一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物及其制备方法

1.本发明涉及的一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物及其制备方法，属于基因治疗领域。


背景技术：

2.基因治疗是指通过基因转移技术将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的一种生物治疗方法。随着精准医学时代的到来，基因治疗在临床治疗中扮演越来越重要的角色，在已进入临床研究的基因治疗中，肿瘤相关基因治疗占一半以上。
3.用于基因治疗的载体主要有病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)两大类。目前基因治疗还面临着众多的问题和挑战：免疫反应；治疗基因过少；如何发展具有高效、低毒、靶向性的基因导入系统以及多基因病等问题。其中，获得高效、安全的基因导入系统无疑成为基因治疗成功与否的关键。
4.阳离子脂质体具有毒性小，转染效率高，转染范围广的优势，作为非病毒基因载体在基因治疗领域越来越受到重视。目前，应用较为广泛的非病毒基因载体包括裸dna、阳离子聚合物、脂质体等。其中裸dna是最简单的非病毒载体，可将目的基因连接在质粒上，该方法容易制备但转染效率低且易于被体内的核酸酶降解，因此限制了其应用。阳离子聚合物结构通常为线型，其主链或支链均带有正电荷基团，具有高转染、低毒性的优点。但阳离子聚合物与dna结合过于紧密导致dna不能有效释放成为制约其临床应用的瓶颈。而阳离子脂质体的高生物相容性和良好的稳定性，使其在基因治疗领域具有广泛的应用前景。
5.阳离子脂质体主要是由阳离子类脂、带正电的脂质衍生物或天然碱性脂与中性脂质组成。由于阳离子脂质体所带的正电荷，能与基因分子中的磷酸基团通过静电作用相结合，将基因包裹起来并进行有效压缩，形成复合体，使基因更容易透过细胞膜。开发新型高效的阳离子脂质体成为基因治疗领域的研究热点。
6.阳离子类脂的亲水头部区通常由带有正电荷的头部和带负电的离子(平衡阴离子)构成。人们通常认为阳离子脂质体的亲水头部所带正电荷越多，转染效率就越好。所以，常见的亲水头部通常都包含一个或多个氨基基团，从简单的氨基到被烷基或羟烷基基团取代的季铵盐以及杂环头部等，此外也有磷或砷类基团的亲水头部。具有多氨基头部的阳离子脂质体具有质子缓冲效应，可提高基因在细胞中的稳定性。然而，人们发现阳离子类脂的毒性源于其正电性，正电荷密度越大则产生的毒性也会越高，因此，这也给该类阳离子类脂的应用产生了负面的影响。目前所合成的阳离子化合物的头部多以氨基或铵盐为主，通常认为季铵盐型的阳离子头部能够有效地结合核酸，转染效率较高。1991年，gao等人报道了以胆固醇为疏水尾部合成的阳离子类脂dc-chol，并且成功转染细胞，成为最早的胆固醇类类脂。以胆固醇类类脂制备成的脂质体成为体外递送质粒研究领域中应用最为广泛的递送手段。
7.助类脂分子(helper lipid or co-lipid)是阳离子脂质体配方中一种重要的组成部分。在当下的研究中已经越来越不可或缺，其一般为中性类脂分子，如dope、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)和胆固醇(chol)等。这些中性成份起到稳定脂质双层膜结构和降低阳性成份毒性的作用，同时能够有助于脂质构象的转变，这对质粒在细胞内的释放起到十分重要的作用，也是提高阳离子脂质体细胞转染效率的手段之一。其中dope与dopc是双疏水尾链结构的磷脂型中性类脂分子，能促使脂质体具有较强的膜流动性。传统的形成阳离子脂质体的方法是以阳离子类酯为主要成分，辅以助类酯等形成的囊泡。
8.公开号为cn105985386a的发明专利公开了一类蔗糖酯型阳离子类脂及其制备方法，主要合成制备了一类蔗糖酯型阳离子类脂，该合成方法简单，产物收率较高，同时简单讨论该类脂与助类脂混合制备脂质体递送核酸的方法。该发明专利只简单的探讨胆固醇助类脂和蔗糖酯型阳离子类脂的复合，虽然转染效果有了改善，但由于该复合物需递送核酸到细胞内，其毒性、生物相容性和转染效率还是限制了它的运用，而且在递送过程中，胆固醇的不稳定性，可能造成核酸的脱靶。


技术实现要素：

9.本发明设计了一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的制备方法，其解决的技术问题是：（1）通过胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体获得高效、安全的基因导入系统；（2）制备出生物相容性和转染效率更高且毒性更低的阳离子脂质体/基因复合物；（3）制备方法更简单方便，产物的稳定性好。
10.为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物，其特征在于：所述的复合物由胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体和基因组成，所述的基因包覆在所述的胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体的外部。
11.进一步，所述的胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体由胆固醇或者胆固醇胺类化合物与季铵盐型蔗糖酯类脂tsi14复配得到；所述与胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体组合的基因为质粒dna。
12.进一步，所述的胆固醇胺类化合物为胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de）、胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物(db)、胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物(dh)中的一种或多种。
13.一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：阳离子类脂的处理；步骤二：胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体的制备；步骤三：吹膜和干燥；步骤四：水化；步骤五：基因复合物制备。
