检测甘胆酸的试剂盒、方法及用途与流程

1.本发明涉及甘胆酸检测领域，具体涉及基于免疫比浊法的甘胆酸检测。


背景技术：

2.甘胆酸(cholyglycine,cg)是一种结合型胆酸，其由胆酸和甘氨酸结合而成。
3.在正常情况下，外周血中胆酸含量甚微，正常成人无论空腹或餐后，其血清甘胆酸浓度稳定在低水平。当肝脏细胞受损时，肝脏细胞摄取甘胆酸的能力下降，致使血液中甘胆酸含量增高；胆汁淤积是肝脏排泄胆酸所发生的障碍，由于返流血液循环的甘胆酸含量增高，故胆汁淤积也使血清甘胆酸含量增高。因此，可将血清甘胆酸水平与其他临床指标结合，对肝病以及胆汁淤积的发生、进展和预后进行辅助判断。
4.甘胆酸检测的反应原理采用基于竞争抑制的胶乳增强免疫比浊法。在该方法中，血清中的甘胆酸与甘胆酸-蛋白偶联复合物竞争结合甘胶乳微粒表面包被的甘胆酸单克隆抗体。其中，人工设计的甘胆酸-蛋白偶联复合物有较多抗体结合位点，与胶乳微粒产生明显交联反应；而血清中甘胆酸抗原与抗体结合位点较少，表现为仅封闭微粒表面抗体，降低交联反应。据此，可通过对交联反应产生的吸光度的变化，来定量检测样本中血清甘胆酸抗原。
5.然而，由于甘胆酸是胆酸的结合型胆酸之一，是胆汁酸的一种。而人体内胆汁酸还包括：甘氨熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、石胆酸。在检测过程中，这些甘胆酸的类似物会干扰甘胆酸检测过程中的竞争关系，从而对实验结果带来影响。
6.当前，已知市面上在售的多种甘胆酸试剂盒均存在不同甘胆酸类似物的干扰问题。然而，对于如何抑制的甘胆酸类似物带来的干扰，目前尚未找到十分有效的方法。
7.因此，在甘胆酸检测领域，存在着降低甘胆酸类似物干扰，从而提高试剂检测的分析灵敏度的强烈需求。


技术实现要素：

8.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
9.如下文中所使用，术语“具有”、“包含”或“包括”以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以是指其中除了这些术语引入的特征之外在本上下文中描述的实体中没有另外特征存在的情况，而且可以是指其中存在一个或多个另外特征的情况。作为实例，表述“a具有b”、“a包含b”和“a包括b”既可以是指其中除了b之外在a中没有另外要素存在的情况(即其中单独且仅由b组成的情况)，而且可以是指其中除了b之外在实体a中存在一种或多种另外要素诸如要素c、要素c和d或甚至其它要素的情况。
10.如上文所述，目前，甘胆酸检测基于采用基于竞争抑制的免疫比浊法，而样本中甘胆酸类似物的存在会干扰检测时的竞争关系，从而造成检测准确性的下降。
11.为了解决上述问题，本发明甘胆酸类似物的抗干扰成分进行研究，并发现在反应体系中存在氨基酸的情况下，可以抑制甘胆酸类似物所带来的干扰，从而完成了本发明。
12.据此，在第一方面，本发明提供了一种检测甘胆酸的试剂盒，包括：
13.第一试剂，其含有甘胆酸与惰性载体的偶联复合物；和
14.第二试剂，其含有包被有抗甘胆酸抗体的微粒；
15.其中，所述试剂盒含有氨基酸，所述氨基酸选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的一种或多种。
16.在第二方面，本发明提供了一种检测甘胆酸的试剂盒，包括：
17.第一试剂，其含有甘胆酸与惰性载体的偶联复合物；和
18.第二试剂，其含有包被有抗甘胆酸抗体的微粒；
19.其中，所述试剂盒含有氨基酸，所述氨基酸的浓度被配制为使得在检测样本时其以14-130mm的终浓度存在。
20.通过引入特定种类的氨基酸或引入特定浓度的氨基酸，本发明在测定甘胆酸时将检测偏差率控制在≤10％的范围内，同时将甘胆酸类似物的检出率控制在≤15％。就这一点而言，本发明取得了优于当前市售甘胆酸检测产品的抗干扰水平。
21.除非特殊说明，本发明中的用语“第一”和“第二”等仅用于区分多个相似的要素，而不意在表示要素之间重要性或次序等方面的任何差异。
