一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法
技术领域
1.本发明涉及抗原检测方法技术领域，具体为一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法。
背景技术：
2.肿瘤抗原gb3，又名糖鞘脂gb3(globotriaosylceramide)，广泛存在于哺乳动物细胞膜表面，在细胞的生长、分化、信号传导等方面起到非常重要的作用。gb3过量表达与伯基特淋巴瘤的致癌性转化、结肠癌转移有关，许多造血恶性肿瘤和实体瘤表达gb3。
3.细胞膜上的gb3是志贺杆菌毒素（shiga toxin，stx）的受体，与志贺杆菌引起的中毒性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症密切相关。志贺毒素stx是由痢疾志贺菌（shigelladysenteriae）产生的一种重要的致病毒力因子，由具有酶活性的a亚基（stxa）和受体结合作用的b亚基（stxb）两部分构成。志贺毒素b亚基的功能是特异性结合gb3糖类抗原，研究表明志贺杆菌毒素通过其b亚基(stxb)与细胞膜上的gb3结合，胞吞，然后沿着逆转运途径经由胞内体到达高尔基体。
4.志贺毒素b亚基单独存在时不具有志贺毒素的毒性活力，但保持了志贺毒素对gb3糖类抗原的结合特性，因此可以以重组的志贺毒素b亚基蛋白作为gb3识别单位开发肿瘤细胞gb3糖类抗原的检测探针。
5.但是，目前尚无有效的利用以重组的志贺毒素b亚基蛋白作为gb3表达的检测方法的相关报道。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5-1.0 h，再于4-10℃条件下静置孵育12-14 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，进行流式细胞术检测荧光。
8.可选的，s1中，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。
9.可选的，所述生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；
其中，所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。
10.可选的，s1中，所述待测细胞处于对数生长期。
11.可选的，s2中，所述摇床进行振荡孵育时的频率为100-200 rpm。
12.可选的，s3中，所述流式细胞仪的激光波长为605
±
5nm。
13.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：本发明通过先振荡孵育提高肿瘤抗原gb3与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针结合的数量，并通过后静置孵育减少非特异结合，显著提高肿瘤抗原gb3表达的检测效果。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例1：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5 h，振荡孵育的频率为100rpm，再于4℃条件下静置孵育12 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
16.实施例2：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5 h，振荡孵育的频率为150 rpm，再于4℃条件下静置孵育12 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
17.实施例3：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育1.0 h，振荡孵育的频率为200 rpm，再于4℃条件下静置孵育14 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
18.在实施例1-3中，基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，羧基端修饰为：在志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。
19.实施例1-3均可观察细胞受激光激发后是否发出紫外或蓝光，如果观察到紫外或蓝光，则说明细胞含有肿瘤抗原gb3。
20.将待测细胞先振荡孵育，使得待测细胞先与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针混合均均，提高肿瘤抗原gb3与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针结合的数量；后静置孵育，有利于减少非特异结合。采用先振荡孵育后静置孵育有利于提高肿瘤抗原gb3表达的检测效果。
21.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5-1.0h，再于4-10℃条件下静置孵育12-14h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，进行流式细胞术检测荧光。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s1中，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。3.根据权利要求2所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，所述生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；其中，所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。4.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s1中，所述待测细胞处于对数生长期。5.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s2中，所述摇床进行振荡孵育时的频率为100-200rpm。6.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s3中，所述流式细胞仪的激光波长为605
±
5nm。
技术总结
本发明涉及抗原检测方法技术领域，具体为一种肿瘤抗原Gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：S1、孵育细胞；S2、离心清洗；S3、荧光检测。本发明操作简单，通过先振荡孵育提高肿瘤抗原Gb3与基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针结合的数量，并通过后静置孵育减少非特异结合，显著提高肿瘤抗原Gb3表达的检测效果。显著提高肿瘤抗原Gb3表达的检测效果。
技术研发人员：袁脉 施杰
受保护的技术使用者：无锡麦迪科思生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2022/4/29
技术领域
1.本发明涉及抗原检测方法技术领域，具体为一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法。
背景技术：
2.肿瘤抗原gb3，又名糖鞘脂gb3(globotriaosylceramide)，广泛存在于哺乳动物细胞膜表面，在细胞的生长、分化、信号传导等方面起到非常重要的作用。gb3过量表达与伯基特淋巴瘤的致癌性转化、结肠癌转移有关，许多造血恶性肿瘤和实体瘤表达gb3。
