1.本发明属于生物信息学、计算化学、生物工程、生物物理及蛋白质工程等领域，具体涉及一种空腔介导的工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法。
背景技术：
：：2.酶(enzyme)通常是指由活细胞产生的具有高度特异性和催化作用的蛋白质或rna，易受温度、ph等众多外界环境因素的影响。根据催化的反应类型的不同，可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶等六大类。因酶具有良好的催化功能，在食品、医药、油脂生产和加工以及化妆品等工业领域均得到了广泛应用。3.然而，实际工业生产中，由于较严苛复杂的工业条件，酶经常在温度、压力和溶液等各种外部干扰下发生结构转变，从而影响其稳定性和催化活性。因此，增强酶的稳定性和活性是工业生产中的一条必经之路。但是，在酶进化的过程中，经常伴随着热稳定性和催化活性间的折中，最后导致两者的提高只能取其一。例如，shi等对ntu03脂肪酶盖子区域的第189号天冬氨酸残基进行突变后导致该酶活性升高，但是热稳定性下降(shihtw,pantm.substitutionofasp189residuealterstheactivityandthermostabilityofgeobacillussp.ntu03lipase[j].biotechnologyletters,2011,33(9):1841-1846.)。但也有少数关于酶稳定性与催化活性同时得到改善的相关报道。例如，wong等人通过同源建模和分子对接的方法对来源于trigonopsisvariabilis的d-氨基酸氧化酶进行改造，使突变体phe54tyr的热稳定性以及活性同时提高(kamalmz,ahmads,molugutr,etal.invitroevolvednon-aggregatingandthermostablelipase:structuralandthermodynamicinvestigation[j].jmolbiol,2011,413(3):726-741.)。尽管已有部分研究披露了同时提高稳定性和活性的方法，但并没有系统性的研究其机制问题，盲目性较大，因此需要开发一种提高酶特性的通用方法。[0004]对于氨基酸呈现紧密排列的天然蛋白，其独特的原子堆积对蛋白质的功能、稳定性、活性和选择性等有重要影响，研究者们称之为“cavity”，即空腔。通常根据功能可将其分为3类：域间空腔、域内空腔、亚基间空腔。其中，域内空腔已被广泛认为是对天然蛋白的热稳定性和催化活性最大的贡献者。它的大小和空间排列对蛋白的稳定性和催化活性有巨大影响。因此如何筛选蛋白中对稳定性和催化活性有重要作用的关键空腔至关重要。关于利用空腔来提高酶的稳定性和催化活性，目前主要的做法是通过氨基酸残基突变来创造空腔或减小空腔的体积，未有针对空腔进行一个系统性的筛选。[0005]分子动力学(moleculardynamics,md)模拟是指基于牛顿经典力学发展的计算方法来模拟蛋白体系中所有原子的运动轨迹，它增加了我们对蛋白质调控元件如门以及环的构象变化认识。它提高了我们对溶剂在蛋白质折叠和稳定性，在塑造酶的活性和选择性，或在药物设计中的作用的理解。目前，分子动力学模拟的应用方法主要是在恒温恒压条件下对蛋白以及小分子等体系进行运动轨迹的模拟并分析。[0006]aqua-duct是一款开源的python软件，旨在使用小配体作为分子探针，从分子内空隙的角度来分析生物大分子，不仅考虑了隧道和空穴几何形状随时间的时间演变，还考虑了排列在大分子内部的特定氨基酸的物理化学性质。目前主要用于分析整个蛋白质内部(如空腔和隧道)的结构，以及内部结构中隧道和空腔的功能。[0007]rosetta是一款用于模拟大分子结构的全面的一套软件，作为一种灵活的多用途应用程序，它包括了用于蛋白质和核酸的结构预测、设计和重构的工具。使用笛卡尔空间坐标搜索能量最低的侧链构象，并结合小分子的实验热力学数据和大分子高分辨率结构数据的统计函数进行饱和突变(h.park,p.bradley,p.greisen,y.liu,v.k.mulligan,d.e.kim,d.baker,f.dimaio,simultaneousoptimizationofbiomolecularenergyfunctionsonfeaturesfromsmallmoleculesandmacromolecules.journalofchemicaltheory&computation,6201(2016).)。目前常用于疫苗、新材料、靶向蛋白质结合剂和酶设计的开发。