一种苯二氮卓类新型毒品在线固相微萃取高效液相色谱联用检测方法

co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱作为基质整体柱，使用碱性对苯二胺溶液作为功能化试剂对其表面进行聚对苯二胺纤维功能化；再将亚胺型共价有机框架的反应液与乙酸水溶液的混合液注满整体柱，以聚对苯二胺纤维作为结合位点，在整体柱表面原位生成共价有机框架微球，制得共价有机框架表面功能化整体柱。
7.其中，上述的苯二氮卓类新型毒品包括硝西泮，艾司唑仑，奥沙西泮，三唑仑，地西泮和氟硝西泮。
8.上述一种苯二氮卓类新型毒品在线固相微萃取高效液相色谱联用检测方法，包括以下步骤：1）共价有机框架表面功能化整体柱的制备：1. 聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）基质整体柱的制备：先将长度为33毫米，内径为2.1毫米的不锈钢空柱用甲醇冲洗20分钟，放入60℃烘箱烘干待用；基质整体柱的制备填料由300 mg甲基丙烯酸缩水甘油酯、100 mg乙二醇二甲基丙烯酸酯、480 mg 1,4-丁二醇、120 mg n,n-二甲基甲酰胺与1.2 mg偶氮二异丁腈组成，用旋涡混合器混匀后，超声15分钟；用注射器将配好的填料注入前述的不锈钢柱中，放入60℃水浴反应24小时；反应结束后，以甲醇为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱约1小时，以去除床层内残留的致孔剂、未反应的单体以及反应生成的一些低聚物，即得到聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）基质整体柱;2. 聚对苯二胺纤维表面功能化：取2.1628 g对苯二胺与0.4 g氢氧化钠加入20 ml甲醇，用漩涡混合器震荡均匀，超声20分钟，得到1 mol/l碱性对苯二胺甲醇溶液，并将该溶液通过微量注射泵注入聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）基质整体柱中，注满密封后，常温反应24小时；反应结束后，先以甲醇为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱1小时，再换成乙腈冲洗1小时，即完成基质整体柱的聚对苯二胺纤维表面功能化；3. 共价有机框架表面功能化固相萃取整体柱的制备：取14.06 mg的1,3,5-三(4-氨苯基)苯与11.17 mg的2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛，加入至5ml乙腈配置成共价有机框架反应液；再将共价有机框架反应液、12 mol/l乙酸水溶液与完成表面功能化的基质整体柱分别放入冰箱在4℃下预冷2小时，接着取1.0 ml共价有机框架反应液，加入60 μl12 mol/l乙酸水溶液，震荡混匀，用微量注射泵将其注入完成表面功能化的基质整体柱中，注满密封后，放入60℃水浴反应；1小时后将柱子取出自然冷却10分钟，按前述的方法从反方向再次注入共价有机框架反应液与乙酸水溶液的混合液，注满密封后，再次放入60℃水浴反应；重复上述操作3次；最后一次注入完毕后，不锈钢柱置于60℃水浴中反应12小时，使其充分反应；反应结束后，以乙腈为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱2小时，即得到共价有机框架表面功能化固相萃取整体柱。
9.2）管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tube spme-hplc）在线联用系统的构建：所述的管内固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统由微萃取和分析两部分组成，结构如附图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（v1）、一台液相色谱输液泵（泵a）、0.5 ml定量环。分析部分包括：一台液相色谱输液泵（泵b）、一个六通阀（v2）、共价有机骨架表面功能化固相微萃取整体柱、c18 分析柱、二极管阵列检测器。
10.3）苯二氮卓类新型毒品在线联用检测：1. 平衡：首先，六通阀v1和v2都在load位置。装载液通过泵a平衡共价有机骨架表
面功能化固相微萃取整体柱，流速为0.05 ml/min。流动相通过泵b直接经分析柱以获得色谱分离要求的稳定基线，流速为1.0 ml/min。同时，通过进样针将样品溶液注满定量环。
11.2. 在线富集萃取：当六通阀v1调至inject位置，固相微萃取开始，定量环中的样品经由装载液带入固相微萃取整体柱，经过10分钟，六通阀v1调回load位置，装载液继续冲洗固相微萃取整体柱90 秒以消除残留的样品溶液，降低其干扰。
12.3. 在线洗脱：先将泵b流动相流速调整为0.1 ml/min，再将六通阀v2调节至inject位置，利用流动相将固相微萃取整体柱上富集的分析对象洗脱到分析柱前端，洗脱时间为150秒。
13.4. 检测：当洗脱完成时，将六通阀v2调节至load位置，同时设置泵b流速为1.0 ml/min，通过分析柱将洗脱下来的分析对象进行分离，再利用检测器进行检测。
14.所述的装载液组成为：按体积分数比计，乙腈/水=90%/10%；所述的流动相组成为：按体积分数比计，乙腈/1%三氟乙酸水溶液=60%/40%；所述的分析柱为c18分析柱；检测波长：229 nm；柱温箱温度：40℃。
15.本发明的显著优点在于：1）利用聚对苯二胺表面存在的大量氨基基团提高了固相微萃取柱整体表面共价有机框架的覆盖率，增强了整体柱与苯二氮卓类化合物之间的π-π堆积作用和疏水相互作用，提高了苯二氮卓类新型毒品的萃取效率。
16.2）本发明利用共价有机框架表面功能化固相萃取整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种苯二氮卓类新型毒品在线固相微萃取高效液相色谱联用检测方法，实现了实际体液样品和饮料样品中微量苯二氮卓类化合物的高效富集萃取与高灵敏在线检测。
