一种乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测方法与流程

1.本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测方法。


背景技术：

2.拟除虫菊酯类农药是一类在天然产物除虫菊酯结构基础上改造而来的杀虫剂，已在全世界广泛使用。虽然拟除虫菊酯具有较低的毒性，但作为神经毒物，研究显示其可能对内分泌功能具有干扰作用，与肿瘤存在一定的相关性。若其残留在食品中，存在威胁人类健康的风险。
3.为了保障食品安全和人民健康，2019年国家发布的gb 2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了生乳中联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯等6个拟除虫菊酯类农药的最大残留限量，分别为0.2mg/kg、0.2mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.02mg/kg及0.1mg/kg。然而，其所给定的检测方法存在一些局限，如：氯氟氰菊酯和氯氰菊酯可参照gb/t 23210-2008的方法执行，实验过程中需要消耗大量的有机试剂，步骤也比较繁琐，需要使用旋转蒸发仪浓缩溶剂；氟氯氰菊酯和醚菊酯无推荐的检测方法。此外，gb 23200.85-2016提供了乳及乳制品中多种拟除虫菊酯的检测方法，整个实验需要进行两次固相萃取柱净化和三次氮吹浓缩，耗时耗力。调研现有文献的前处理方法主要有基质固相分散法(如：陈美瑜,《分析测试学报》，2019)、固相微萃取法(如：朱捷,《中国食品卫生杂志》，2007)、固相萃取柱法(如：宋瑶,《中国乳品工业》，2016)、quechers法(如：高晓昇，《中国奶牛》，2010)等，上述的方法存在操作不方便、溶剂使用量较多、前处理时间长、适用乳品基质范围窄等一个或多个缺点。因此，乳品中联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯及氰戊菊酯含量测定的方法仍有待开发和改进。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测方法，通过采用酸化的有机溶剂促使乳制品中的蛋白沉淀，从而更好地除去杂质，使得提取的拟除虫菊酯类农药的纯度更高，检测结果更快速、准确。
5.根据本发明的一个方面，提供一种乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测方法，包括以下步骤：
6.将待测样品与酸化的第一有机溶剂混合得到混合物，以提取所述待测样品中残留的拟除虫菊酯类农药；
7.向所述混合物中添加氯化钠，混合均匀后进行离心，收集上清液；
8.对所述上清液进行固相萃取，并收集全部流出液；
9.将所述流出液吹干，用第二有机溶剂复溶，过滤得到滤液；
10.将所述滤液用气相色谱-串联质谱测定。
11.优选地，所述第一有机溶剂为乙腈和乙酸乙酯中的一种或多种，用于酸化所述第
一有机溶剂的酸为甲酸和乙酸中的一种或两种；所述第二有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯和丙酮中的一种或多种。
12.优选地，所述酸的用量为所述第一有机溶剂质量的0.2-0.6％。
13.优选地，氯化钠的用量为每1g待测样品对应0.25-1.0g氯化钠。
14.优选地，所述拟除虫菊酯类农药包括联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯中的一种或多种。
15.优选地，所述乳制品为液态奶、奶粉、酸奶或奶酪。
16.优选地，固相萃取步骤采用oasis prime hlb固相萃取柱。
17.优选地，所述oasis prime hlb固相萃取柱的填料规格为60mg、150mg或200mg中的任意一种，并且无需活化直接使用
18.优选地，离心步骤在4-10℃的条件下进行。
19.优选地，气相色谱-串联质谱测定的质谱参数条件如下：
20.对于联苯菊酯，离子对为选自181.0》165.9、181.0》179.0和165.1》163.6中的两个或三个；
21.对于氯氟氰菊酯，离子对为选自208.1》180.9、180.9》151.9和197》141.1中的两个或三个；
22.对于氟氯氰菊酯，离子对为选自226》206、163》127和163》91.1中的两个或三个；
23.对于氯氰菊酯，离子对为选自163》127、163》91.1和180.9》151.9中的两个或三个；
24.对于醚菊酯，离子对为选自163.1》107.1、163.1》135.1和163.1》77.1中的两个或三个；
25.对于氰戊菊酯，离子对为选自167》125、125》89和167》89中的两个或三个。
26.根据本发明的测定方法前处理操作简单、耗时短，所使用的有机溶剂较少，而且提取及分离效果好，检测结果快速、准确，具有很强的应用价值。
附图说明
