用于染色和样品处理的方法及组合物与流程

用于染色和样品处理的方法及组合物
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年10月11日提交的美国临时申请62/914,117的权益，通过引用将其并入本文，如同在此完整阐述一样。


背景技术：

2.血细胞分析是用于提供患者健康状况概览的最常进行的医学测试之一。可以从患者体内抽取血样并储存在含有抗凝剂的试管中以防止凝血。全血样本通常包括三大类血细胞，包括红细胞(红血球(erythrocytes))、白细胞(白血球(leukocytes))和血小板(凝血细胞(thrombocytes))。每个类可以进一步分为成员的亚类。例如，白细胞(wbc)的五种主要类型或亚类具有不同的形状和功能。白细胞可包括嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。红细胞类型也有亚类。样品中粒子的外观可能会因病理状况、细胞成熟度和其他原因而有所不同。红细胞亚类可包括网织红细胞和有核红细胞。
3.估计rbcs、wbcs或血小板浓度的血细胞计数可以手动或使用自动分析仪进行。当手动完成血细胞计数时，将一滴血作为薄涂片涂在显微镜载玻片上。传统上，手动检查显微镜载玻片上干燥的染色血液涂片已被用于确定五种白细胞的数量或相对数量。组织学染料和染色剂已用于染色细胞或细胞结构。例如，赖特染色剂(wright's stain)是一种组织学染色剂，已用于对血液涂片进行染色，以便在光学显微镜下进行检查。对样品进行染色涉及以正确顺序使用多种溶液和步骤，以确保正确应用染色剂并适当保留细胞结构。可以在第一步中将固定剂应用于样品以防止样品降解并保持细胞结构。之后，可在第二步中将透化剂应用于样品以溶解细胞膜，以使染色剂进入细胞。可在第三步中将染色剂应用于样品以染色适当的结构。样品可以进一步冲洗以进行观察，或者可以采取额外的步骤来应用额外的染色剂、复染剂或其他步骤来执行其他操作。
4.重要的是在适当的时间内以适当的顺序执行这些步骤。如果样品在固定之前被透化，则样品中的细胞结构会在固定之前降解，并且任何辨别原始细胞形态的能力都会丧失。此外，染色不能在透化步骤之前进行，否则染色剂将无法正确渗透细胞并染色细胞内的结构。此外，如果任何步骤(例如固定、透化和染色)进行得太快，则细胞的形态可能会丢失和/或细胞及其内部结构可能无法正确染色。当前的染色技术需要多个步骤和大量时间。
5.自动化分析仪正变得越来越普遍。具有流通池的自动诊断系统的一些方面在美国专利：6,825,926；6,184,978；6,424,415；和6,590,646中公开，其通过引用并入本文，如同在此完整阐述一样。
6.上述各种自动化系统依赖于样品的快速分析。染色过程步骤的数量和持续时间可能是自动粒子分析系统的速度和功效的限制因素。如果染色过程缩短，自动粒子分析系统会更有效，如果染色过程在一个步骤中进行，则效率会更高。此外，如果样本的总大小保持在最低限度，则自动粒子分析系统会更有效。
7.对于许多细胞类型，包括未成熟的粒细胞，有时难以获得均匀的染色。此外，使用颜色特征可能难以区分，例如单核细胞和淋巴细胞。因此，需要解决上述问题的染色剂或染
色剂组合。


技术实现要素：

8.本公开涉及一种改进的粒子造影剂组合物，用于在样品例如血液样品和/或体液样品中快速产生视觉区别。粒子造影剂组合物在自动流式细胞术系统中特别有用。
9.在第一方面，本发明涉及一种用于对粒子进行染色的粒子造影剂组合物，该粒子造影剂组合物包含：碱性品红；亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；一种或多种透化剂；和一种或多种固定剂。此类组合物适用于在自动粒子分析系统中对血液样品或体液样品进行成像。
10.在第二方面，本公开涉及一种对血液样品或体液样品的粒子进行处理的方法，包括：将血液样品或体液样品与粒子造影剂组合物混合，获得样品混合物；以及将样品混合物在约37℃和约60℃之间的温度下温培少于90秒，该粒子造影剂组合物包含：碱性品红；亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；一种或多种透化剂；和一种或多种固定剂。该方法可以在自动粒子分析系统中进行。
11.在第三方面，本公开涉及包含粒子造影剂组合物的试剂盒，所述粒子造影剂组合物包含：都在一个合适的容器中的碱性品红；亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；一种或多种透化剂；和一种或多种固定剂。