14.进一步，所述步骤一的具体方法为：准确称取阳离子类脂tsi14 和氯仿，使阳离子类脂充分溶解得到阳离子类脂溶解物a；所述的阳离子类脂tsi14 和氯仿的质量体积比为1:1-5，所述阳离子类脂tsi14 为1mg时，所述氯仿的体积为1ml-5ml；所述步骤二的具体方法为：向步骤一制备得到的阳离子类脂溶解物a中加入胆固
醇或胆固醇胺类化合物，利用旋涡振荡器振荡混匀；所述阳离子类脂溶解物a与所述胆固醇或胆固醇胺类化合物的加入摩尔比为1:1-20:1；所述步骤三的具体方法为：将步骤二所得的产物利用n2吹膜，吹出均匀的膜后，置于真空干燥箱内干燥5h-36h；所述吹出的膜的厚度90μm-100
µ
m；所述步骤四水化的具体方法为：向步骤三得到的产物中缓慢加入的超纯水，在 50hz条件下反复超声振荡5-10次至澄清，最终得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体；所述超声水洗的温度为25℃-65℃；所述步骤五为：将经过步骤四产物胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物均匀混合，然后经过孵育，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
15.进一步，步骤二所述的胆固醇胺类化合物为胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de）、胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物(db)、胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物(dh)中的一种或多种；所述漩涡振荡器的震荡频率为20hz。
16.进一步，步骤四所述的超纯水加入量为1ml-10ml，所述超纯水的温度为25℃-65℃。
17.进一步，步骤五所述胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为1:1-20:1。
18.进一步，步骤五所述的基因为质粒dna。
19.进一步，步骤五所述的孵育温度为15℃-35℃，孵育时间为10 min-40min。
20.关于本发明内在的机理优势：胆固醇是一种广泛应用的助类脂分子，其本身并不形成膜结构，但能以1：1甚至2：1的摩尔比嵌入到磷脂膜中，是一种刚性类脂化合物，具有较强的疏水性和良好的生物相容性。加入胆固醇可以改变脂质体膜的相变，可以降低膜的流动性，进而增加其稳定性，从而改变脂质体的转染效率，降低阳性成分毒性的作用。季铵盐型蔗糖酯类脂（代号为tsi14）在胆固醇作为助类脂的情况下，具有良好的基因递送性能。以胆固醇作疏水尾部能维持脂质体排列有序化，保持脂质双分子层膜的刚性，且胆固醇衍生物脂质体在雾化时表现出很好的稳定性，从而使这些类似物更有利于基因传递。
21.为了进一步提升其性能，本发明利用一系列胆固醇胺类化合物，并将其与蔗糖酯类脂结合或复配，研究其基因递送性能。胆固醇骨架具有良好的亲脂性，用胺类化合物替代胆固醇上的羟基后，亲水基团与胆固醇疏水骨架形成“t”形空间结构，可促使阳离子类脂通过细胞膜，显著提高阳离子脂质载体在体内的基因转染效率。而且，胆固醇是人体自身合成的物质，在人体内大量存在，胆固醇类的阳离子脂质体进入机体后能被机体代谢，不会引起免疫反应，大大降低了毒性。
22.科研人员han等合成了以胆固醇为疏水链的阳离子类脂copa，该类脂具有良好的稳定性且转染效率高于lipo2000。hela细胞毒性实验结果表明细胞存活率在80%以上，较传统脂质体毒性大大降低。
23.本发明一种胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物及其制备方法具有以下有益效果：（1）本发明以压缩基因能力强的季铵盐型蔗糖酯类酯为主要成分，同时结合另一
种阳离子类酯，即具有质子缓冲作用的胆固醇氨基衍生物，形成了一类新型阳离子脂质体。其对比于传统配方也就是阳离子脂质体和助类酯的组合，本发明胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物在转染性能有了明显地提高，并且明显降低了的细胞毒性，在基因治疗领域具有广阔的发展前景。
24.（2）本发明提供的胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物通过水化薄膜法制备，方法简单方便，稳定性好，毒性低，转染效率高，为基因治疗提供了新思路，具有潜在的应用价值。
附图说明
25.图1：为本发明实施例1-实施例4胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体透射电子显微镜对比图；图2：为本发明实施例2-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的zeta电位检测图；图3：为本发明实施例1-实施例6胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的电泳延滞图；图4：为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物在hela细胞中的表达效果图；图5：为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体介导pgfp-n1质粒转染hela细胞绿色荧光强度图；图6：为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物对hela细胞存活率的影响图；图7：为蔗糖酯型阳离子类脂结构式；图8：为本发明加入的胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物de结构式；图9：为本发明加入的胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物db结构式；图10：为本发明加入的胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物dh结构式。
具体实施方式