27.参考随附的附图，本发明更多的目的、功能和优点将通过本发明实施方式的如下描述得以阐明，其中：
28.图1为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的联苯菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
29.图2为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的氯氟氰菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
30.图3为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的氟氯氰菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
31.图4为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的氯氰菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
32.图5为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的醚菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
33.图6为实施例1的牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度下的氰戊菊酯选择反应监测(srm)色谱图；
34.图7为对比例1中50μg/kg浓度下不同比例甲酸乙腈所对应的农药残留回收率；
35.图8为对比例2中50μg/kg浓度下不同质量的氯化钠所对应的农药残留回收率；
36.图9为对比例3中50μg/kg浓度下不同规格固相萃取柱所对应的农药残留回收率。
具体实施方式
37.为了更加清楚地理解本发明的技术特征、目的和有益效果，现对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。应理解，以下具体实施方式仅是示例性的，本发明的技术方案不限于以下所列举的具体实施方式。
38.本发明提供的乳制品中拟除虫菊酯类农药残留的检测方法，包括提取步骤、离心分离步骤、固相萃取步骤、复溶步骤和测定步骤。
39.本发明检测的乳制品可为液态奶、奶粉、酸奶或奶酪。拟除虫菊酯类农药包括联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯中的一种或多种，优选同时检测这六种农药成分。
40.其中，提取步骤包括将待测样品与酸化的第一有机溶剂混合得到混合物，以提取所述待测样品中残留的拟除虫菊酯类农药。
41.第一有机溶剂为乙腈和乙酸乙酯中的一种或多种，优选为乙腈。用于酸化所述第一有机溶剂的酸为甲酸和乙酸中的一种或两种，优选甲酸。其中，酸的用量为第一有机溶剂质量的0.2-0.6％，优选为0.2-0.4％。
42.离心分离步骤包括向提取步骤得到的混合物加入氯化钠，优选通过涡旋振荡后，离心分离收集上清液。优选在10000r/min下进行离心分离。该离心分离步骤在低温条件下进行，较佳地在4-10℃下进行。
43.固相萃取步骤包括将上述上清液通过固相萃取柱。优选地，上清液直接转移至固相萃取柱上，收集全部流出液。该固相萃取柱为沃特世科技(上海)有限公司商品化的oasis prime hlb固相萃取柱，填料规格较佳地为60mg、150mg或200mg中任意一种，最佳地为60mg。
44.复溶步骤包括将上述流出液吹干，优选用氮气吹干，以除去流出液中的酸化第一有机溶剂，具体地，氮气吹干温度可为40℃；以及流出液经吹干后用第二有机溶剂复溶。第二有机溶剂可为正己烷、乙酸乙酯和丙酮中的一种或多种。1、测定步骤用气相色谱-串联质谱仪检测。质谱参数的条件较佳地如表1所示。每一种拟除虫菊酯类农药的质谱参数条件至少包括表1中的两对离子对，最佳地，一对为定量离子对，另一对或两对为定性离子对。表1
45.综上所述，本发明的拟除虫菊酯类农药残留测定方法，前处理方法操作简单、快速、环保、经济。相比于国标gb/t 23210-2008而言，提取过程使用的有机溶剂量较少，离心分离所得的上清液无需浓缩就可直接上样进行固相萃取。相比于国标gb 23200.85-2016而言，整个过程只需一次过柱，一次溶剂浓缩，所使用的固相萃取柱无需活化即可使用，上清液转移至固相萃取柱后，采用吸附杂质的原理，直接收集过滤所得的有机溶液，进一步简化了实验步骤，节约了有机溶剂的使用。
46.此外，相比于现有技术的方法而言，本发明的检测方法同时具备了操作简单、溶剂使用量少、前处理时间短、适用的待测样品种类范围广等特点。本发明采用的是气相色谱-串联质谱仪检测，可较好地减少基质干扰，检测结果快速、准确，可同时检测乳品中联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯及氰戊菊酯等6种拟除虫菊酯类农药残留，具有很强的应用价值。
47.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