12.在第四方面，本公开涉及试剂盒，其包含在单独的容器中的以下组分：在第一容器中的碱性品红；在第二容器中的亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；在第三容器中的一种或多种透化剂；在第四容器中的一种或多种固定剂。
13.在第五方面，本公开涉及试剂盒，其包含：在第一容器中的碱性品红，亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲基中的至少一种，和一种或多种透化剂；以及在第二容器中的一种或多种固定剂。
14.在第六方面，本公开涉及试剂盒，其包含：在第一容器中的碱性品红和亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲基中的至少一种；在第二容器中的一种或多种透化剂；在第三容器中的一种或多种固定剂。
15.在第七方面，本公开涉及试剂盒，其包含：在第一容器中的碱性品红，以及亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲基中的至少一种；在第二容器中的一种或多种透化剂和一种或多种固定剂。
附图说明
16.附图通过实施例而非限制的方式总体地示出了本文讨论的各种实施方式。
17.图1为根据本公开的粒子造影剂组合物的制备示意图。
18.图2是根据本公开的一步染色过程的流程图。
19.图3-8是分别用根据本公开的造影剂组合物染色的未成熟粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的照片。
20.图9-14是分别用造影剂组合物e43染色的未成熟粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的照片。所谓的e43造影剂组合物一般描述于美国专利9,279,750中，该专利通过引用并入，如同在本文中完整阐述一样。
21.图15是用根据本公开的造影剂组合物染色的巨型血小板的照片。
22.图16是用根据本公开的造影剂组合物染色的血小板团块的照片。
具体实施方式
23.现在将详细参考所公开主题的某些实施方式，其示例部分地在附图中示出。尽管将结合所列举的权利要求来描述所公开的主题，但是应当理解，所示例的主题并不旨在将权利要求限制于所公开的主题。
24.本公开涉及一种改进的粒子造影剂组合物，用于在样品例如血液样品和/或体液样品中快速产生视觉区别。体液样品的例子包括浆液(例如，胸膜液、心包液、腹膜液和灌洗液)、羊水、脑脊液、精液、滑液、骨髓抽吸液、积液和渗出液。粒子造影剂组合物尤其适用于自动流式细胞仪系统，例如在美国专利9,279,750中描述的系统，该专利以引用的方式并入，如同在本文中完整阐述一样。粒子造影剂组合物由粒子造影剂、透化剂和固定剂的组合构成。在一个实施例中，粒子造影剂组合物是一种组合物，其包含：碱性品红；亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；一种或多种透化剂；和一种或多种固定剂。
25.本文所述的粒子造影剂组合物，包括例如染色剂/染料组合物，和/或它们的组合，该粒子造影剂组合物可用于实行自动化的、基于图像的样品分析，例如血液分析。包括血小板、网织红细胞、未成熟粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞中的至少一种的细胞能够以相对于其他染色剂更高的速率吸收本文所述的粒子造影剂组合物。此外，本文所述的粒子造影剂组合物可以更均匀地分布在一个或多个这样的细胞中。
26.本文公开的组合物和方法可以与手动染色一起使用，并且可以用于许多不同类型的粒子分析系统，包括血液学成像系统。例如，本文所述的组合物和方法可用于基于图像的样品分析，例如流动池分析。这种流动池分析的一个例子可以包括传统的、已知的流式细胞术方法。
27.图1是根据一个实施方式的粒子造影剂组合物的制备示意图。在方框108，将粒子造影剂102、透化剂104和固定剂106混合以产生粒子造影剂组合物110。在一个实施方式中，粒子造影剂102、透化剂104和固定剂106被同时混合。在其他实施方式中，将粒子造影剂102、透化剂104和固定剂106中的一种与粒子造影剂102、透化剂104和固定剂106中的另一种混合，然后将其与粒子造影剂102、透化剂104和固定剂106中的最后一种混合，上述可以任何顺序进行。可以以任何顺序和以任何合适的方式来实行框108处的混合。