[0008]thefoldxsuit已经可以实现高级蛋白质设计功能，它是以经验为导向，在不改变突变位点周围氨基酸结构的情况下进行饱和突变(j.schymkowitz,j.borg,f.stricher,r.nys,f.rousseau,l.serrano,thefoldxwebserver:anonlineforcefield.nucleicacidsres33,w382-388(2005))。目前常用于蛋白质的设计以及稳定性预测等。技术实现要素：[0009]本发明的目的在于提供一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法，旨在解决工业生产中酶的热稳定性低、催化活性较低的问题。本发明方法可操作性强，以少的工作量达到高的阳性率，具有一定的通用性同时也具有很高的工业应用潜力。[0010]为了实现上述发明目的，本发明提供了一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的进化方法，首先，对待进化的酶蛋白结构进行分子动力学模拟，再利用aqud-duct程序分析内部空腔/隧道变化过程，结合mcvol程序计算并筛选出内部关键空腔，统计对内部关键空腔贡献大于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点范围内的残基位点避免对活性造成较大影响；再通过foldx5.0和rosetta对剩余氨基酸位点进行预测，筛选出潜在的具有高稳定性和催化活性的突变体。具体地，本发明方法包括以下步骤：[0011](1)对酶蛋白进行分子动力学模拟，每个蛋白以随机初始速度进行5个平行，每个平行时长30ns；[0012](2)筛选酶蛋白内部关键空腔，具体的，以均方根偏差(rmsd)矩阵为根本将所有平行下的分子动力学模拟轨迹进行聚类分析并挑选出代表性构象(即蛋白构象的平均构象)，提高预测的准确性，然后，利用mcvol程序计算所有代表性构象的内部空腔，统计并筛选出出现频率高于80％的空腔，作为内部关键空腔，这样的空腔对蛋白的稳定性和功能性有重要作用；[0013](3)虚拟筛选酶蛋白潜在突变体，具体的，首先根据温度因子b-factor排序，统计步骤(2)挑选出的代表性构象中b-factor排名前80的氨基酸残基，再结合步骤(2)筛选出的内部关键空腔，统计不同平行下每个内部关键空腔附近出现频率高于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点范围内的残基位点尽可能避免突变对催化活性的影响，再利用rosetta和foldx5.0进行虚拟饱和突变、构建突变体文库、筛选出δδg《0的即为潜在突变体；[0014](4)体外定向进化实验及酶学性质表征，具体的，选择上述方法筛选出的潜在突变体，利用定点突变实验技术，对目标位点氨基酸进行突变，逐步进行转化、测序验证、诱导表达、分离纯化、酶学性质测定以及tm值测定等实验，最终鉴定出鲁棒性显著提高的突变体。[0015]进一步地，本发明步骤(1)所进行的分子动力学模拟，具体步骤如下：采用gromacs(是用于研究生物分子体系的分子动力学程序包)进行分子动力学模拟；模拟时选择amber99力场，创建一个立方体盒子同时使蛋白质置于盒子中心(蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm)，使用水模型添加溶剂(水模型采用tip4p)，紧接着中和电荷使整个体系达到平衡状态；采用最速下降法对整个系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理；然后，在周期边界条件下进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k；最后，进行成品模拟，整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用particle-meshewald(pme)方法计算远距离静电势能，以随机的初始速度执行五次，模拟时长为30ns。[0016]进一步地，本发明步骤(2)所述聚类分析采用gromacs自带工具gmx_cluster来进行。选择gromos算法进行聚类分析，并进行测试，调整cutoff和均方根偏差(rmsd)的最小值，保证聚类结果为3-5类，挑选出最具代表性的构象(每个聚类下的平均构象)。[0017]进一步地，本发明步骤(2)利用mcvol程序计算所有代表性构象的内部空腔时，探针半径设置为针半径设置为空腔最小体积不小于(小于的空腔被丢弃)，水分子的体积设置为[0018]进一步地，本发明步骤(2)所述温度因子b-factor由b-fitter程序计算。