使用网络分析作为用于治疗人类皮肤生态失调的工具的制作方法

1.本发明为人体微生物组领域，特别是用于治疗影响人类皮肤的生态失调病症的网络分析领域。


背景技术：

2.人体微生物组的结构和功能特征在很大程度上受到微生物-微生物以及微生物-宿主相互作用的影响。了解微生物间以及微生物与宿主之间的相互作用对于了解微生物组的功能是至关重要的。网络理论是一种用于对复杂生物体系如微生物群进行建模的方法，该复杂生物体系在成员之间有多方面的相互作用。作为致力于孤立的微生物个体成员的传统方法的补充，网络理论提供了一种致力于微生物组群落内的多微生物相互作用以及与其宿主的相互作用的整体方法。基于网络的分析方法使得研究人员能够在单网络中对复杂多微生物相互作用进行建模和分析。
3.在微生物体系的典型的基于关联的网络模型中，网络节点代表类群(taxa)，并且边缘代表所限定群体中样本间的类群之间的正或负关联。微生物组网络分析可以包括描述微生物群落的结构特征，以及网络的关键拓扑，如中心节点、连接器和模块。微生物组群落构建是由动态的生态和进化过程驱动的。将网络理论应用于微生物组研究可有助于揭露群落构建或稳定性所必需的微生物关系，以及对宿主的潜在病原学影响。已知群落中的相互作用水平可以预测生态稳定性和弹性度。特定微生物属丰度的突然变化可能是从健康状态向患病状态转变的信号，或者反之亦然。
4.广泛的方法已被用于构建微生物组网络。最受欢迎的方法是基于相关的技术，以通过计算相关系数如皮尔逊相关系数或斯皮尔曼非参数秩相关系数来发现显著的成对关联。然而，这些方法对微生物组数据的局限包括由组成性所致的不适当相关，以及由零计数的质量所致的严重动力不足。对基于相关的分析的关注已导致开发出对组成性稳健的方法。sparcc(用于成分数据的稀疏相关，sparse correlations for compositional data)是使用对数变换分量之间的线性皮尔逊相关来推断成分数据中的关联的方法学。spiec-easi(用于生态关联推理的稀疏逆协方差估计，sparse inverse covariance estimation for ecological association inference)是另一种用于微生物生态网络推理的统计方法，其将开发用于成分数据分析的数据转换与图模型推理框架相结合，假设底层生态关联网络是稀疏的。
5.wo 14205088 a1(prodermiq)公开了一种表征受试者的皮肤或皮下组织的微生物组的方法。该方法包括a)从受试者的皮肤或皮下组织获得包含多种微生物的样本；以及b)分析和分类(a)的多种微生物以表征受试者的微生物组，从而表征受试者的微生物组。在一些实施方案中，该方法还包括将受试者的微生物组与参考微生物组进行比较，或者生成受试者的微生物组概况，或者鉴定受试者所患有的或处于发展风险中的疾病或障碍，或者向受试者提供个性化治疗方案。在各种实施方案中，参考微生物组被分类为具有健康概况，并且受试者的微生物组与参考微生物组之间的相似性将受试者的微生物组鉴定为具有健康
概况。或者，参考微生物组被分类为患有疾病或障碍或者处于患有疾病或障碍的风险中，并且受试者的微生物组与参考微生物组之间的相似性将受试者的微生物组鉴定为患有疾病或障碍或者处于患有疾病或障碍的风险中。
6.nakatsuji t.antimicrobials from human skin commensal bacteria protect against staphylococcus aureus and are deficient in atopic dermatitis.sci transl med.2017年2月22日；9(378)公开了微生物组可以通过影响适应性和先天免疫功能两者来促进或破坏人类健康。作者测试了通常存在于人类皮肤上的细菌是否通过杀伤金黄色葡萄球菌(s.aureus)来参与宿主防御，该金黄色葡萄球菌是一种通常在患有特应性皮炎(ad)的患者中发现的病原体，并且是加重该疾病的重要因素。对从健康和ad受试者的皮肤收集的凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative staphylococcus)(cons)的分离株，执行针对金黄色葡萄球菌的抗微生物活性的高通量筛选。