28.可选地，透化剂104和固定剂106中的一种不包括在粒子造影剂组合物110中。在各种情况下，可以在框108将其他组分混入作为粒子造影剂组合物110的一部分，如所述下面更详细地介绍。
29.本文所述的粒子造影剂组合物110可以作为试剂盒的一部分提供。粒子造影剂组合物110可以已经制备或者作为必须混入的一种或多种组分来提供。
30.粒子造影剂102可以是能够产生可见区别的任何造影剂，特别是在包括未成熟粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞中的至少一种的细胞中。本文所述的粒子造影剂组合物110包含碱性品红与至少一种附加的粒子造影剂102的组合，附加的粒子造影剂102包括，例如，阿新蓝(alcian blue)和阿新蓝86(pas中性和酸性黏液物质)；茜素红s；诱惑红ac(偶氮染料红色染料#40)；安乃近蓝(analine blue)(用草酸强化的纤毛)；金胺o；天蓝色
b；天蓝色c；俾斯麦棕；亮蓝fcf(考马斯蓝)；亮甲酚蓝；亮绿；carmium(由胭脂红酸和钾明矾组成的红色核染料)；刚果红；氯唑黑e(细胞核黑色、细胞灰色、糖原粉红色)；醋酸甲酚紫；达罗红；伊红偏蓝；赤藓红b(红色染料#3)；乙基曙红；坚牢绿fcf(绿色染料#3)；fuchin basic
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(细胞核和鞭毛)；荧光素-(汞色素)；吉姆萨染色-外周血涂片；哈里斯苏木精回归核染色；靛蓝胭脂红(蓝色染料#2)；詹纳斯绿b(线粒体)；哲纳尔氏染色素
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(外周血涂片)；浅绿色sf淡黄色；麦克尼尔(mac neal)
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(四色血迹)；孔雀绿；甲基橙；马蒂乌斯黄色；梅耶氏苏木素进行性核染色；甲基紫2b；甲胺银-过碘酸(methenamine silver-peroidic acid)；亚甲基紫；迈格林华-血液学染色；mtt
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甲臜染色(formazan stain)；粘蛋白胭脂红
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原发性肿瘤染色剂；中性红；尼格罗辛；尼罗河蓝a；核固红c.i.60760；萘系as(napthal as)；耐硝基蓝四氮唑鎓甲臜染料(nitro-blue tetrazolium-fast formazan dye)；橙色g；橙色ii；紫罗兰；巴氏染色(papanicolaou stain)eas
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明亮的细胞质染色；副玫瑰苯胺；副玫瑰红素；过碘酸席夫-(pas，特定碳水化合物染色)；苯丙胺b；蛋白银s(protargol s)；派罗宁b；派罗宁y；刃天青；罗曼诺夫斯基-吉姆萨；孟加拉玫瑰红；番红o；苏丹黑b；苏丹iii
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(用α-萘酚染色骨髓粒子)；苏丹iv
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染色甘油三酯；酒石黄
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(偶氮染料黄#5)；硫堇-染色间质染色质；三苯基四唑；ttc
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甲臜红染料(formazan red dye)；和甲苯胺蓝o。
