一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物及应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物及应用。


背景技术：

2.蒽环类抗肿瘤药物，如阿霉素、柔红霉素、表柔比星等，广泛应用于多种血液系统肿瘤以及实体瘤的治疗中，在目前多种肿瘤治疗指南中有着不可取代的地位，然而蒽环类药物也有着无法避免的严重不良反应，其所导致的心脏毒性损伤对患者的远期预后有着严重的影响。多数患者在蒽环类药物给药后可以较快的发生心肌损伤，并且随着事件的延长而愈加明显。有超过50％的患者在给药数年后可能发生左心室功能的亚临床超声检查变化，包括收缩功能下降、后负荷增加。蒽环类药物对于心肌的毒性损伤主要机制尚未完全明确，已知的途径包括通过酶和非酶介导的途径产生氧自由基诱导心肌细胞凋亡、通过抑制拓扑异构酶iiβ导致dna双键断裂导致心肌细胞死亡。目前临床上针对蒽环类抗肿瘤药物产生的心脏损伤多采用右雷佐生治疗，其可以竞争性结合拓扑异构酶iiβ从而达到保护心肌细胞免受损伤的效果。然而右雷佐生也有一定程度的副作用，包括贫血、血小板减少等。有文献报道在儿科肿瘤的治疗中，应用右雷佐生可能会显著增加第二种恶性肿瘤的四年累积发生率。因此，需要找到一种靶向性强且保护功能明确的基因，并进行针对性地干预，才能够有效地实现蒽环类抗肿瘤药物的心脏毒性治疗。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物及应用，利用aav9病毒将能够干预环状rna circ-znf609表达的shrna递送至心肌中以降低心肌中circ-znf609的表达，从而对阿霉素诱导的心脏毒性损伤产生治疗作用。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了干扰心肌组织中环状rnacirc-znf609表达的试剂在制备预防和/或治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物中的应用。
6.优选的，所述试剂包括circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述circ-znf609 shrna的扩增引物包括上游引物f和下游引物r，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述下游引物r的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8.优选的，所述试剂包括aav病毒包装的circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.优选的，所述aav病毒包括aav9病毒。
10.本发明还提供了一种aav9病毒包装的circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.优选的，所述aav9病毒包装的circ-znf609 shrna的工作液的病毒滴度为2
×
10
13
vg/ml。
12.本发明还提供了一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物，所述药物的有效成分包括aav9病毒包装的circ-znf609 shrna和药学上可接受的辅料。
13.优选的，所述药物的剂型包括静脉注射液。
14.有益效果：本发明提供了干扰心肌组织中环状rna circ-znf609表达的试剂在制备预防和/或治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物中的应用。本发明实施例中，将aav9病毒包装的circ-znf609 shrna通过静脉注射的方式作用于小鼠个体，结果发现，在所述注射后，能够改善阿霉素诱导的心肌细胞凋亡并部分恢复心脏功能，实现阿霉素造成心脏毒性损伤的治疗目的。
附图说明
15.图1为circ-znf609的shrna效率筛选结果图，shrna2链效果最好，并被命名为circ-znf609 shrna；
16.图2为circ-znf609 shrna结构图，图中junction site表示成环位点；
17.图3为荧光定量pcr检测静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna后心肌组织中circ-znf609的表达明显下降；红色：尾静脉注射aav9包装的空载病毒同时腹腔注射生理盐水组；蓝色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射生理盐水组；绿色：尾静脉注射aav9包装的空载病毒同时腹腔注射阿霉素组；紫色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射阿霉素组；尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna能够显著降低心脏组织中circ-znf609的表达；
