明的含有人参皂苷re的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂中的一种，在临床上治疗抑郁症具有重要意义。
[0180]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0181]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。