31.如本文进一步详细描述的，粒子造影剂组合物110的一个示例是包含粒子造影剂102的粒子造影剂组合物110，该粒子造影剂102包含碱性品红，以及亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种。在一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红，以及结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种。在另一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红以及唯一的结晶紫。在又一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红以及唯一的新亚甲蓝。在又一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红、结晶紫和新亚甲蓝。粒子造影剂102以有效染色活细胞和/或基本完整细胞以用于基于图像的分类和亚分类的量添加。粒子造影剂102可以是上述粒子造影剂中的两种或更多种的任意组合。
32.在一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红，其存在量在染色条件下足以达到约1μm至约500μm(例如，约50μm至约200μm、约100μm至约200μm、约110μm至约190μm或约110μm至约180μm)。如本文所用，术语“在染色条件下”是指当组分与样品混合时。碱性品红可纯化到至少90％的纯度。碱性品红可纯化到至少80％、85％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％纯度。碱性品红可纯化到至少99％的纯度。
33.粒子造影剂102可包含结晶紫。结晶紫可以满足如下条件的量存在：其量在染色条件下足以达到约1μm至约100μm(例如，约1μm至约50μm、约5μm至约25μm、约10μm至约50μm或约15μm至约30μm)。如本文所用，术语“在染色条件下”是指当组分与样品混合时。结晶紫可以纯化到至少90％的纯度。结晶紫可纯化到至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％纯度。结晶紫可以纯化到至少99％的纯度。粒子造影剂202可以是单独的结晶紫，或者可以是与一种或多种其他粒子造影剂组合的结晶紫。
34.粒子造影剂102可包含新亚甲蓝。新亚甲蓝可以满足如下条件的量存在：其量在染色条件下足以达到约70μm至约2.4mm(例如，约100μm至约500μm、约100μm至约1.5mm、约500μm至约1.5μm或约750μm至约1.5μm)。新亚甲蓝可以满足如下条件的量存在：其量在染色条件下足以达到约500μm至约950μm。新亚甲蓝可以纯化到至少70％的纯度。新亚甲蓝可纯化到至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯度。新亚甲蓝可以纯化到至少100％的纯度。
35.在一个例子中，粒子造影剂102包含碱性品红以及结晶紫和新亚甲蓝。
36.在另一个例子中，粒子造影剂102是结晶紫、新亚甲蓝和碱性品红的组合，每种具有如本文所述的浓度和纯度的任意组合。粒子造影剂102可具体包括以在染色条件下足以达到约15μm至约30μm的量存在的结晶紫、以在染色条件下足以达到约750μm至约1.5mm的量存在的新亚甲蓝和以在染色条件下足以达到约100μm至约200μm的量存在的碱性品红。
37.透化剂104可包含表面活性剂。透化剂104可包含皂苷等其他成分。替代地，或除了皂苷之外，透化剂104可包含季铵盐、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂中的至少一种。透化剂可以改变细胞的渗透性以增加粒子造影剂102对细胞内内容物的可及性。可以选择透化剂并以足以允许一步染色程序的量包含该透化剂。
38.非离子表面活性剂的例子可以包括(1)聚氧乙烯烷基或芳基醚(聚乙氧基化物)，包括醚化到聚乙二醇或聚氧乙烯乙醇的直链脂肪族疏水物，例如brij
tm
35；(2)醚化成聚乙二醇的支链脂肪族/芳香族(例如辛基苯酚)疏水物，例如triton x
tm-100；(3)醚化为聚乙二醇的直链脂肪族/芳香族(例如，正壬基苯酚)疏水物，例如，igepal
tm
c0897；和(4)酯化为聚乙二醇的直链脂肪族(例如羧酸)疏水物，例如myrj
tm
53等。非离子聚氧乙烯烷基或芳基醚(聚乙氧基化物)表面活性剂的例子可包括聚氧乙烯(4)月桂基醚(brij
tm 30)；聚氧乙烯(23)月桂基醚(brij
tm