18.图4为超声心动图检测静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna改善阿霉素诱导的心脏收缩功能不全；红色：尾静脉注射aav9包装的空载病毒同时腹腔注射生理盐水组；蓝色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射生理盐水组；绿色：尾静脉注射aav9包装的空载病毒同时腹腔注射阿霉素组；紫色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射阿霉素组；尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna能够显著改善阿霉素诱导的心脏射血分数的下降；图中ejection fraction，射血分数；fractional shortening，短轴缩短率；
19.图5为tunel染色检测静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna改善了阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；蓝色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射生理盐水组；绿色：尾静脉注射aav9包装的空载病毒同时腹腔注射阿霉素组；紫色：尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna同时腹腔注射阿霉素组；腹腔注射阿霉素的小鼠心肌细胞中凋亡细胞，即tunel阳性的细胞，明显增加，尾静脉注射aav9包装的circ-znf609 shrna能够显著降低凋亡心肌细胞的数量。
具体实施方式
20.本发明提供了干扰心肌组织中环状rna circ-znf609表达的试剂在制备预防和/或治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物中的应用。
21.本发明所述环状rna circ-znf609优选来源于人源或小鼠源，其中人源：hsa_
circ_0000615，小鼠源：mmu_circ_0001797。本发明所述干扰心肌组织中环状rna circ-znf609表达的试剂优选包括circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列优选如seq id no.1所示：agtcaagtctgaaaagcaatgctcgag cattgcttttcagacttgacttttttg，结构如图2所示。
22.本发明所述circ-znf609 shrna的获得，优选包括首先从circbase数据库中获得circznf609的序列，跨环状rna的反向剪接位点，设计sirna序列(seq id no.4):5
’‑
agtcaagtctgaaaagcaatg-3’；并在设计好所述sirna序列后，套入shrna结构模板：上游引物(seq id no.2):5
’‑
gatcagtcaagtctgaaaagcaatg ctcgagcattgcttttcagacttgact tttttg-3’；下游引物(seq id no.3):5
’‑
aatt caaaaa agtcaagtctgaaaagcaatg ctcgagcattgcttttcagacttgact-3’。本发明优选将上述上游引物和下游引物经退火之后连接到双酶切之后的peen载体(全名：penn.aav.u6.shrluc.cmv.egfp.sv40(p1867))中。本发明所述双酶切优选为利用bamhi和ecori进行双酶切。本发明所述退火的温度优选为95℃，所述退火的时间优选为4min。本发明在所述退火后优选还包括自然冷却至室温(18～25℃)。本发明所述circ-znf609 shrna的靶向序列优选如seq id no.8所示：agtcaagtctgaaaagcaatg。
23.本发明所述试剂优选包括aav病毒包装的circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述aav病毒优选包括aav9病毒。本发明对所述aav病毒包装的circ-znf609 shrna方法并没有特殊限定，优选包括将所述circ-znf609 shrna整合至aav9载体中，并在aav9衣壳质粒和helper质粒的辅助下包装成为重组aav9病毒，分离纯化后测定aav9病毒滴度。