22.在一些实施方式中，氨基酸是极性氨基酸。本发明的极性氨基酸可选自带正电极性氨基酸、带负电极性氨基酸和中性极性氨基酸。
23.在具体的实施方式中，氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其组合。
24.在将本发明的试剂与待测样本混合后，氨基酸在反应体系中的终浓度可为14-130mm，尤其为16-120mm。例如，15mm、16mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm或130mm。
25.在一些实施方式中，氨基酸仅存在于第一试剂中。在这样的情况下，氨基酸在第一试剂中的浓度可为18-165mm，尤其为20-150mm。例如，19mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm或160mm。
26.在一些实施方式中，氨基酸仅存在于第二试剂中。在这样的情况下，氨基酸在第二试剂中的浓度可为70-660mm，尤其为80-600mm。例如，80mm、90mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm、500mm、550mm、600mm或650mm。
27.在一些实施方式中，氨基酸可同时存在于第一试剂和第二试剂中，且被配制为满足在反应体系中所需要的终浓度。
28.在一些实施方式中，氨基酸可以存在于额外的试剂中，且被配制为满足在反应体系中所需要的终浓度。
29.优选地，在将本发明的试剂与待测样本混合后，氨基酸在反应体系中的终浓度可为40-60mm，例如可为41mm、42mm、43mm、44mm、45mm、46mm、47mm、48mm、49mm、50mm、51mm、52mm、53mm、54mm、55mm、56mm、57mm、58mm或59mm。
30.在示例的实施方式中，氨基酸可以50-75mm的浓度存在于第一试剂中，例如，可以
55mm、60mm、65mm或75mm的浓度存在。
31.在另一示例性的实施方式中，氨基酸可以200-300mm的浓度存在于第二试剂中，例如，可以220mm、240mm、260mm或280mm的浓度存在。
32.通过对氨基酸浓度范围进行优化，本发明进一步降低了甘胆酸检出偏差率，从而进一步提高甘胆酸检测的准确性。
33.本发明的第一试剂中含有甘胆酸与惰性载体的偶联复合物(甘胆酸偶联复合物)，甘胆酸偶联至惰性载体上后，每个惰性载体上可存在多个甘胆酸，从而提高小分子甘胆酸的结合能力并能在检测过程将信号放大。常见的惰性载体例如可以是bsa、卵清白蛋白等。
34.本发明的第二试剂中含有包被有抗甘胆酸抗体的微粒，所述微粒是免疫比浊法中所使用常见微粒，当其表面上的抗体与抗原结合后，微粒聚集在一起，从而改变反应液的散光或透光性能。合适的微粒例如可以是胶乳微球、胶体金等。
35.在本发明中，抗甘胆酸抗体，是指能与甘胆酸特异性结合的抗体。在示例性的实施方式中所抗体为单克隆抗体。可以根据待检测甘胆酸的来源来选择合适抗体，例如在检测对象为人来源的甘胆酸时，将采用抗人甘胆酸抗体，如鼠抗人甘胆酸抗体、兔抗人甘胆酸抗体等。
36.本领域技术可以理解，抗甘胆酸抗体可以合适的方式与微粒相连，例如，通过物理吸附或共价键合的方式相连。
37.在一些实施方式中，本发明的试剂还可以含有缓冲液，该缓冲液可用于为试剂中的成分提供合适的贮存环境并且可用于在反应过程中提供合适的反应环境。
38.对于缓冲液的种类，本发明没有特别地限制，可以使用本领域熟知的任何可用于基于免疫比浊法检测甘胆酸的缓冲液。这样的缓冲液例如可以为磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、硼酸缓冲液、good’s系列缓冲液等。同样，对于缓冲液的ph，本发明没有特别地限制，可以选取常规免疫比浊法检测甘胆酸时通常所使用的ph，例如可为6.0-8.0，又例如7.0-7.5。
39.在一些实施方式中，本发明的试剂还可以含有保护剂。在本发明中，保护剂是指用来保护抗体活性和/或提高包被有抗体的微粒稳定性的试剂。