35)；聚氧乙烯(2)十六烷基醚(brij
tm
52)；聚氧乙烯(20)十六烷基醚(brij
tm
58)；聚氧乙烯(2)硬脂醚(brij
tm
72)；聚氧乙烯(10)硬脂醚(brij
tm
76)；聚氧乙烯(20)硬脂醚(brij
tm
78)；聚氧乙烯(2)油基醚(brij
tm
92)；聚氧乙烯(10)油基醚(brij
tm
96)；聚氧乙烯(20)油基醚(brij
tm
98)；聚氧乙烯(21)硬脂醚(brij
tm
721)；聚氧乙烯(100)硬脂醚(brij
tm
700)等。非离子表面活性剂的其他例子可包括triton x
tm-100(非还原或还原)、triton
tm
x-114非还原或还原)、triton x
tm-165和triton x
tm-305(非还原和还原)等。
39.两性离子表面活性剂的实施例可以包括tdaps(十四烷基二甲基铵丙磺酸盐)、chapso(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐)、具有约12至约16个碳原子的烷基n，n-二甲基n-氧化物、月桂基二甲胺n-氧化物(lo)、ddaps(n-十二烷基-n,n-二甲基-3-氨-1-丙磺酸盐)等。
[0040]
透化剂104可包含足以溶解红细胞的试剂。透化剂104可包含足以溶解除网织红细胞或有核红细胞之外的红细胞的试剂。透化剂204可包括足以溶解红细胞、同时白细胞、网织红细胞、有核红细胞、血小板和其他细胞基本上保持完整的试剂。透化剂104可以使白细胞、网织红细胞、有核红细胞和/或血小板的成员和/或核膜更具渗透性和/或多孔性，以促进粒子造影剂102接近。例如，选择透化剂104以能够快速产生允许粒子造影剂102进入样品中的细胞所必需的孔或开口。
[0041]
通过使用包含透化剂104(包括可从clinical diagnostics solutions,inc.,plantation,fl获得的iris lyse和cds lytic)的粒子造影剂组合物110可实现有效结果。
[0042]
通过使用包含透化剂104的粒子造影剂组合物110可实现有效结果，该透化剂104包含以满足如下的量存在的皂苷：其量在染色条件下足以达到约10mg/l至约1000mg/l的浓度。皂苷可以满足如下的量存在：其量足以达到约50mg/l至约750mg/l的浓度。皂苷可以是季铵取代的皂苷醚。
[0043]
进一步地，可以选择固定剂106以确保白细胞在染色和成像期间不降解。固定剂106可以确保其他细胞和细胞结构不会降解。固定剂的例子可包括戊二醛；甲醛；交联剂；等渗盐水中的苦味酸氨(例如，用于亚甲蓝染色)；乙醇；甲醇(例如，在室温下，-20℃或-70℃)；海登海因-苏萨液(heidenhain's susa)—hgcl2、nacl三氯乙酸、福尔马林；包因氏液(bouin's)-苦味酸、福尔马林、乙酸；含有80％乙醇的duboseq-brazil-bouins；卡诺氏液(carnoy's)-乙醇、氯仿、乙酸；岑克尔氏液(zenker's)-—hgc12,k2cro7,naso4h2o；乙酰胭脂红；盖茨比液(gatensby's)-铬酸、四氧化锇、nacl；贝克液(baker's)-福尔马林、cacl2；史密斯液(smith's)-k2cr2o7、福尔马林、乙酸；1％甲基绿、1％醋酸；苯酚、福尔马林、甘油、龙胆紫；绍丁氏液(schaudin)-hgcl2、乙醇、乙酸；尚比液(champy's)-铬酸、k2cro7、oso4；弗莱明液(fleming's)-铬酸、oso4、乙酸；甲醛(formol)-银-甲醛、agno3；斯特雷克(streck's)组织固定剂
‑‑
溴硝醇、重氮烷基脲、znso47h2o、柠檬酸钠；pbs中1％咪唑烷基脲；乙二醛：glyofix、prefer、safefix、histochoice；glydant
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乙内酰脲；二羟甲基脲；羟甲基甘氨酸钠；卡诺夫斯基液(kamovsky's)；氯化汞(b-5)；奥朗德液(hollande's)；以及其他。此外，合适的固定剂可以单独或组合包括以下任何一种。
[0044]
固定剂106可以是氧化剂、汞、苦味酸盐、hepes-谷氨酸缓冲剂介导的有机溶剂保护作用(hope)固定剂，或水溶性防腐剂。氧化剂的例子包括重铬酸钾、铬酸、高锰酸钾等。汞的例子包括b-5、泽克固定剂(zernker's fixative)等。水溶性防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、二羟甲基脲、2-吡啶硫醇-1-氧化物、山梨酸、山梨酸钾等。