具有抗微生物活性的cons菌株在正常群体中是常见的，但在ad受试者中是罕见的。具有抗微生物活性的菌株的低频率与金黄色葡萄球菌定殖相关联。抗微生物活性被鉴定为此前未知的抗微生物肽(amp)，所述抗微生物肽由包括表皮葡萄球菌(s.epidermidis)和人葡萄球菌(s.hominis)在内的cons物种产生。这些amp是菌株特异性的，高效的，选择性杀伤金黄色葡萄球菌，并且与人类amp ll-37协同作用。将这些cons菌株应用于小鼠证实了它们相对于应用非活性菌株而言的体内防御功能。引人注目地，向患有ad的人类受试者重新引入抗微生物cons菌株减少了金黄色葡萄球菌的定殖。这些发现显示了共生皮肤细菌如何对抗病原体，并且展示了皮肤微生物组的生态失调可能如何导致疾病。
7.us 2018311144 a(naturacosmeticos s a)公开了一种用于皮肤美容处理的益生菌美容制剂，其包含微生物群，并优选地甜菜碱和/或益生元剂。
8.wo 11022660 a1(vedanta biosciences)公开了诊断和治疗微生物组相关疾病或者改善健康的方法，其使用相互作用网络参数来分析微生物之间以及微生物与宿主之间的相互作用网络，以确定重要的(例如，“高度相关的”)生物体或分子，如由各种网络参数所确定。所提供的方法包括和超出相关性，以使用这些重要的(例如，“高度相关的”)生物体或分子作为用于调节的靶标或作为治疗剂来改善健康。该出版物还公开了含有源自这些重要的“高度相关的”生物体或分子的微生物群调节剂、益生菌、或其他治疗剂以改善健康的产品。
9.该出版物仅考虑了在一种状况下的相关。
10.然而，本发明人认为，遵循这样的方法不能帮助鉴定可能干预受试者的所有潜在的靶生物体。生态失调与非生态失调病症之间的网络参数发生的变化可帮助鉴定一些更潜在的干预靶标。


技术实现要素：

11.根据本发明，公开了一种确定适于治疗人类皮肤生态失调病症的细菌菌株的方法，该方法包括通过计算机进行网络分析以确定所述细菌菌株是否与至少第二细菌菌株在生态失调病症以及非生态失调病症中形成相关性的步骤，其中在所述生态失调病症与所述非生态失调病症之间，所述相关性存在差异，其中所述相关性意指正相关或负相关，并且进一步地其中所述网络由所述细菌菌株和所述第二细菌菌株的丰度的共现分析生成，所述共现分析通过根据16s rrna扩增子的dna测序或全基因组测序方法进行。
具体实施方式
12.如本文所用，术语“包含”涵盖术语“基本上由
……
组成”和“由
……
组成”。当使用术语“包含”时，所列出的步骤或选项不需要是穷举的。除非另外指明，否则以形式“x至y”表示的数值范围应理解为包括x和y。在指定值或量的任何范围时，任何特定的上限值或量可以与任何特定的下限值或量相关联。除了在实施例和比较实验中，或者在另外明确指示的情况下，所有数字应理解为由词语“约”修饰。除非另外指明，否则本文所包含的所有百分比和比率均按重量计算。如本文所用，除非另外指明，不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“所述”意指至少一种、或者一种或多种。在以上各个部分中提及的本发明的各种特征适当地适用于已作必要修正的其他部分。因此，在一个部分中指定的特征可以适当地与在其他部分中指定的特征组合。任何部分标题的添加仅仅是为了方便，并不旨在以任何方式限制本公开。实施例旨在说明本发明并且不旨在使本发明限于那些实施例本身。
13.术语“微生物群(microbiota)”总体上指与高等生物体(如人类)相关联发现的全部微生物。属于人类的微生物群的生物体可通常分类为细菌、古生菌、酵母和单细胞真核生物，以及病毒和各种寄生虫如蠕虫。
14.术语“微生物组(microbiome)”总体上指全部微生物、它们的遗传因子(基因组)，以及与高等生物体(如人类)相关联发现的环境相互作用。
15.术语“共生体”是指通常对宿主无害，并且也可以与宿主建立互惠关系的生物体。人体含有约100万亿个共生生物体，已表明这些生物体的数目比人体细胞多10倍。
16.术语“微生物来源的组分”是指这样的组分：由微生物群的成员组成，源自微生物群的成员，或者由微生物群的成员产生。组分可为例如微生物、微生物蛋白质、微生物分泌物、或微生物级分。
17.术语“网络”是指组分(宿主或微生物来源的组分)的构造表示，其通过各种方法描述组分的相关。