24.本发明还提供了一种aav9病毒包装的circ-znf609 shrna，所述circ-znf609 shrna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
25.本发明所述aav9病毒包装的circ-znf609 shrna的工作液的病毒滴度优选为2
×
10
13
vg/ml。
26.本发明还提供了一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物，所述药物的有效成分包括aav9病毒包装的circ-znf609 shrna和药学上可接受的辅料。
27.本发明所述药物的剂型优选包括静脉注射液，实施例中将aav9病毒包装的circ-znf609 shrna以工作液形式，通过尾静脉注射的方式以每只小鼠注射30μl的剂量给药，结果显示，所述药物能够改善阿霉素诱导的心肌细胞凋亡并部分恢复心脏功能。
28.下面结合实施例对本发明提供的一种治疗阿霉素诱导的心脏毒性损伤的药物及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
29.实施例1
30.1、circ-znf609 shrna的构建：
31.首先从circbase数据库中获得circznf609的序列(物种人源：hsa_circ_0000615和小鼠源：mmu_circ_0001797)。跨环状rna的反向剪接位点，设计sirna序列：
32.sirna#1(seq id no.5):5
’‑
agtcaagtctgaaaagcaatgat-3’33.sirna#2(seq id no.4):5
’‑
agtcaagtctgaaaagcaatg-3’34.设计好sirna之后套入shrna结构模板：
35.对于shrna#1:
36.forward primer(seq id no.6):5
’‑
gatcagtcaagtctgaaaagcaatgat ctcgagatcattgcttttcagacttgact tttttg-3’37.reverse primer(seq id no.7):5
’‑
aatt caaaaagtcaagtctgaaaagcaatgat ctcgagatcattgcttttcagacttgact-3’38.对于shrna#2:
39.forward primer(seq id no.2):5
’‑
gatcagtcaagtctgaaaagcaatg ctcgagcattgcttttcagacttgact tttttg-3’40.reverse primer(seq id no.3):5
’‑
aatt caaaaaagtcaagtctgaaaagcaatg ctcgagcattgcttttcagacttgact-3’；
41.将得到的shrna序列退火之后连接到经bamhi和ecori双酶切之后的peen载体中。
42.shrna退火体系(50μl)：forward oligo(1μg/μl)5μl、reverse primer(1μg/μl)5μl、10x neb buffer 25μl和ddh2o 35μl；于95℃退火4min，自然冷却至室温。
43.连接体系：退火后基因50ng、peen 100ng、10xt4 buffer 2μl、t4 ligase 2μl、余量的ddh2o；于16℃孵育过夜。
44.连接成功之后转化到大肠杆菌感受态细胞中，sanger测序正确之后，提取质粒，得penn-circ-znf609 shrna#1和penn-circ-znf609 shrna#2，可进行病毒包装。两条shrna的测试结果如图1所示，penn-circ-znf609shrna#2对于circ-znf609的抑制效率低于50％且优于penn-circ-znf609shrna#1。故后续实验中，全部采用penn-circ-znf609 shrna#2进行相关研究。**，p《0.01；*，p《0.05。
45.2.aav9病毒的包装、分离和纯化
46.将293t细胞种在10cm的细胞培养皿中，密度为每皿400万个细胞。24小时后，向每个培养皿中添加1ml无血清dmem培养基，其中含有10μgpenn-circ-znf609 shrna#2、10μgaav衣壳质粒、10μg helper质粒、90μl pei max。
47.转染12小时后，替换新鲜的dmem完全培养基，48小时后收集细胞和培养物中的病毒。
48.在培养基中收集病毒：每100ml细胞上清液中添加25ml40％peg-8000，在4℃下2800g转速下离心过夜，在15℃下离心15min。向病毒颗粒中添加1ml细胞裂解缓冲液并重新悬浮。