[0045]
在粒子造影剂组合物110的一些实施方式中，使用包含戊二醛和甲醛中的至少一种的固定剂106可以获得有效的结果。例如，通过使用包含按重量计0.1％或低于0.1％的戊二醛的固定剂106可以获得有效的结果。
[0046]
任选的其他组分112可以在方框108任选地混入到粒子造影剂组合物110中。其他组分112的例子可包括缓冲剂组分(例如，乙酸钠、硼酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、碳酸钠、酒石酸钠)、粘度调节剂、抗微生物剂、渗透压调节剂、离子强度调节剂、表面活性剂、螯合剂等。当粒子造影剂组合物110包含磷酸盐缓冲盐水时，可以获得有效的结果。缓冲剂组分可用于将粒子造影剂组合物110缓冲至约5至约7的ph。此外，造影剂组合物110可具有至少约230mosm的渗透压，例如约280mosm至约325mosm、约285mosm至约305mosm或约240mosm至约270mosm的渗透压。
[0047]
粘度调节剂的例子包括天然水胶体(和衍生物)，例如角叉菜胶、刺槐豆胶、瓜尔胶和明胶；糖(及其衍生物)，例如葡萄糖、果糖；聚葡萄糖；葡聚糖；聚葡聚糖；糖类；和多糖；半合成水胶体(及其衍生物)，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素；合成水胶体(及其衍生物)，例如carbopol
tm
；粘土(及其衍生物)，例如膨润土和veegum
tm
。
[0048]
图2是一步染色过程200的流程图。虽然一步染色过程200可以包含几个子步骤，但术语“一步”用于确定在染色过程中不需要将样品引入多个不同的溶液。粒子造影剂组合物110在框102制备，如本文参考图1所述。任选地，可以在框206纯化诸如任何粒子造影剂102的组分。纯化粒子造影剂102可以降低在与样品接触时形成的沉淀物的水平，从而降低背景并改善基于图像的血液样品分析结果，减少对图像或载玻片或手动制备显微镜的进一步查看的需要。
[0049]
在框208处，将粒子造影剂组合物110与样品组合。粒子造影剂组合物110可以任何
合适的方式与样品组合，包括混合在一起。在框208的组合可以包括用一定量的粒子造影剂组合物110稀释样品。样品可以用粒子造影剂组合物110稀释。可以选择稀释量以在基于图像的分析期间提供每帧最佳细胞数。可以选择稀释量以在基于图像的分析期间提供每帧的最佳白细胞数量。可以另外选择稀释量，以为任何其他非基于图像的分析提供最佳体积。
[0050]
使用粒子造影剂组合物110与样品的比率在约2:1至约20:1之间可以获得有效结果。粒子造影剂组合物110与样品的比率可以在约3:1至约10:1之间。粒子造影剂组合物110与样品的比率可以在约3:1至约4:1之间。粒子造影剂组合物110与样品的比率可以在约3:1或约4:1之间。使用非常接近3:1或非常接近4:1的粒子造影剂组合物110与样品的比率可以获得有效结果。
[0051]
在一些情况下，样品可以在升高的温度(例如在下文中参考温培描述的任何温度)下与粒子造影剂组合物110组合。
[0052]
如本文所用，组合的样品和粒子造影剂组合物110被称为样品混合物。
[0053]
在框210，样品混合物在特定温度下温培特定时间量。温培可以增加细胞或其内部结构的渗透性，允许粒子造影剂102更好地渗入细胞或细胞结构。可以选择温培的时间和温度以使粒子造影剂组合物110能够适当地渗透、固定和染色样品。可以选择温培时间和温度以确保红细胞溶解，同时保持白细胞、血小板和有核红细胞基本完整。因此，例如，样品混合物可以在约37℃和约60℃之间的温度下温培约1至60秒。可将样品混合物加热至约46℃至约49℃之间的温度。可将样品混合物温培40至50秒。样品混合物还可以温培至多一小时。通过将样品混合物在约48℃下温培约45秒可获得有效结果。通过将样品混合物在约47℃下温培约45秒可获得有效结果。
[0054]
在框208的组合和在框210的温培以与成像设备中处理样品混合物以及冲洗和/或清洁成像设备管线所花费的时间大致相同或比其更少的时间完成。以这种方式，第一样品混合物可以在第二样品混合物被组合和温培的同时成像。一旦第一样品混合物已经成像并且成像设备已经清洁，第二样品混合物就可以立即成像。