48.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
49.实施例
50.实施例1
51.(1)试剂：
52.水：符合gb/t 6682规定的一级水；
53.乙腈：农残级；
54.正己烷：农残级；
55.乙酸乙酯：农残级。
56.(2)标准品溶液的配制：
57.联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯及氰戊菊酯标准品：浓度为0.1mg/ml。
58.6种拟除虫菊酯类农药混合标准品工作液：分别准确量取各标准品溶液1.0ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至10ml后混匀，配制成浓度为10μg/ml混合标准品中间液；进一步取标准品中间液1.0ml于10ml容量瓶中，用正己烷定容至10ml，即得浓度为1μg/ml混合标准品工作液。4℃及低于4℃温度保存，有效期1个月。
59.(3)样品前处理：
60.称取2.0g纯牛奶于30ml具塞离心管中，经10ml 0.2％甲酸乙腈混合后，涡旋振荡5min提取目标物；在上述混合物中加入1.0g氯化钠，涡旋振荡5min，在4℃，10000r/min条件下离心5min，收集上清液5ml；将上述上清液直接转移到oasis prime hlb固相萃取柱上，收集全部流出液；所得流出液在40℃水浴中用氮气吹至近干，加入1.0ml正己烷溶液复溶，过0.22μm滤膜，供气相色谱-串联质谱仪测定。
61.(4)测定条件：
62.色谱条件
63.色谱柱：5％苯基-甲基聚硅氧烷石英毛细管色谱柱(hp-5ms)；色谱升温程序：40℃保持1.5min，以25℃/min程序升温至90℃，保持1.5min，以25℃/min程序升温至180℃，以5℃/min程序升温至300℃，保持5min；进样方式：不分流进样。
64.质谱条件
65.电离方式：电子轰击源(ei)；监测方式：选择反应监测(srm)，6个拟除虫菊酯类农药的定量离子对、定性离子对和碰撞电压如上述发明内容中表1所示；6个拟除虫菊酯类农药的选择反应监测(srm)色谱图以牛奶基质标准曲线中250ng/ml浓度点的谱图进行展示，所对应的谱图见图1至图6。
66.(5)标准曲线的绘制
67.空白基质溶液氮气吹干，加入一定体积的混合标准品工作液，用正己烷稀释定容至1.0ml，配制成浓度依次为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和250ng/ml的系列基质混合标准工作溶液，供气相色谱-质谱联用仪测定，以目标化合物定量离子峰面积为纵坐标，目标化合物标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。
68.(6)样品测定
69.待测样液进样，得到目标物的峰面积，根据标准曲线求得对应的上机浓度。
70.(7)结果计算
[0071][0072]
式中：
[0073]
x
---
试样中被测组分残留量，μg/kg；
[0074]c---
从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，ng/ml；
[0075]v---
样品溶液定容体积，ml；
[0076]m---
样品溶液所代表试样的质量，g；
[0077]f---
稀释倍数；
[0078]
1000
--
换算系数。
[0079]
(8)方法定量限验证
[0080]
结合样品，用空白基质样品添加不同质量浓度标准溶液，通过气相色谱-串联质谱仪测定信噪比等于10所对应的浓度，最终确定的定量限为5μg/kg。
[0081]
(9)标准曲线和线性验证
[0082]
由实施例1(5)标准曲线的绘制得到6种拟除虫菊酯类农药的标准曲线和相关系数，如表2所示。表2化合物标准曲线相关系数联苯菊酯y＝4.391*105x 1.299*1050.9998氯氟氰菊酯y＝1.066*105x 9.059*1040.9997氟氯氰菊酯y＝5.746*104x 3.188*1040.9995氯氰菊酯y＝8.869*104x 5.468*1040.9996醚菊酯y＝3.496*105x 5.647*1040.9994氰戊菊酯y＝1.462*105x 6.026*1040.9997由表2可知，6种拟除虫菊酯类农药的浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9900，符合gb/t 27404-2008的要求。(10)回收率和精密度验证取空白纯牛奶样品分别添加1倍、2倍和10倍定量限三水平(n＝6)进行加标回收实验。以下是加标样品测定结果、回收率和精密度，如表3所示。表3
[0083]
由表3可知，加标量为5μg/kg、10μg/kg和50μg/kg时，6种拟除虫菊酯类农药的回收率范围为62.4-108％，93.6-109％和73.5-90.0％，方法回收率符合gb/t27404-2008的要求；6种拟除虫菊酯类农药的相对标准偏差范围为3.4-13％，2.6-5.1％和3.1-5.7％，方法精密度符合gb/t 27404-2008的要求。
