沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒产品中的应用。


背景技术：

2.沙棘(hippophae rhamnoides l.)别名醋柳、达布尔、拉巴才尔玛等，是一种雌雄异株的落叶性胡颓子科灌木植物，主要生长于我国的华北、西南、西北等地区，在俄罗斯及印度等国家也均有分布。该植物生态适应性强，具有耐旱、耐盐碱等特点，大面积种植可以作为防风固沙及保持水土的优选物种。由于该植物自然资源丰富，因此其开发利用也备受人们的关注。其中，沙棘果是藏族和蒙古族常用药材，蒙古族《认药白晶鉴》中记述“沙棘膏具有祛肺脓肿、活血、祛巴达干之功效”，藏族医典《晶珠本草》提及到“沙棘果挖除肺病、化血并治培根病”，具有健脾消食、止咳祛痰和活血散瘀的功效。《月王药膳》认为沙棘具有“医治培根、增强体阳、开胃舒胸、饮食爽口、容易消化”等功效，在《四部医典》上载有沙棘在临床上可用于“祛痰止咳、利肺、化湿、壮阴及升阳”等，特别是《本草纲目》认为该植物“实、气味酸、温、无毒、主治久痢不瘥及心腹胀满黄瘦、下寸白虫、单捣为末，酒调服之甚效”。至今为止，沙棘果多用于治疗肺病咳嗽、脘腹胀满、痢疾等疾病，而沙棘叶在藏族药中则多用于治疗诸热、胆热、隐热、火烧伤、瘟病和时疫等。1977年，国家卫生部将沙棘纳入《中国药典》。沙棘因富含营养物质和生物活性成分，又为药食同源植物，因此其果实和种子已在食用、药用等方面被广泛利用。近年来的研究证明，沙棘籽提取油脂后的籽粕蛋白含量丰富，是具有较好的营养价值的优质植物蛋白资源，也沙棘活性物质之一，因此对沙棘籽蛋白及籽粕蛋白来源的生物活性肽的研究和应用开发是十分有必要的。
3.随着社交需求及生活压力增大，酒精消费人群已超数亿人次，且消费人群数量日趋增多，并因酗酒引起的社会问题也屡见不鲜，酗酒和酒精中毒已成为人们关注的公共卫生问题。其中，急性酒精中毒是一种有害的临床病理状态，指由于一次过量饮酒而引起的中枢神经系统由兴奋转为抑制的状态，严重者可引起急性胃出血、急性胃炎、急性肝炎、高血压甚至死亡。酒精中毒对神经系统的损害是严重的，且为广泛的，甚至会引起器质性损害。酒精进入人体后，首先进入肝脏被酶代谢，但当进入人体的酒精量超过肝脏的氧化代谢能力时，酒精就会蓄积在脑组织。酒精具有亲脂性，且为神经系统抑制剂，一次过量饮酒可引起急性中毒症候群。酒精易透过血脑屏障进入大脑，作用于大脑皮层，表现为兴奋、理智障碍、易冲动，继而皮层下中枢、小脑延髓、血管运动中枢和呼吸中枢相继受到抑制，出现共济失调、肌肉僵硬、休克、癫痫、抽搐等症状，严重急性中毒可导致呼吸衰竭。
4.解酒的产品种类繁多，其解决效果也参差不齐，部分解酒药还存在副作用较大的缺点。至今为止尚无有关沙棘籽粕蛋白肽具有解酒功效的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒产品中
的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒产品中的应用。
7.沙棘籽粕是沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后的固体物，沙棘籽粕中含有丰富的蛋白质、黄体酮和多种微量元素。研究表明，长期食用沙棘籽粕安全可靠，无蓄积性毒害，亦无致癌或促发肿瘤作用，可促进免疫器官生长发育，提高机体抗病能力，并可治疗犊牛腹泻、卡他性肠炎、肠痉挛、皮疹、风湿病。但目前未见其具有解酒的功效的报道。
8.发明人在研究中意外发现沙棘籽粕蛋白肽可用于解酒，其具备安全性高、可长期服用，无副作用等特点。因此，沙棘籽粕蛋白肽可用于开发解酒产品，具有广阔的应用前景和经济价值。本技术发明人经过大量的研究发现，沙棘籽粕蛋白肽能够提高肝脏乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,adh)的活性，促进乙醇代谢和减少乙醇吸收，从而发挥解酒作用。谷草转氨酶、谷丙转氨酶和谷胱甘肽s-转移酶存在在肝脏中，大量饮酒和肝脏疾病会使肝脏中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶和谷胱甘肽s-转移酶活性增高。本技术发明人经过大量的研究发现，沙棘籽粕蛋白肽能够抑制谷草转氨酶、谷丙转氨酶和谷胱甘肽s-转移酶的活性。生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。本技术发明人经过大量的研究发现，沙棘籽粕蛋白肽能够降低肝脏中丙二醛的含量，具备解酒的作用。
9.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述沙棘籽粕蛋白肽在产品中的质量含量为0.001～100％。
10.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述产品的使用剂量为50～200mg/kg。
11.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的沙棘籽粕蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
12.(1)取沙棘籽粕蛋白溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，酶解结束后将溶液离心，取上清液，得蛋白酶解液；
13.(2)将步骤(1)的沙棘籽粕蛋白酶解液经分子量为10kda的滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