[0055]
可选地，框208处的组合和框210处的温培在小于在成像设备中处理样品混合物以及冲洗和/或清洁成像设备的管线所花费的时间的两倍的时间内完成。这样，在对第一样品混合物进行成像的同时，可以准备对第二样品混合物进行成像，并且可以将第三样品混合物和第四样品混合物进行合并和温培。一旦第一样品混合物已经成像并且成像设备已经清洁，第二样品混合物就可以立即成像。第三样品混合物可以完成其混合和温培，第四样品混合物仍然可以混合和温培。一旦第二样品混合物成像并清洁了成像设备，就可以立即对第三样品混合物进行成像，而第四样品混合物开始完成混合和温培，第五样品混合物开始混合和温培。该过程可以无限期地继续以连续地对样品混合物进行成像。
[0056]
粒子造影剂组合物110和染色程序可有效染色嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、网织红细胞、有核红细胞、原始细胞、早幼粒细胞、髓细胞、间髓细胞、管型、细菌、上皮细胞和/或寄生虫。另外或替代地，本文所述的粒子造影剂组合物110和染色程序可有效地染色上皮细胞、巨噬细胞、浆细胞、恶性细胞和晶体以及在血液和细菌中发现的细胞。某些有效的粒子造影剂组合物110和染色程序有效地产生用于粒子分类和亚分类的视觉区别，例如，通过提供细胞中初级粒子和次级粒子的差异染色，根据初级粒子和次级粒子的差异染色或增强来帮助未成熟粒细胞的亚分类和确定它
们的年龄。
[0057]
本公开还涉及使用本文所述的粒子造影剂组合物110的方法。粒子造影剂组合物110适用于在自动粒子分析系统中对血液样品或体液样品进行成像。所述方法包括，例如，处理血液样品或体液样品的粒子的方法，包括：将血液样品或体液样品与粒子造影剂组合物110混合，获得样品混合物；将样品混合物在约37℃和约60℃之间的温度下温培少于90秒。透化剂可包含皂苷，该皂苷以在染色条件下足以达到约50mg/l至约750mg/l的浓度的量存在。替代地或另外地，固定剂可包含戊二醛，该戊二醛以在染色条件下足以达到0.1％或低于0.1％的浓度的量存在。替代地或另外地，碱性品红可以以在染色条件下足以达到约100μm至约200μm的浓度的量存在。替代地或另外地，结晶紫以在染色条件下足以达到约15μm至约30μm的量存在。替代地或另外地，新亚甲蓝以在染色条件下足以达到约750μm至约1.5mm的量存在。替代地或另外地，温培样品混合物包括将样品混合物加热至约40℃至约50℃持续约30秒至约60秒。替代地或另外地，将血液样品或体液样品与粒子造影剂组合物混合包括将血液样品或体液样品与粒子造影剂组合物以约1:3至约1:6(例如，约1:3至约1:5)的比率混合；以及温培样品混合物包括将样品混合物加热至约40℃和约50℃持续约30秒至约60秒。替代地或另外地，本文所述的方法可在自动粒子分析系统中进行。
[0058]
本公开还涉及试剂盒。可以方便地组装试剂盒以与本文所述的粒子造影剂组合物110一起使用。该试剂盒可以包含用于本文所述的粒子造影剂组合物110的每种组分的至少一个容器，或者它可以包含含有本文所述的粒子造影剂组合物110的所有组分的单个容器。此外，试剂盒可包括本文所述的粒子造影剂组合物110的标准试剂和/或预先测量的组分。该试剂盒还可以包括缓冲液。最后，试剂盒还可以包括关于如何使用试剂盒的说明和/或各种细胞类型通常可以预期的染色模式的例子。在一个例子中，试剂盒包含在合适容器中的本文所述的粒子造影剂组合物110。在另一个例子中，试剂盒可以以单独的容器方式包含：在第一容器中的碱性品红；在第二容器中的亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝的至少一种；在第三容器中的一种或多种透化剂；以及在第四容器中的一种或多种固定剂。在另一个例子中，试剂盒可包含：在第一容器中的碱性品红，亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种，以及一种或多种透化剂；在第二容器中的一种或多种固定剂。在又一个例子中，试剂盒可以包含；在第一容器中的碱性品红，和亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；在第二容器中的一种或多种透化剂；在第三容器中的一种或多种固定剂。在又一个例子中，试剂盒可以包含：在第一容器中的碱性品红，和亮甲酚蓝、天蓝色b、结晶紫和新亚甲蓝中的至少一种；在第二容器中的一种或多种透化剂和一种或多种固定剂。