26.下面结合图1至图10，对本发明做进一步说明：实施列1称取1mg阳离子类脂tsi14，加入1ml氯仿，使类脂充分溶解。
27.按摩尔比1:1，加入胆固醇，旋涡振荡器振荡混匀。
28.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，将其置于真空干燥箱内干燥5h。
29.水化，缓慢加入1ml 55℃的超纯水，25℃下反复超声频率为50hz振荡清洗5次至澄清，得到胆固醇-蔗糖酯型阳离子脂质体。
30.然后将胆固醇氨基-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为1:1均匀混合，15℃孵育20min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
31.实施列2称取1mg阳离子类脂tsi14，加入2ml氯仿，使类脂充分溶解。
32.按摩尔比2:1，加入胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de），旋涡振荡器振荡混匀。
33.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，将其置于真空干燥箱内干燥10 h。
34.水化，缓慢加入1ml 55℃的超纯水，25℃下反复超声频率为50hz振荡清洗6次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体，然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为1:1均匀混合，20℃孵育15min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
35.实施列3称取1mg阳离子类脂tsi14，加入3ml氯仿，使类脂充分溶解。
36.按摩尔比3:1，加入胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物 (db)，旋涡振荡器振荡混匀。
37.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，将其置于真空干燥箱内干燥12 h。
38.水化，缓慢加入1ml 55℃的超纯水，55℃下反复超声频率为50hz振荡清洗8次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
39.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为1:1均匀混合，25℃孵育20min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
40.实施列4称取1mg阳离子类脂tsi14，加入4ml氯仿，使类脂充分溶解。
41.按摩尔比4:1，加入胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物 (dh)，旋涡振荡器振荡混匀。
42.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥14h。
43.水化，缓慢加入1ml 55℃的超纯水，55℃下反复超声频率为50hz振荡清洗7次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
44.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为1:1均匀混合，25℃孵育30min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
45.实施列5称取1mg阳离子类脂tsi14，加入1ml氯仿，使类脂充分溶解。
46.按摩尔比6:1，加入胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物 (dh)，旋涡振荡器振荡混匀。
47.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥16 h。
48.水化，缓慢加入2ml 35℃的超纯水，45℃下反复超声频率为50hz振荡清洗7次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
49.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为8:1均匀混合，25℃孵育30min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
50.实施列6称取1mg阳离子类脂tsi14，加入2ml氯仿，使类脂充分溶解。
51.按摩尔比8:1，加入胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de），旋涡振荡器振荡混匀。
52.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥18 h。
53.水化，缓慢加入3ml 45℃的超纯水，35℃下反复超声频率为50hz振荡清洗6次至澄
清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
54.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为9:1均匀混合，25℃孵育20min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
55.实施列7称取1mg阳离子类脂tsi14，加入1ml氯仿，使类脂充分溶解。
56.按摩尔比10:1，加入胆固醇，旋涡振荡器振荡混匀。
57.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥12 h。
58.水化，缓慢加入4ml 50℃的超纯水，45℃下反复超声频率为50hz振荡清洗7次至澄清，得到胆固醇-蔗糖酯型阳离子脂质体。
59.然后将胆固醇氨基-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为6:1均匀混合，20℃孵育15min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