18.术语“节点”是指网络的图形表示的终点或交叉点。其为如生物体、蛋白质、基因、转录物、或代谢物的元素的抽象化。
19.术语“边缘”是指两个节点之间的链路。链路是节点之间的连接的抽象化，如节点之间的协方差。
20.术语“高度相关的生物体”是指微生物群的关键功能成员，其与网络中的大量节点具有边缘连接。例如，菌种可以执行多种代谢物的生物转化，因此可能影响宿主代谢和宿主健康。
21.术语“宏基因组学”是指对微生物群落直接在其天然环境中进行研究的基因组技术，而无需分离和实验室培养个体物种。
22.网络分析长期以来出现在计算生物学和生物信息学的许多领域，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学，但其尚未广泛用于微生物菌群研究。网络分析可以通过微生物个体之间的相互作用来发现微生物个体之间可能的功能性相关。该方法基于传统生态分析中使用的物种丰度，并且物种间相互作用包括在分析之中。已经有一些研究成功地将网络分析应用于人类微生物群体分析。传统的网络属性(如网络密度)大多忽略网络中节点和边缘的信息。在微生物菌群相互作用网络中，每个节点代表一个物种或一个操作分类单位(otu)，而边缘代表两个物种或otu之间的相互作用。在菌群相互作用网络中，双方之间的负
关系指示两者之间存在抗性或抑制，而正关系指示两者是协同的。这些相互作用存在于菌群网络的功能的实现中。更重要的地位、以及疾病的发生和发展将影响网络功能的实现，从而导致网络中物种之间相互作用的变化。
23.根据本发明的第一方面，公开了一种确定细菌菌株是否为适于治疗人类皮肤生态失调病症的益生菌的方法，该方法包括进行网络分析以确定所述细菌菌株是否与至少第二细菌菌株在生态失调病症以及非生态失调病症中形成相关性的步骤，其中如果所述生态失调病症与所述非生态失调病症之间的所述相关性存在差异，则所述细菌菌株被认为是适合的。
24.优选地，所述生态失调病症与非生态失调病症之间的相关性的差异表现为从较高相关性到较低相关性的转变，或者反之亦然。进一步优选地，相关性在所述生态失调病症中较高，并且在所述非生态失调病症中较低。或者，相关性在所述生态失调病症中较低，并且在所述非生态失调病症中较高。优选的是相关性的差异为至少40％。进一步优选地，相关性是非生态失调皮肤中的总鉴定细菌菌株中的至少前5％。还进一步优选地，相关性是非生态失调皮肤中的总鉴定细菌菌株中的至少前5％，并且所述非生态失调状态与所述生态失调状态之间的相关性差异为至少40％。进一步优选地，在这种情况下，生态失调病症是痤疮。
25.根据本发明的方法，相关性意指正相关或负相关中的任一者。因此，在本发明的一个方面，相关性意指正相关。或者，相关性意指负相关。
26.特别优选的是细菌菌株和所述第二细菌菌株是在人类皮肤上发现的菌株。
27.网络分析
28.优选的是通过spiec-easi版本0.1.2的稀疏逆协方差估计(sparse inverse covariance estimation)进行网络分析。spiec-easi(用于生态关联推理的稀疏逆协方差估计，sparse inverse covariance estimation for ecological association inference)是一种用于由扩增子测序数据集推理微生物生态网络的统计方法，其解决了这两个问题。spiec-easi将开发用于成分数据分析的数据转换与图模型推理框架相结合，其假设底层生态关联网络是稀疏的。为了重构网络，spiec-easi依赖于用于稀疏邻域和逆协方差选择的算法。
29.或者，可通过任何其他等效技术或计算机程序来执行分析。
30.另外，优选的是使用cytoscape(版本3.5.1)来可视化otu网络并计算网络相关性。cytoscape是用于可视化分子相互作用网络的开源软件平台。cytoscape核心分布为数据集成、分析和可视化提供了一组基本特征。此处同样可以使用任何其他可替代的软件程序。优选的是网络分析设置为otu(操作分类单位，operational taxonomic unit)、asv(动作脚本阅读器，action script viewer)、物种或属的水平。更优选地，网络分析设置为otu。
31.进一步优选地，网络分析由所述第一和所述第二细菌菌株的丰度的共现分析而生成，所述共现分析通过经由16s rrna扩增子的dna测序或全基因组测序方法进行。