[0084]
实施例2
[0085]
本实施例选用市售某品牌奶粉，进行农药残留添加回收率实验。具体方法如下：
[0086]
称取2.0g奶粉于30ml具塞离心管中，向其加入实施例1的混合标准溶液，充分混匀后得质量浓度为50μg/kg的待测奶粉样品。加5ml纯水混匀，经10ml0.2％甲酸乙腈混合后，涡旋振荡5min提取目标物；在上述混合物中加入1.0g氯化钠，涡旋振荡5min，在4℃，10000r/min条件下离心，收集上清液5ml；将上述上清液直接转移到oasis prime hlb固相萃取柱上，收集全部流出液；所得流出液在40℃水浴中用氮气吹至近干，加入1.0ml正己烷溶液复溶，过0.22μm滤膜，供气相色谱-串联质谱仪测定。
[0087]
色谱条件和质谱条件具体与实施例1中相同。
[0088]
基质标准曲线使用空白奶粉基质，配制过程与实施例1中相同。
[0089]
通过气相色谱-串联质谱测定的结果如表4所示。表4
[0090]
实施例3本实施例选用市售某品牌酸奶，进行农药残留添加回收率实验。具体方法如下：称取2.0g待测酸奶于30ml具塞离心管中，向其加入实施例1的混合标准溶液，充分混匀后得质量浓度为50μg/kg的待测酸奶样品。加3ml纯水混匀，经10ml0.2％甲酸乙腈混合后，涡旋振荡5min提取目标物；在上述混合物中加入1.0g氯化钠，涡旋振荡5min，在4℃，10000r/min条件下离心，收集上清液5ml；将上述上清液直接转移到oasis prime hlb固相萃取柱上，收集全部流出液；所得流出液在40℃水浴中用氮气吹至近干，加入1.0ml正己烷溶液复溶，过0.22μm滤膜，供气相色谱-串联质谱仪测定。色谱条件和质谱条件具体与实施例1中相同。基质标准曲线使用空白酸奶基质，配制过程与实施例1中相同。通过气相色谱-串联质谱测定的结果如表5所示。表5
[0091]
实施例4本实施例选用市售某品牌奶酪，进行农药残留添加回收率实验。具体方法如下：称取2.0g待测奶酪于30ml具塞离心管中，向其加入实施例1的混合标准溶液，充分混匀后得质量浓度为50μg/kg的待测奶酪样品。加10ml纯水混匀，经10ml0.2％甲酸乙腈混合后，涡旋振荡5min提取目标物；在上述混合物中加入1.0g氯化钠，涡旋振荡5min，在4℃，10000r/min条件下离心，收集上清液5ml；将上述上清液直接转移到oasis prime hlb固相萃取柱上，收集全部流出液；所得流出液在40℃水浴中用氮气吹至近干，加入1.0ml正己烷溶液复溶，过0.22μm滤膜，供气相色谱-串联质谱仪测定。色谱条件和质谱条件具体与实施例1中相同。基质标准曲线使用空白奶酪基质，配制过程与实施例1中相同。通过气相色谱-串联质谱测定的结果如表6所示。表6
[0092]
对比例1
[0093]
以与实施例1相同的方法进行测定6种拟除虫菊酯类农残的回收率，区别在于步骤(2)中酸化乙腈的甲酸含量不同。具体地，在本对比例中所使用的酸化乙腈的甲酸含量分别为0.2％、0.4％和0.6％。实验结果如图7所示。
[0094]
比较图7中的数据可看出，酸化乙腈的甲酸含量为0.2％时，目标物的回收率最佳，联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯的平均回收率依次为
80.1％、89.3％、88.9％、86.6％、78.9％和85.0％。
[0095]
对比例2
[0096]
以与实施例1相同的方法进行测定6种拟除虫菊酯类农残的回收率，区别在于步骤(2)中使用的氯化钠质量不同。具体地，在本对比例中所使用的氯化钠质量分别为0.5g、1.0g、1.5g和2.0g。实验结果如图8所示。
[0097]
比较图8中的数据可看出，使用的氯化钠质量为1.0g时，目标物的回收率最佳，联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯的平均回收率依次为88.6％、92.8％、91.8％、92.0％、90.0％和90.1％。
[0098]
对比例3
[0099]
以与实施例1相同的方法进行测定6种拟除虫菊酯类农残的回收率，区别在于步骤(3)中使用的oasis prime hlb固相萃取柱填料规格不同。具体地，在本对比例中所使用的固相萃取柱填料规格分别为60mg、150mg和200mg。实验结果如图9所示。
[0100]
比较图9中的数据可看出，使用的固相萃取柱填料规格分别为60mg时，目标物的回收率最佳，联苯菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、醚菊酯和氰戊菊酯的平均回收率依次为84.9％、90.8％、85.7％、86.9％、84.5％和86.1％。
[0101]
以上所述仅仅是本发明的优选实施方式。应当指出的是，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域技术人员可对本发明的细节和特征进行各种修改、组合、变更或替换。这些修改、组合、变更或替换也应理解为包括在本发明要求保护的范围之内。