[0059]
在附图中描绘或在本文中描述的组分的不同布置，以及未示出或未描述的组分和步骤是可能的。类似地，一些特征和子组合是有用的并且可以在不参考其他特征和子组合的情况下使用。
[0060]
本公开的目的是说明性的而不是限制性的，替代实施方式对于本专利的读者将变得显而易见。在某些情况下，可以以不同的顺序进行或实行方法步骤或操作，或者可以添加、删除或修改操作。可以理解，在本发明的某些方面，单个组分可以由多个组分代替，多个组分可以由单个组分代替，以提供元素或结构或执行给定的功能。除非这种替代对实施本发明的某些实施方式不起作用，否则这种替代被认为在本发明的范围内。因此，本公开不限于这里描述的或附图中描绘的实施方式，并且可以在不背离所附权利要求的范围的情况下
进行各种实施方式和修改。
[0061]
以范围形式表示的值应以灵活的方式解释，以不仅包括明确列举为范围限制的数值，而且包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，就如每个数值和子范围都被明确地列举出来一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且还包括在所述范围内的各个值(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另有说明，否则“约x至y”的陈述与“约x至约y”具有相同的含义。同样地，除非另有说明，否则“约x、y或约z”的陈述与“约x、约y或约z”具有相同的含义。
[0062]
在本文中，除非上下文另有明确规定，否则术语“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”用于包括一个或多个。除非另有说明，否则术语“或”用于指代非排他性的“或”。此外，应当理解，这里使用的措辞或术语，没有另外定义，仅用于描述的目的而不是限制的目的。任何章节标题的使用旨在帮助阅读文档，不应被解释为限制性的。此外，与章节标题相关的信息可能出现在该特定章节之内或之外。此外，本文件中提及的所有出版物、专利和专利文件通过引用整体并入本文，就好像单独通过引用并入一样。
[0063]
在本文所述的方法中，可以以任何顺序执行这些步骤而不背离本发明的原理，除非明确列举了时间顺序或操作顺序。此外，指定的步骤可以同时执行，除非明确的声明语言指出它们是分开执行的。例如，要求保护的进行x的步骤和要求保护的进行y的步骤可以在单个操作中同时进行，由此产生的过程将落入要求保护的过程的字面范围内。
[0064]
本文所用的术语“约”可以允许值或范围的可变度，例如，在规定值或规定范围限值的10％以内、5％以内或1％以内。实施例
[0065]
本发明可以通过参考以说明方式提供的以下实施例来更好地理解。本发明不限于本文给出的实施例。实施例1
[0066]
测试和改变了许多染色组合物和方法以获得本文公开的实施方式。
[0067]
将体液样品与表1中所示的造影剂组合物混合并在47.5℃温培40秒。表格1
ꢀꢀ
最终浓度nmb 750μm-1.5mmcv 15μm-30μm碱性品红 100μm-200μm
[0068]
戊二醛的浓度可以是≤约0.1％(按体积计)。此外，缓冲剂组分可以包含例如约40mm至约70mm的乙酸钠。此外，透化剂用于制备造影剂，例如iris lyse。去离子水可用于溶解或稀释造影剂的一种或多种组分。透化剂可用于溶解nmb和cv中的至少一种以制备造影剂。
[0069]
表1中，nmb是指新亚甲蓝；cv是指结晶紫。
[0070]
然后将淬灭剂应用于体液样品混合物。图3-8显示了体液样品中的未成熟粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞如何分别用表2中所示的造影剂组合物染色。图9-14是未成熟粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性
粒细胞和嗜碱性粒细胞分别用造影剂组合物e43染色。所谓的e43造影剂组合物一般描述于美国专利9,279,750中，该专利以引用的方式并入本文，如同在本文中完整阐述一样。
[0071]
染色结果是显著的，因为表2中所示的造影剂组合物提供更深和更均匀的染色，具有更大的分辨率。例如，未成熟的粒细胞染色更好，染色更均匀。此外，嗜酸性粒细胞颗粒染色较深，颜色识别能力提高。最后，单核细胞和淋巴细胞染色更好，易于区分。