32.优选地，细菌菌株来自葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、微杆菌属(microbacterium)、methyloversatilis、异常球菌属(deinococcus)、莫拉氏菌属(moraxella)或不动杆菌属(acinetobacter)中的至少一种。
33.类似地，优选的是第二细菌菌株来自食酸菌属(acidovorax)、放线菌属(actinomyces)、芽孢杆菌属(bacillus)、金黄杆菌属(chryseobacterium)、棒状杆菌属
(corynebacterium)、梭形杆菌属(fusobacterium)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、微杆菌属(microbacterium)、甲基杆菌属(methylobacterium)、methyloversatilis、异常球菌属(deinococcus)、微球菌属(micrococcus)、莫拉氏菌属(moraxella)、奈瑟菌属(neisseria)、副球菌属(paracoccus)、普氏菌属(prevotella)、假单胞菌属(pseudomonas)、鞘脂单胞菌属(sphingomonas)、不动杆菌属(acinetobacter)或cutibacterium中的至少一种，其中如果第二细菌菌株的属与所述细菌菌株的属相同，则物种是不相同的；并且其中如果所述属和物种相同，则菌株是不相同的。
34.优选地，生态失调病症包括痤疮、头皮屑、干性皮肤、老化皮肤、色素皮肤或炎症中的至少一种。更优选地，其为痤疮。
35.进一步优选地，当所述生态失调病症是痤疮时，所述细菌菌株来自葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、微杆菌属(microbacterium)、methyloversatilis、异常球菌属(deinococcus)、莫拉氏菌属(moraxella)或不动杆菌属(acinetobacter)。
36.进一步优选地，来自葡萄球菌属的细菌菌株是人葡萄球菌(staphylococcus hominis)或表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)。
37.现在将借助于非限制性实施例来解释本发明。
38.实施例
39.实施例1：
40.下文公开了所遵循的程序。
41.使用直径为18mm的柱体，从35名痤疮受试者以及32名非痤疮受试者获取面部缓冲液擦洗样本(约4ml)。在分析之前，将缓冲液样本储存于-20℃。通过在4℃下离心(10分钟/13,000rpm，eppendorf 5810r)，使缓冲液擦洗样本中的微生物沉淀。使沉淀重悬于180μl新鲜酶裂解缓冲液(20mg/ml溶菌酶(sigma l6876)，处于20mm tris
·
cl，ph 8.0，2mm edta钠和1.2％x-100中)。将混合物在37℃下孵育30分钟，然后加入25μl蛋白酶k和200μl buffer al(不含乙醇)。将其在56℃下进一步孵育30分钟。
42.然后，将100μl酸洗玻璃珠(sigma，g8772)加入管中，并通过mp biomedicals fastprep-24均化(5m/s，45秒，两次)。然后，按照制造商的说明书，使用dna提取试剂盒(qiagen，dneasy blood&tissue kit，69506)从样本中提取dna。对微生物dna的16s rrna基因的可变区v1-v3进行测序用于细菌分类。首先，使用由测序公司推荐的引物对(正向：agagtttgatymtggctcag，反向：attaccgcggctgctgg)，对16s v1-v3基因进行扩增。50μl pcr反应体系由1μl(10μm)的各正向和反向引物、5μl的10xpcr缓冲液、2μl的mgcl2(50mm)、1.5μl的dntp混合物(10mm)、2μl的dna模板、0.2μl的platinum taq dna聚合酶(invitrogen)和35.3μl的分子级水(sigma，w4502)组成。就v1-v3区域而言，使用以下参数扩增样本：94℃2分钟，20个循环：94℃30秒，65℃(每循环下降0.5℃)1分钟；10个循环：94℃30秒，55℃1分钟；以及72℃5分钟。为了降低pcr扩增偏倚，每个样本具有三个平行测定。使用两步pcr方法进行文库构建。第二轮pcr(8个循环)由bgi通过使用具有双索引序列和衔接子的融合引物进行。通过ampure珠纯化产物。通过bioanalyzer(agilent technologies)分析文库的量和质量。仅使用合格的文库在illumina miseq pe300平台上进行测序。