49.细胞中的病毒收集：通过刮片法收集的细胞重新悬浮在5ml细胞裂解缓冲液中，并在-80℃冰箱和37℃水浴中反复冻融三次。
50.将培养基中的病毒悬浮液与冻融细胞悬浮液混合，添加1mol/l氯化镁至终浓度为1mmol/l，添加终浓度为250u/ml的苯甲酸酶(默克)，并在37℃下孵育45min。在4℃下以4000rpm转速离心4min后取上清液。使用碘克沙醇梯度密度离心纯化病毒。
51.病毒滴度的检测方法：将病毒载体质粒稀释至1ng/μl，经计算得知此时质粒拷贝数浓度为：1.36
×
10
11
vg/ml。将质粒两倍梯度稀释13次得到标准品1～14，以2倍稀释的standard dna dilution用来制备标准曲线。
52.取5μl上述制备的纯化病毒aav9-shrna-circznf609，使用组织genomic dna提取试剂盒按说明书指导操作提取病毒gdna，gdna最终被50μl ddh2o洗脱，随后将病毒gdna再稀释100倍后采用qpcr法检测病毒滴度。
53.qpcr反应体系(10μl)：sybr green 5μl、上游引物f和下游引物r(10μm)各0.5μl、ddh2o 2.5μl、标准dna稀释液或病毒基因组dna2μl；
54.qpcr反应用上游引物f和下游引物r的序列如下：
55.上游引物f(seq id no.9)：5
’‑
aagtacgccccctattgacg-3’；
56.下游引物r(seq id no.10)：5
’‑
cacgcccattgatgtactgc-3’。
57.qpcr反应程序如下：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火30sec，40个循环。
58.由于循环数和standard dnadilution浓度的对数成线性关系，通过线性拟合求得病毒滴度。滴度测定后的aav8病毒可直接用于动物实验或冷冻于-80℃。
59.实施例2
60.1.阿霉素诱导小鼠心脏毒性损伤模型建立
61.取8-10周龄的c57bl/6j野生型雄性小鼠，给于小鼠以5mg/kg剂量腹腔注射阿霉素对小鼠进行心脏毒性损伤诱导，每周一次，持续4周，其模型相应的对照模型，即对照组小鼠，采用腹腔注射等体积的生理盐水替代，每周一次，持续4周。最后一次给药完成继续饲养小鼠7天后处死小鼠。
62.2.aav9-sh-circ-znf609注射
63.将10
11
vg/只的剂量病毒通过尾静脉注射的方式注射至小鼠体内，1周后进行心脏毒性损伤模型的构建。其中vg表示vector genome。具体实验过程如下：
64.首先，将实验小鼠分组分为4个组，分别为对照病毒 生理盐水组，对照病毒 阿霉素组，aav9-shrna-circ-znf609 生理盐水组，aav9-shrna-circ-znf609 阿霉素组。
65.在心脏毒性损伤模型造模前1周开始，采用一次性1ml无菌注射器通过尾静脉注射的方式对小鼠进行处理，具体方法如下：
66.第1组对照病毒 生理盐水组，均按照10
11
vg/只小鼠，对小鼠尾静脉进行注射对照病毒，1周后开始进行生理盐水腹腔注射；
67.第2组对照病毒 阿霉素组，均按照10
11
vg/只小鼠，对小鼠尾静脉进行注射对照病毒，1周后开始进行阿霉素腹腔注射；
68.第3组aav9-shrna-circ-znf609 生理盐水组，均按照10
11
vg/只小鼠，对小鼠尾静脉进行注射aav9-shrna-circ-znf609，1周后开始进行生理盐水腹腔注射；
69.第4组aav9-shrna-circ-znf609 阿霉素组，均按照100μl/只小鼠，对小鼠尾静脉进行注射aav9-shrna-circ-znf609，1周后开始进行阿霉素腹腔注射。
70.完成第4次阿霉素腹腔注射的1周后，对小鼠进行心脏彩色多普勒超声检测，检测完毕后处死小鼠，解剖得到小鼠心脏，先使用荧光定量pcr验证aav9-shrna-circ-znf609是否成功在动物水平降低心脏中circ-znf609的表达，然后对心肌组织切片样本进行tunel染色，统计tunel阳性的细胞个数。
71.3.qpcr检测circ-znf609表达变化
72.在完成第4次阿霉素腹腔注射的1周后处死小鼠，解剖得到小鼠心脏，使用trizol裂解液提取心脏组织中的总rna，使用逆转录试剂盒获得cdna。采用qpcr法检测circ-znf609表达，并用2-δct
法计算分析circ-znf609的表达变化。qpcr反应体系(10μl)：sybr green 5μl、上游引物f和下游引物r(10μm)各0.5μl、ddh2o 2.5μl、cdna稀释液2μl；
73.qpcr反应用上游引物f和下游引物r的序列如下：
74.上游引物f(seq id no.11)：5
’‑
gaaggggagaatgagtgccg-3’；