60.实施列8称取1mg阳离子类脂tsi14，加入3ml氯仿，使类脂充分溶解。
61.按摩尔比10:1，加入胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de），旋涡振荡器振荡混匀。
62.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥24h。
63.水化，缓慢加入5ml 40℃的超纯水，30℃下反复超声频率为50hz振荡清洗8次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
64.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为10:1均匀混合，20℃孵育25min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
65.实施列9称取1mg阳离子类脂tsi14，加入4ml氯仿，使类脂充分溶解。
66.按摩尔比12:1，加入胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物 (db)，旋涡振荡器振荡混匀。
67.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥30 h。
68.水化，缓慢加入6ml 55℃的超纯水，65℃下反复超声频率为50hz振荡清洗5次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
69.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为12:1均匀混合，25℃孵育30min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
70.实施列10称取1mg阳离子类脂tsi14，加入5ml氯仿，使类脂充分溶解。
71.按摩尔比16:1，加入胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物 (dh)，旋涡振荡器振荡混匀。
72.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为95μm，置于真空干燥箱内干燥12 h。
73.水化，缓慢加入7ml 25℃的超纯水60℃下反复超声频率为50hz振荡清洗10次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
74.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为20:1均匀混合，30℃孵育20min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂
质体与基因复合物。
75.实施列11称取1mg阳离子类脂tsi14，加入2ml氯仿，使类脂充分溶解。
76.按摩尔比20:1，加入胆固醇，旋涡振荡器振荡混匀。
77.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为100μm，置于真空干燥箱内干燥36h。
78.水化，缓慢加入9ml 65℃的超纯水，25℃下反复超声频率为50hz振荡清洗7次至澄清，得到胆固醇-蔗糖酯型阳离子脂质体。
79.然后将胆固醇氨基-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为16:1均匀混合，15℃孵育40min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
80.实施列12称取1mg阳离子类脂tsi14，加入1ml氯仿，使类脂充分溶解。
81.按摩尔比17:1，加入胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物（de），旋涡振荡器振荡混匀。
82.n2吹膜，吹出均匀的膜，膜的厚度为90μm，置于真空干燥箱内干燥24h。
83.水化，缓慢加入10ml 55℃的超纯水，35℃下反复超声频率为50hz振荡清洗8次至澄清，得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体。
84.然后将胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物按质量比为4:1均匀混合，35℃孵育10min，由于静电作用吸附得到胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体与基因复合物。
85.关于附图中的缩写代称的解释：tsi14 c，即为实施例1中tsi14加入胆固醇的反应产物，c表示胆固醇；tsi14 de，即为实施例2中tsi14加入胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物的反应产物，de表示胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物；tsi14 db，即为实施例3中tsi14加入胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物的反应产物，db表示胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物；tsi14 dh，即为实施例4中tsi14加入胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物的反应产物，dh表示胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物。
86.图1为本发明实施例1-实施例4胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体透射电子显微镜对比图。其中，加速电压100kv，a：tsi14 c，b：tsi14 de，c：tsi14 db，d：tsi14 dh，从图中可以看出：本发明实施例1-实施例4制备的基因复合物的基本形貌特征。