3.细胞膜上的gb3是志贺杆菌毒素（shiga toxin，stx）的受体，与志贺杆菌引起的中毒性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症密切相关。志贺毒素stx是由痢疾志贺菌（shigelladysenteriae）产生的一种重要的致病毒力因子，由具有酶活性的a亚基（stxa）和受体结合作用的b亚基（stxb）两部分构成。志贺毒素b亚基的功能是特异性结合gb3糖类抗原，研究表明志贺杆菌毒素通过其b亚基(stxb)与细胞膜上的gb3结合，胞吞，然后沿着逆转运途径经由胞内体到达高尔基体。
4.志贺毒素b亚基单独存在时不具有志贺毒素的毒性活力，但保持了志贺毒素对gb3糖类抗原的结合特性，因此可以以重组的志贺毒素b亚基蛋白作为gb3识别单位开发肿瘤细胞gb3糖类抗原的检测探针。
5.但是，目前尚无有效的利用以重组的志贺毒素b亚基蛋白作为gb3表达的检测方法的相关报道。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5-1.0 h，再于4-10℃条件下静置孵育12-14 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，进行流式细胞术检测荧光。
8.可选的，s1中，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。
9.可选的，所述生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；
其中，所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。
10.可选的，s1中，所述待测细胞处于对数生长期。
11.可选的，s2中，所述摇床进行振荡孵育时的频率为100-200 rpm。
12.可选的，s3中，所述流式细胞仪的激光波长为605
±
5nm。
13.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：本发明通过先振荡孵育提高肿瘤抗原gb3与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针结合的数量，并通过后静置孵育减少非特异结合，显著提高肿瘤抗原gb3表达的检测效果。
具体实施方式
14.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.实施例1：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5 h，振荡孵育的频率为100rpm，再于4℃条件下静置孵育12 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
16.实施例2：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5 h，振荡孵育的频率为150 rpm，再于4℃条件下静置孵育12 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
17.实施例3：本发明提供了一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及处于对数生长期的待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育1.0 h，振荡孵育的频率为200 rpm，再于4℃条件下静置孵育14 h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，通过流式细胞仪发出波长为605nm的激光激发细胞。
18.在实施例1-3中，基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，羧基端修饰为：在志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。
19.实施例1-3均可观察细胞受激光激发后是否发出紫外或蓝光，如果观察到紫外或蓝光，则说明细胞含有肿瘤抗原gb3。
20.将待测细胞先振荡孵育，使得待测细胞先与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针混合均均，提高肿瘤抗原gb3与基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针结合的数量；后静置孵育，有利于减少非特异结合。采用先振荡孵育后静置孵育有利于提高肿瘤抗原gb3表达的检测效果。
21.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：s1、孵育细胞：将基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针以及待测细胞置于摇床，先于室温条件下振荡孵育0.5-1.0h，再于4-10℃条件下静置孵育12-14h，得到悬浮培养的细胞；s2、离心清洗：将悬浮培养的细胞置于离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入pbs缓冲液洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，弃上清，加入200微升pbs缓冲液重悬细胞；s3、荧光检测：将细胞加入流式管后置于流式细胞仪中，进行流式细胞术检测荧光。2.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s1中，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针由生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白和链酶亲和素标记量子点偶联形成，所述基于志贺毒素b亚基重组蛋白的探针的浓度为5-50nm。3.根据权利要求2所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，所述生物素化志贺毒素b亚基重组蛋白由以下组分经体外酶法融合修饰获得：志贺毒素b亚基重组蛋白和生物素化短肽；其中，所述志贺毒素b亚基重组蛋白由志贺毒素b亚基蛋白经羧基端修饰获得，所述羧基端修饰为：在所述志贺毒素b亚基蛋白的羧基端修饰myc标签、转肽酶a识别位点、his标签序列。4.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s1中，所述待测细胞处于对数生长期。5.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s2中，所述摇床进行振荡孵育时的频率为100-200rpm。6.根据权利要求1所述的一种肿瘤抗原gb3表达的检测方法，其特征在于，s3中，所述流式细胞仪的激光波长为605
±
5nm。
技术总结
本发明涉及抗原检测方法技术领域，具体为一种肿瘤抗原Gb3表达的检测方法，包括以下检测步骤：S1、孵育细胞；S2、离心清洗；S3、荧光检测。本发明操作简单，通过先振荡孵育提高肿瘤抗原Gb3与基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针结合的数量，并通过后静置孵育减少非特异结合，显著提高肿瘤抗原Gb3表达的检测效果。显著提高肿瘤抗原Gb3表达的检测效果。
技术研发人员：袁脉 施杰
受保护的技术使用者：无锡麦迪科思生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2022/4/29
再多了解一些
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