75.下游引物r(seq id no.12)：5
’‑
gtcaacgtcccacctcaaggttc-3’。
76.qpcr反应程序如下：95℃预变性30sec；95℃变性15sec，60℃退火及延伸30sec，40次。
77.结果如图3所示，共有48只小鼠心脏被检测了circ-znf609的表达情况，其中9只来自于第一组，circ-znf609的相对表达量分别为0.89、0.83、1.16、0.98、1.04、1.13、0.77、1.40、1.13；其中10只来自于第二组，circ-znf609的相对表达量分别为0.83、0.87、0.73、0.73、1.14、0.65、0.82、0.76、0.74、0.52；其中15只来自于第三组，circ-znf609的相对表达量分别为1.28、0.93、1.62、3.70、3.80、1.59、1.34、1.15、1.19、1.30、3.44、3.74、1.38、1.27、1.26；其中14只来自于第四组，circ-znf609的相对表达量分别为0.59、0.75、0.86、0.64、0.95、0.50、1.85、0.57、0.84、0.91、0.74、0.77、1.05、0.72。
78.4.小鼠心脏超声检测
79.对小鼠胸部进行脱毛并擦拭干净后，用异氟烷麻醉小鼠，其心率稳定在450-500次/分钟。使用小动物心脏超声检测系统(visual sonics，vevo 2100)检测小鼠心脏收缩功能，采集小鼠左心室b-mode长轴图像并在左心室直径最大处采集m-mode图像。最后用lv trace工具计算左心室射血分数(ef)、左心室短轴缩短率(fs)。结果如图4所示，共有48只小鼠被实施了心脏超声检查，其中9只来自于第一组，ef分别为53.9％、53.3％、49.0％、62.6％、50.9％、55.3％、66.8％、59.0％，fs分别为28.8％、27.6％、27.3％、24.4％、32.8％、25.6％、28.2％、36.4％、31.0％；其中10只来自于第二组，ef分别为51.1％、59.2％、53.0％、56.1％、52.8％、54.0％、59.2％、66.9％、56.6％、58.7％，fs分别为25.8％、31.1％、26.3％、28.9％、26.8％、27.5％、30.8％、36.3％、29.4％、30.6％；其中15只来自于第三组，ef分别为32.7％、24.8％、23.9％、32.6％、31.6％、26.0％、40.9％、37.0％、36.8％、42.7％、42.2％、42.3％、45.3％、40.6％、49.5％，fs分别为14.7％、11.3％、10.8％、15.2％、14.7％、11.9％、19.6％、17.5％、17.4％、20.7％、20.0％、20.3％、21.9％、19.4％、24.3％；其中14只来自于第四组，ef分别为53.2％、53.9％、70.6％、54.3％、47.7％、67.0％、51.0％、67.9％、52.3％、57.9％、55.6％、65.7％、48.3％、58.0％，fs分别为26.8％、27.4％、39.1％、27.7％、23.6％、36.2％、25.5％、37.1％、26.1％、30.0％、28.6％、35.6％、24.0％、30.1％。
80.5.小鼠心肌组织的tunel染色
81.小鼠心肌组织经冰冻切片后产生的组织切片粘附于载玻片上，将载玻片保存于-80℃。
82.具体染色方法如下：
83.[0084][0085]
避光条件下用50％甘油封片后，于激光共聚焦显微镜(carl zeiss,thuringia,germany)下观察(hoechst激发波长为375nm，对应的发射波长425nm，以蓝光表示；tunel-fitc激发波长485nm，发射波长525nm，以绿光表示；cy3激发波长为550nm，对应的发射波长为570nm，以红光表示)，通过zen软件采集图像并用image j统计阳性心肌细胞个数。
[0086]
结果如图5所示，共有16片心脏组织切片被实施了tunel染色，16片心脏组织切片分别来自于上述4组小鼠，每组4片分别来自于组内不同个体小鼠。第一组心脏组织切片统计得tunel阳性细胞个数占总细胞个数比分别为1.361％、0.861％、0.916％、0.767％；第二组心脏组织切片统计得tunel阳性细胞个数占总细胞个数比分别为0.856％、0.797％、0.724％、1.023％；第三组心脏组织切片统计得tunel阳性细胞个数占总细胞个数比分别为17.336％、20.208％、18.348％、18.289％；第四组心脏组织切片统计得tunel阳性细胞个数占总细胞个数比分别为16.769％、14.679％、12.925％、13.216％。
[0087]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。