87.图2为本发明实施例2-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的zeta电位检测图。从图中可以看出：随着n/p的增加，zeta电位逐渐从负电性转变为正电性。对于脂质体tsi14 c来说，在比例为8/1时，脂质体与dna完全复合，形成的电位几乎为零。而脂质体tsi14 dc、tsi14 dd、tsi14 de在比例为6/1时，脂质体与dna完全复合，电位为正。说明dc、dd、de的氨基能增加脂质体的带电性，所带正电荷越多，与dna的结合能力越强，能够更加有效地压缩dna。
88.图3为本发明实施例1-实施例6胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物的电泳延滞图。其中，泳道1为marker，来自sabc的λdna/ ecor i hind iii标记，泳道2为裸pdna（0.5μg），泳道3～10为pdna的脂质复合物（0.5μg），比例逐渐增加（n/p，1:1，
2:1，3:1，4:1，6:1和8:1）。tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de和tsi14 c均可以与dna很好地结合。当脂质体tsi14 dc的n/p比为4/1时，dna开始延滞，n/p达到6/1时，dna能够完全延滞；脂质体tsi14 dd和tsi14 de与tsi14 dc相似，均是在n/p比为4/1时，dna开始延滞，n/p达到6/1时，dna能够完全延滞；当脂质体tsi14 c的n/p比为6/1时，dna开始延滞，n/p达到8/1时，dna能够完全延滞。所以，能够进一步说明dc、dd和de可以增强阳离子脂质体的带电性。结合脂质体/dna复合物的zeta电位结果，脂质体tsi14 c在n/p为8/1时，电位几乎为零，脂质体tsi14 dc、tsi14 dd、tsi14 de在n/p为6/1时，电位接近零。采用上述琼脂糖凝胶电泳结果与其复合物zeta电位结果基本相符。
89.图4：为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物在hela细胞中的表达效果图。在n/p为3/1，4/1，6/1，8/1，10/1时，四种脂质体均能有效转染hela细胞，在n/p为8/1时绿色荧光最多，荧光强度最强，说明在此比例下脂质体的转染效果最佳。脂质体tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de的荧光强度均高于脂质体tsi14 c，证明复配后的脂质体能够增强细胞的转染效率。并且与商品试剂lipo2000相比，tsi14 dc在n/p为8/1时，两者转染效率相当。
90.图5： 为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体介导pgfp-n1质粒转染hela细胞绿色荧光强度图。四种脂质体均在n/p为8/1时表达的荧光强度最强，分别为2.95
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106，3.21
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106，3.13
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106，3.11
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106。tsi14 dc、tsi14 dd、tsi14 de在相同n/p时，转染效率均高于tsi14 c。tsi14 dc在n/p为8/1时的转染效率与lipo2000相当。实验结果能够进一步表明复配后的脂质体能够增强细胞的转染效率。
91.图6：为本发明实施例3-实施例7胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物对hela细胞存活率的影响图。 随着脂质体/dna比例的增大，脂质体的细胞毒性逐渐增大在n/p为10/1时细胞存活率最低，tsi14 c，tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de的细胞存活率分别是78%，81%，80%和80%。其原因可能是由于比例的增大导致粒径和zeta电位有所上升，由于阳离子表面所带的正电荷与细胞膜会产生相互静电作用，而这一静电作用过大可能会损伤或引起细胞的凝聚，从而导致细胞毒性增大。在n/p为8/1时，tsi14 c，tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de在细胞中的细胞存活率分别是84%，89%，87%和86%，细胞存活率均在80%以上，tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de在8/1时的细胞存活率均大于tsi14 c，并且与lipo2000的细胞存活率相比仅差1%-4%。实验结果表明，复配后的三种脂质体tsi14 dc，tsi14 dd，tsi14 de对细胞产生的细胞毒性均低于脂质体tsi14 c，胆固醇胺类化合物的加入能够改善季铵盐型阳离子类脂细胞毒性大的问题。
92.图7给出了蔗糖酯型阳离子类脂结构式；图8为本发明加入的胆固醇乙基胺-蔗糖酯类化合物de结构式；图9为本发明加入的胆固醇丁基胺-蔗糖酯类化合物db结构式；图10为本发明加入的胆固醇己基胺-蔗糖酯类化合物dh结构式。
93.（1）本发明以压缩基因能力强的季铵盐型蔗糖酯类酯为主要成分，同时结合另一种阳离子类酯，即具有质子缓冲作用的胆固醇氨基衍生物，形成了一类新型阳离子脂质体。其对比于传统配方也就是阳离子脂质体和助类酯的组合，本发明胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物在转染性能有了明显地提高，并且明显降低了的细胞毒性，在基因治疗领域具有广阔的发展前景。
94.（2）本发明提供的胆固醇氨基衍生物-蔗糖酯型阳离子脂质体/基因复合物通过水
化薄膜法制备，方法简单方便，稳定性好，毒性低，转染效率高，为基因治疗提供了新思路，具有潜在的应用价值。
95.上面结合具体实施例和附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。