17.3）本发明方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广。
附图说明
18.图1是管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tube spme-hplc）在线联用系统的结构示意图。
19.图2是以共价有机框架表面功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，构建的管内固相微萃取-高效液相色谱 (in-tube spme-hplc) 在线联用系统对六种苯二氮卓类新型毒品（硝西泮，艾司唑仑，奥沙西泮，三唑仑，地西泮，氟硝西泮）检测的相关运行参数优化图。其中，a是装载液中乙腈含量的优化，b是装载液中三氟乙酸含量的优化，c是洗脱体积的优化。
20.图3是以共价有机框架表面功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，构建管内固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，检测不同样品中添加的6种苯二氮卓类新型毒品的色谱分离图。其中，a为50 ng/ml 6种苯二氮卓类新型毒品混合标准溶液；b为纯净水样品中加标50 ng/ml 6种苯二氮卓类新型毒品；c为唾液样品中加标50 ng/ml 6种苯二氮卓类新型毒品；d为可乐样品中加标50 ng/ml 6种苯二氮卓类新型毒品。峰识别：1，硝西泮；2，艾司唑仑；3，奥沙西泮；4，三唑仑；5，地西泮；6，氟硝西泮。
具体实施方式
21.为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例
22.步骤一、共价有机框架表面功能化固相微萃取整体柱的制备：1.聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）整体柱的制备：1)不锈钢管空柱的清洗：将长度为33 mm，内径为2.1 mm的不锈钢空柱接上液相泵，用色谱纯甲醇在1.0 ml/min流速下冲洗20 分钟，以除去不锈钢管内壁残留的杂质，然置于60 ℃的烘箱中烘干2小时。
23.2)管内自由基共聚：将300 mg 甲基丙烯酸缩水甘油酯，100 mg 乙二醇二甲基丙烯酸酯，120 mg n,n-二甲基甲酰胺，480 mg 1,4-丁二醇，1.2 mg偶氮二异丁腈用旋涡混合器混匀后，室温下超声15分钟（超声频率为40 khz，超声功率为100 w）。然后用注射器将配好的填料注入洗净的不锈钢柱中，放入60 ℃水浴反应24小时；待反应完成后，以甲醇为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱约1小时，以去除床层内残留的致孔剂、未反应的单体以及反应生成的一些低聚物，即得到聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）基质整体柱。
24.2.聚对苯二胺纤维表面功能化整体柱的制备：取2.1628 g对苯二胺与0.4 g氢氧化钠加入20 ml甲醇，用漩涡混合器震荡均匀，室温下超声20分钟（超声频率为40 khz，超声功率为100 w），得到1 mol/l碱性对苯二胺甲醇溶液，随后将该溶液通过微量注射泵注入聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-乙二醇二甲基丙烯酸酯）基质整体柱中，注满密封后，常温反应24小时；反应结束后，先以甲醇为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱1小时，再换成乙腈冲洗1小时，即完成基质整体柱的聚对苯二胺纤维表面功能化；3.共价有机框架表面功能化固相微萃取整体柱的制备：取14.06 mg 1,3,5-三(4-氨苯基)苯与11.17 mg 2,5-二乙烯基-1,4-苯二甲醛，加入至5ml乙腈配置成共价有机框架反应液；再将共价有机框架反应液、12 mol/l乙酸水溶液与完成表面功能化的基质整体柱分别放入冰箱，在4℃下预冷2小时，接着取1.0 ml 共价有机框架反应液，加入60 μl 12 mol/l乙酸水溶液，震荡混匀，用微量注射泵将其注入完成表面功能化的基质整体柱中，注满密封后，放入60℃水浴反应；1小时后将柱子取出自然冷却10分钟，按前述的方法从反方向再次注入共价有机框架反应液与乙酸水溶液的混合液，注满密封后，再次放入60℃水浴反应；重复上述操作3次；最后一次注入完毕后，不锈钢柱置于60℃水浴中反应12小时，使其充分反应；反应结束后，以乙腈为流动相，用液相色谱泵冲洗不锈钢柱2小时，即得到共价有机框架表面功能化固相萃取整体柱。
25.步骤二、管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tube spme-hplc）在线联用系统的构建：所述的管内固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统由微萃取和分析两部分组成，结构如附图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（v1）、一台液相色谱输液泵（泵a）、0.5 ml peek管定量环。分析部分包括：一台液相色谱输液泵（泵b）、一个六通阀（v2）、共价有机骨架表面功能化固相微萃取整体柱、c18 分析柱、二极管阵列检测器。
nm。
37.如图3所示，在纯净水样品（曲线b），唾液样品（曲线c）与可乐样品（曲线d）中，6种苯二氮卓类新型毒品的检测峰都清晰可见，样品基质干扰都比较小；说明本发明提供的共价有机框架表面功能化整体柱具有优良的富集萃取和基质净化能力。本发明建立的苯二氮卓类新型毒品在线固相微萃取高效液相色谱联用检测方法的检测线性范围为1-300 ng/ml，检测限为0.5-1 ng/ml；表明本发明提供的方法可实现实际体液样品和饮料样品中微量苯二氮卓类新型毒品的高效富集萃取与高灵敏在线检测。
38.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。