14.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述步骤(3)的酶解中，酶解溶液的ph为10～12，酶解温度为45～55℃，胰蛋白酶的加酶量为0.1～0.25％。
15.本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备用于预防和治疗酒精性肝损伤的产品中的应用。
16.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述酒精性肝损伤为急性酒精性肝损伤。
17.肝脏是体内最主要且重要的药物代谢场所，同时也是最易受到损伤的器官。酒精是损伤肝细胞的一个危险因子，也是诱发肝脏相关疾病的重要因素。大量研究表明，长期大量饮酒会引起肝细胞损伤、肝纤维化，甚至导致酒精性肝硬化。本技术发明人经过大量的研究发现，沙棘籽粕蛋白肽能够用于预防和治疗由酒精诱导的急性肝损伤的药物的制备。
18.本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒药物中的应用。
19.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、口服液、泡腾片、浸膏剂、糖浆剂、注射剂、缓释剂或控释剂中的任一种。
20.本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒食品中的应用。
21.本发明的有益效果：本发明提供沙棘籽粕蛋白肽在制备解酒产品中的应用，沙棘籽粕蛋白肽能显著改善小鼠醉酒后的肌肉松弛、肌无力的行为障碍；沙棘籽粕蛋白肽能够降低肝指数，抑制谷草转氨酶、谷丙转氨酶和谷胱甘肽s-转移酶的活性，提高乙醇脱氢酶的活性，减少丙二醛的含量，能有效的解酒，并可用于制备具有预防和治疗由酒精诱导的急性肝损伤的产品。
具体实施方式
22.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
23.实施例1沙棘籽粕蛋白制备方法
24.本实施例的一种沙棘籽粕蛋白制备方法，包括以下步骤：
25.(1)称取100g脱脂沙棘籽粕粉末，加入9倍重量份的水溶解，调节溶液ph至11，于37℃提取40min，重复提取3次，8000
×
g离心25min，收集上清液；
26.(2)调节步骤(1)的上清液ph为5.0，按照原料重量百分比0.2％的量加入植酸酶，酶解3h，8000
×
g离心并收集沉淀，将沉淀加水复溶,调节ph至7.0后冷冻干燥，得沙棘籽粕蛋白；
27.(3)用步骤(2)的沙棘籽粕蛋白配制溶液，调节溶液ph至11，加入0.2％的胰蛋白酶，于50℃进行酶解，酶解结束后将溶液离心，取上清液，得蛋白酶解液；
28.(4)将步骤(3)的沙棘籽粕蛋白酶解液经分子量为10kd及3kd的聚醚砜超滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
29.实施例2对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白、沙棘籽粕蛋白酶解液和沙棘籽粕蛋白肽的分析鉴定
30.(1)采用凯氏定氮法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白的蛋白质含量进行测定，测定结果如表1所示。
31.(2)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液进行氨基酸含量分析，沙棘蛋白酶解液的氨基酸含量测定结果如表2所示。
32.(3)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液的分子量大小进行测定，测定结果如表3所示。
33.(4)采用hplc/ms/ms方法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白肽的氨基酸序列进行鉴定，结果如表4所示。
34.表1沙棘籽粕蛋白的提取率及蛋白含量
[0035][0036]
表2沙棘籽粕蛋白及蛋白酶解产物中氨基酸含量(g/100g)
[0037][0038][0039]
由表2可知，谷氨酸，精氨酸等为沙棘籽粕蛋白的主要氨基酸，其次为天冬氨酸及亮氨酸，沙棘籽粕提取蛋白的酸性氨基酸含量相对较高，说明沙棘籽粕蛋白在自然条件下呈酸性，与其等电点结果相一致。酶解前和酶解后的氨基酸种类相同，酶解之后的水解氨基酸总量降低，这可能由于酶解过程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。
[0040]
表3沙棘蛋白及酶解液的肽分子量分布
[0041][0042]
由表3可知，本发明中胰蛋白酶酶解沙棘籽粕蛋白的肽分子量分布的结果显示，沙棘籽粕蛋白原料的分子量较大，而经过酶解之后，分子量明显降低。胰蛋白酶酶解之后的肽分子量大多在5kda～10kda之间，且具有较多的大分子量的肽段。
[0043]
表4 hplc-ms/ms分析结果
[0044]
[0045]
[0046][0047]
由表4可知，共52个肽序列，其中二肽有14个(约占26.92％)，三肽有20个(约占38.46％)，四肽有13个(约占25％)，五肽有3个(约占5.76％)，六肽和八肽各有1个，肽中含有精氨酸基团为24个，且90％以上的精氨酸在碳端。
[0048]
实施例3沙棘籽粕蛋白肽对小鼠醉酒、解酒时间和行为学的影响