40.对于保护剂的种类，本发明没有特别的限制，可以使体外诊断试剂领域中常见任何常见的保护剂。示例性的保护剂可为选自糖类保护剂，如蔗糖、海藻糖、葡聚糖、葡萄糖、果糖；蛋白类保护剂，如bsa、酪蛋白、脱脂奶粉；醇类保护剂，如甘露醇；对于保护剂的使用剂量，本领域技术人员能够根据保护剂的种类进行选择，比如，在使用蔗糖作为保护剂时可采用10-15g/l的浓度。
41.在一些实施方式中，本发明的试剂还可以含有防腐剂。在本发明中，防腐剂是指用来延长经标记的微粒保存时间的试剂。
42.对于防腐剂的种类，本发明没有特别的限制，可以使用诊断试剂领域中常见任何常见的防腐剂。示例性的防腐剂可选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、二甲苯酚、尼泊金酯、高锰酸盐、抗生素类(如庆大霉素、二氯乙酰胺、supelco公司推出的proclin系列等)、对羟基苯甲酸乙酯和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或若干种。对于防腐剂的使用剂量，本领域技术人员能够根据防腐剂的种类进行选择，比如，在使用叠氮钠作为防腐剂时可采用0.5-2g/l的浓度。
43.在一些实施方式中，本发明的试剂还可以含有表面活性剂。在本发明中，表面活性
剂是指加入少量能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质；其具有固定的亲水亲油基团且在溶液的表面能定向排列。
44.对于表面活性剂种类，本发明没有特别的限制，可以使用诊断试剂领域中常见任何常见的表面活性剂。示例性的表面活性剂可选自tween、span、曲拉通、emulgen系列表面活性剂(如tween 20、tween 40和曲拉通100)以及月桂酸聚乙二醇甘油酯、阴离子烷基多苷、十二烷基二甲基甜菜碱、3aramt1、sho62c和am phitol中的一种或若干种。对于表面活性剂的使用剂量，本领域技术人员能够根据表面活性剂的种类进行选择，比如，在使用tween 20作为表面活性剂时可以采用例如0.05-0.2wt％的浓度。
45.此外，本发明的试剂盒还可以包括校准品。
46.本发明的试剂盒例如可以是基于免疫比浊法的甘胆酸检测试剂盒。具体地，可以是基于胶乳增强免疫比浊法的甘胆酸检测试剂盒。
47.在第三方面，本发明提供了检测甘胆酸的方法，包括：
48.加入样本、第一试剂和第二试剂混匀并测定第一吸光度；
49.一定时间后，测量第二吸光度；以及
50.根据所述第一吸光度和第二吸光度计算甘胆酸浓度，
51.其中，所述第一试剂含有甘胆酸与惰性载体的偶联复合物；所述第二试剂含有包被有抗甘胆酸抗体的微粒；并且所述试剂盒含有一种或更多种氨基酸，所述氨基酸选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸中的一种或多种。
52.在具体的实施方式中，所述样本来源于人或哺乳动物(如猪、牛、山羊、绵羊、狗和猫)，优选源自于人。
53.在本发明中，样本为来自受试者的血清。
54.对于样本、第一试剂和第二试剂的加入顺序，本发明没有特别的限制，可以根据配套使用的检测仪器进行选择。
55.可以理解，第一吸光度测定于加入第二试剂且尚未充分发生交联反应之时，如加入第二试剂后的几秒内；而第二吸光度测定于加入第二试剂的一定时间后，因交联反应(如存在)所产生的吸光度变化已经发生。可以根据反应条件确定这样的时间，例如，第一吸光度与第二吸光度的测量可间隔2～10分钟。
56.在第四方面，本发明提供了氨基酸在降低甘胆酸类似物对甘胆酸检测的干扰中的用途。
57.其中，甘胆酸类似物可选自由以下项组成的组中的一种或多种：甘氨熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸、石胆酸、牛磺猪脱氧胆酸和它们的盐。
58.在一些实施方式中，甘胆酸类似物可选自由以下项组成的组中的一种或多种：胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸和它们的盐。
具体实施方式