43.使用vsearch v1.9.6，将去噪的测序数据聚类成操作分类单位(otu)，聚类同一性
为0.97，最小聚类大小为10。使用最低公共祖先(lca)方法学，针对silva、ncbi、rdp、ddbj、greengenes、camera、ezbiocloud和embl数据库对otu在分类学上进行分类。
44.将otu表以及相关的代表性序列(选择为otu聚类内最丰富的序列)用作qiime[46]版本1.9.1(quantitative insights into microbial ecology)，即用于分析复杂微生物群落的开源软件包的输入。qiime的输出在r中作为phyloseq对象输入。就属网络而言，将otu(操作分类单位)表在后续分析之前归并到属层级。用于otu网络分析的otu流行率阈值设定为至少50％。
[0045]
通过spiec-easi版本0.1.2的稀疏逆协方差估计(sparse inverse covariance estimation)进行网络分析。该方法由测序数据(高斯图模型)估计逆协方差矩阵。应用lasso方法生成稀疏网络。使用meinshausen和buhlmann(mb)以及stars(规则化选择的稳定性方法，stability approach to regularization selection)选择方法，选择邻域和协方差方法，λ最大阈值为0.01。
[0046]
使用cytoscape(版本3.5.1)来可视化otu网络并计算网络相关性。
[0047]
出于本实验的目的，葡萄球菌属和cutibacterium是健康(非生态失调病症)和痤疮(生态失调病症)微生物组中最丰富的属。
[0048]
为了进一步探索这两个属之间的相互作用，由葡萄球菌属和cutibacterium构建otu的子网络。
[0049]
如表1所汇总，若干otu的相关性在痤疮与非痤疮微生物组之间的子网络中发生改变。
[0050]
otu 722，即痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)的最丰富otu，是痤疮的中心节点。其相对丰度在痤疮与健康状况之间无显著转变，但其与其他细菌的相关性在健康状况下较低(程度＝4)，但相关性在痤疮状况下转变为较高相关性(程度＝8)。
[0051]
我们推测增加的相关性是该菌株在痤疮中致病性的潜在指示。相比之下，表皮葡萄球菌(otu 24)通常被视为皮肤上的共生细菌。在痤疮状况中，其相对丰度增加，但其与其他细菌的相关性降低(程度从10到6)，这表明表皮葡萄球菌在痤疮和健康皮肤中可能具有与痤疮丙酸杆菌不同的生态学作用。
[0052]
我们还观察到，人葡萄球菌(s.hominis)与葡萄球菌属和cutibacterium子网络中的其他细菌具有较高的相关性。
[0053]
人葡萄球菌的otu 2719和otu 227在健康皮肤状况下也高度相关(分别地程度＝9和10)，但在痤疮或生态失调病症下，它们的相关性降低(分别地程度＝5和2)。
[0054]
子网络分析揭示了微生物可能的生态作用，该作用可能不总是以其相对丰度体现。
[0055]
表1
[0056][0057]
注释：在表1中，*p《0.05
[0058]
人葡萄球菌被认为是皮肤的微生物组中的次要物种(平均相对丰度《1％)。因此，如果遵循传统微生物组分析的发现，其功能相关性可能会被忽视。然而，基于表1中所指示的数据，人葡萄球菌可为痤疮皮肤中的有益细菌。
[0059]
实施例2
[0060]
通过遵循实施例1中公开的方法且加以适当修改，观察到潜在有益于治疗痤疮的其他细菌的相对丰度和程度。发现汇总于表2中。
[0061]
表2
[0062][0063]
*p《0.05。