[0049]
本实施例以小鼠的醉酒时间、醒酒时间、攀附时间和悬挂时间为指标对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽的解酒功能进行评价。
[0050]
(1)实验方法：
[0051]
a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，5只/饲养笼(235
×
325
×
170mm)，自由饮食，适应性饲养一周后进行实验。将实验小鼠随机分组，每组16只，其中模型组：小鼠给予同体积的生理盐水；阳性药组：小鼠以1.3ml/10g的海王金樽灌胃；沙棘籽粕蛋白组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽低剂量组：小鼠以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽中剂量组：小鼠以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽高剂量组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃。
[0052]
b.给药30分钟后，各组小鼠按14ml/kg体重给予50％的酒精灌胃。随后立刻将各组的8只小鼠置于垂直竖立的金属网使其攀附于上，同时记录小鼠掉落下网时间，此时间段记为攀附时间。同时将各组的另外8只小鼠的前肢悬挂在直径2mm、长50cm、平行高度50cm的金
属线上，记录小鼠从金属线上掉落的时间记为小鼠的悬垂时间。然后将各组小鼠翻转置于光滑平板上，记录翻正反射消失时间作为醉酒指标，同时记录翻正反射恢复时间作为醒酒指标，翻正反射消失至翻正反射恢复所需的时间为持续醉酒时间。
[0053]
(2)实验结果如表5和表6所示。
[0054]
表5沙棘籽粕蛋白肽对小鼠醉酒、醒酒时间的影响
[0055][0056]
沙棘籽粕蛋白肽与模型做相比，**p《0.01，***p《0.001。
[0057]
表6沙棘籽粕蛋白肽对小鼠攀附、悬挂时间的影响
[0058][0059]
沙棘籽粕蛋白肽与模型做相比，*p《0.05，**p《0.01。
[0060]
由表5和表6所示，与模型组相比，沙棘籽粕蛋白肽低中高剂量组小鼠的醉酒时间明显延长，而醒酒时间明显提前。此外，沙棘籽粕蛋白肽能显著改善小鼠醉酒后的肌肉松弛、肌无力的行为障碍，但是沙棘籽粕蛋白对上述指标均无明显的改善作用。
[0061]
实施例4沙棘籽粕蛋白肽对酒精所致的急性肝损伤的保护作用
[0062]
本实施例对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对酒精所致的急性肝损伤的保护作用进行测定。
[0063]
(1)实验方法：
[0064]
a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，5只/饲养笼(235
×
325
×
170mm)，自由饮食，适应性饲养一周后进行实验。a.将实验小鼠随机分组，每组10只，其中
正常组和模型组：小鼠给予同体积的生理盐水；阳性药组：小鼠以100mg/kg的联苯双酯灌胃；沙棘籽粕蛋白组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽低剂量组：小鼠以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽中剂量组：小鼠以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽高剂量组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃。
[0065]
b.于实验前12小时，各组小鼠禁食不禁水。除正常对照组和模型组小鼠灌胃生理盐水外，阳性药组、沙棘籽粕蛋白肽低中高剂量组和沙棘籽粕蛋白组小鼠按0.1ml/10g体重灌胃给药，每天一次，连续给药10天。每次灌胃给药30分钟后，除正常对照组给予等体积蒸馏水外，其他各组小鼠均给予体积分数为38％的乙醇0.1ml/10g灌胃造模。最后一次造模后，各组小鼠均麻醉称重后眼球取血，室温静置后2500
×
g离心15分钟，取上清离心分离血清，用于检测谷草转移酶(ast)和谷丙转移酶(alt)活性。随后颈椎脱臼处死动物，立刻取肝脏，吸干水后称重，计肝脏指数(肝重/体重
×
100％)。然后往肝脏中加入预冷的生理盐水，用自动组织匀浆机分别制成肝组织匀浆，3000
×
g离心15分钟取上清用于测定乙醇脱氢酶(adh)、谷胱甘肽s-转移酶(gst)和丙二醛(mda)。
[0066]
(2)实验结果如表7所示。
[0067]
表7
[0068][0069]
与正常对照组相比，*p《0.05，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0070]
表8
[0071]
[0072][0073]
与正常对照组相比，*p《0.05，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0074]
由表7和表8可知，沙棘籽粕蛋白肽能有效改善酒精诱导的小鼠急性肝损伤，降低肝指数、抑制ast、alt、adh和gst活性，减少mda含量，而沙棘籽粕蛋白无明显的改善作用。
[0075]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。