59.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明
本发明，而非限制本发明。
60.目前的血清甘胆酸检测试剂盒在检测过程中会受到甘胆酸类似物的干扰，从而影响结果的准确性。发明人令人惊奇地发现在反应体系中额外地加入氨基酸极大地改善了因类似物干扰所带来对甘胆酸检测结果的影响。
61.不希望受到理论的束缚，氨基酸的存在调整了甘氨酸的带电特性，提高了其与甘胆酸-惰性载体偶联复合物的竞争关系；另外，添加氨基酸可能降低甘胆酸及其类似物的亲水性，暴露更多与抗体结合的疏水位点，提高抗体与半抗原结合的特异性，从而降低甘胆酸类似物干扰影响。
62.以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
63.实施例1样本的制备
64.甘胆酸回收率评估样本的制备
65.称取1mg甘胆酸钠，溶于1ml去离子水中，充分混合，配置为高浓度添加物液；随后取50μl高浓度添加物液加入到950μl新鲜的随机正常血清中，充分混匀，配成50mg/l甘胆酸回收率评估样本。
66.类似地，采用肝胆酸
·
水合物配成50mg/l甘胆酸回收率评估样本。
67.干扰物检出率评估样本的制备。
68.称取1mg胆酸钠，溶于1ml去离子水中，充分混合，配置为高浓度添加物液；随后取50μl高浓度添加物液加入到950μl新鲜的随机正常血清中，充分混匀，配成50mg/l胆酸检出率评估样本。
69.类似地，采用鹅脱氧胆酸钠、熊脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠、牛磺鹅脱氧胆酸钠、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺熊脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、石胆酸、甘氨脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨石胆酸钠、牛磺石胆酸钠和牛磺猪脱氧胆酸钠，分别配成鹅脱氧胆酸检出率评估样本、熊脱氧胆酸检出率评估样本、甘氨鹅脱氧胆酸检出率评估样本、牛磺鹅脱氧胆酸检出率评估样本、甘氨熊脱氧胆酸检出率评估样本、牛磺熊脱氧胆酸检出率评估样本、脱氧胆酸检出率评估样本、石胆酸检出率评估样本、甘氨脱氧胆酸检出率评估样本、牛磺脱氧胆酸检出率评估样本、甘氨石胆酸检出率评估样本、牛磺石胆酸检出率评估样本和牛磺猪脱氧胆酸检出率评估样本。
70.空白对照样本的制备
71.取50μl去离子水加入到950μl随机正常血清中，充分混匀，配置成空白对照样本。
72.实施例2试剂1和试剂2的配制
73.根据表1和表2，分别调配试剂1和试剂2。
74.表1
75.[0076][0077]
表2
[0078][0079]
实施例3回收率和检出率的测定
[0080]
试剂1用量140μl、试剂2用量35μl，使用迈瑞生化检测仪bs480对调配的样本(8.4μl)进行检测。在测试过程中先加入样本，再分别加入试剂1和试剂2，试剂1中含有甘胆酸-蛋白偶联复合物，其当加入试剂2试剂后，该复合物与样本中甘胆酸共同竞争胶乳微球上的鼠抗人甘胆酸单克隆抗体位点，通过测量交联前后605nm处吸光度得出甘胆酸的测量浓度。
[0081]
对检测结果计算甘胆酸回收率和干扰物检出率。配方试剂在生化分析仪上设置参数定标，每个样本测试5次计算平均值，计算公式如下：
[0082][0083][0084]c测
：待评估样本五次测试值的平均值；
[0085]c空
：空白对照样本五次测试值的平均值；
[0086]c理论
：称量法调配待评估样本中的添加物的理论浓度值。
[0087]
实施例4添加精氨酸对检测效果的影响
[0088]
下表3列出了本实施例中所使用的试剂组合，并示出各试剂组合中氨基酸的添加情况。
[0089]
表3
[0090][0091]
按照实施例3中记载的方法，使用组合1-3及市售试剂盒a对甘胆酸回收率进行测定，结果如下表4所示。
[0092]
表4
[0093]
血清基质(回收率)组合1组合2组合3市售试剂盒a空白对照////甘胆酸
·
水合物96.5％100.0％102.7％80.9％甘胆酸钠96.4％99.5％102.2％80.9％
[0094]
同时，按照实施例3中记载的方法，使用组合1-3及市售试剂盒a对干扰物检出率进行测定，结果如下表5所示。
[0095]
表5
[0096][0097][0098]
由表4和表5可知，在使用试剂组合1-3的情况下，本发明能够将甘胆酸的检测偏差率控制在10％以内，而市售试剂盒偏差率为约20％。同时，与市售试剂盒相比，本发明的试
剂组合能将各干扰物的检出率控制在15％以内的较低水平。
[0099]
此外，在使用组合2(试剂1，60mm精氨酸)的情况下，获得了最佳的检测效果。
[0100]
实施例5精氨酸添加量对检测效果的影响
[0101]
下表6列出了本实施例中所使用的试剂组合，并示出各试剂组合中氨基酸的添加情况。
[0102]
表6
[0103][0104]
按照实施例3中记载的方法，使用组合4和5对甘胆酸回收率进行测定，结果如下表7所示。
[0105]
表7
[0106]
血清基质(回收率)组合4组合5空白对照//甘胆酸
·
水合物90.6％110.0％甘胆酸钠91.6％107.2％
[0107]
同时，按照实施例3中记载的方法，使用组合4和5对干扰物检出率进行测定结果如下表8所示。
[0108]
表8
[0109]
血清基质(检出率)组合4组合5胆酸钠13.8％18.4％鹅脱氧胆酸钠1.8％2.3％熊脱氧胆酸-0.5％-0.5％甘氨鹅脱氧胆酸钠16.5％15.7％牛磺鹅脱氧胆酸钠12.4％12.1％甘氨熊脱氧胆酸-0.8％-0.7％牛磺熊脱氧胆酸钠-0.3％-0.2％脱氧胆酸钠1.9％1.8％石胆酸-0.1％-0.1％甘氨脱氧胆酸钠9.6％6.7％牛磺脱氧胆酸钠6.8％4.9％甘氨石胆酸钠0.1％0.1％牛磺石胆酸钠0.2％0.2％牛磺猪脱氧胆酸钠0.6％0.7％
[0110]
由表7和表8可知，在使用试剂组合4和5的情况下，本发明的回收率偏差增加，检测偏差率接近
±
10％；同时，对于部分甘胆酸类似物的检出率偏高，部分结果超过15％的偏差要求。
[0111]
实施例6添加赖氨酸、组氨酸对抗干扰效果的影响
[0112]
下表9列出了本实施例中所使用的试剂组合，并示出各试剂组合中氨基酸的添加情况。
[0113]
表9
[0114][0115]
按照实施例3中记载的方法，使用组合6和7对甘胆酸回收率进行测定，结果如下表10所示。
[0116]
表10
[0117]
血清基质(回收率)组合6组合7空白对照//甘胆酸
·
水合物100.3％98.2％甘胆酸钠98.2％95.4％
[0118]
按照实施例3中记载的方法，使用组合6和7对干扰物检出率进行测定，结果如下表11所示。
[0119]
表11
[0120]
[0121][0122]
由表10和表11可知，在使用试剂组合6和7的情况下，本发明能够将甘胆酸的检测偏差率控制在10％以内；并且能将各干扰物的检出率控制在15％以内的较低水平。
[0123]
实施例7氨基酸的添加方式对检测效果的影响
[0124]
下表12列出了本实施例中所使用的试剂组合，并示出各试剂组合中氨基酸的添加情况。
[0125]
表12
[0126][0127]
按照实施例3中记载的方法，使用组合8对甘胆酸回收率进行测定，结果如下表13所示。
[0128]
表13
[0129][0130][0131]
同时，按照实施例3中记载的方法，使用组合8对干扰物检出率进行测定结果如下表14所示。
[0132]
表14
[0133]
血清基质(检出率)组合8胆酸钠15.0％鹅脱氧胆酸钠1.7％
熊脱氧胆酸-0.1％甘氨鹅脱氧胆酸钠12.2％牛磺鹅脱氧胆酸钠9.4％甘氨熊脱氧胆酸0.1％牛磺熊脱氧胆酸钠0.1％脱氧胆酸钠1.9％石胆酸0.1％甘氨脱氧胆酸钠6.2％牛磺脱氧胆酸钠4.6％甘氨石胆酸钠-0.1％牛磺石胆酸钠0.0％牛磺猪脱氧胆酸钠0.4％
[0134]
由表13和表14可知，在使用试剂组合8的情况下，本发明同样能够将甘胆酸的检测偏差率控制在10％以内；并且能将各干扰物的检出率控制在15％以内的较低水平。