[0019]进一步地，本发明步骤(3)所述rosetta和foldx虚拟饱和突变流程如下：[0020]foldx(http://foldxsuite.crg.eu/)预测：对酶进行虚拟饱和突变之前先通过repairpdb和optimize模块进行修正与优化，运行次数被设置为3次以获得平均结果，其他设置使用默认值；[0021]rosetta(https://www.rosettacommons.org/)预测：在进行rosetta计算δδg之前，先对蛋白结构进行fastrelax，使得蛋白结构有一定的松弛，保证晶体结构中的原子尽可能接近其原始位置，松弛时对蛋白结构的主干和支链进行限制，以避免偏转过大，松弛次数设为40；然后，从40个松弛结构中选取能量评分最低的一个蛋白结构(野生型以及突变体最佳的侧链排布方式)用于下一步的能量计算，选择自由能差δδg《0的突变体；[0022]取foldx预测结果和rosetta预测结果的交集作为用于体外定向进化实验的潜在突变体。[0023]本发明步骤(4)体外定向进化实验及酶学性质表征，具体包括如下步骤：[0024]①设计用于突变目标位点的引物序列，通过pcr突变目标位点的碱基序列，待测序验证正确后，将突变正确的序列与表达载体连接并转入大肠杆菌或酵母中进行诱导表达，若为胞内蛋白，则超声破碎后离心收集上清液即为蛋白粗酶液；若为胞外蛋白，直接离心收集上清即为蛋白粗酶液；[0025]②使用镍离子亲和层析柱或离子交换层析柱并用aktaavant蛋白纯化仪对粗酶液进行纯化；[0026]③纯酶液去盐：使用10kda的超滤管进行超滤，每个样品至少超滤3次，将超滤后的酶液稀释至蛋白浓度为0.01-0.1mgml-1，利用圆二色谱仪测定样品的熔融温度(tm)，温度梯度设置为30-90℃。[0027]本发明还提供应用上述方法得到的活性和热稳定性提高的酶突变体，包括：[0028](1)脂肪酶突变体：[0029]t17v/s23a/t145i，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸、将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及145位的苏氨酸替换为异亮氨酸；或，[0030]t17v/s23a/t194l，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸、将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及194位的苏氨酸替换为亮氨酸；或，[0031]t17v/s23a，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸以及将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸；或，[0032]t17v/t194l，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸以及将第194位的苏氨酸替换为亮氨酸；或，[0033]s23a/t145i，是在seqidno:2的基础上，将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及将第145位的苏氨酸替换为异亮氨酸。[0034](2)漆酶突变体：[0035]t102m，是在seqidno:4的基础上，将第102位的苏氨酸替换为甲硫氨酸；或，[0036]s258a；是在seqidno:4的基础上，将第258位的丝氨酸替换为丙氨酸。[0037](3)谷氨酰胺转氨酶突变体：[0038]g263m，是在seqidno:6的基础上，将第263位的甘氨酸替换为甲硫氨酸；或，[0039]n284f，是在seqidno:6的基础上，将第284位的天冬酰胺替换为苯丙氨酸；或，[0040]t308f，是在seqidno:6的基础上，将第308位的苏氨酸替换为苯丙氨酸。[0041]有益效果[0042]经体外实验验证，使用本发明上述方法筛选的突变体，能够同时提高热稳定性和催化活性，阳性突变体率高。本发明方法具有良好的应用前景。[0043]本发明通过对蛋白模拟轨迹进行聚类分析，挑选出代表性构象，可以实现更加系统且全面地分析蛋白构象波动，提高了虚拟预测的精确度。[0044]本发明筛选蛋白代表性构象的内部关键空腔，再以内部关键空腔为探针，同时以形成这些内部关键空腔的氨基酸残基位点为潜在突变位点，筛选潜在的阳性突变体，可以实现更加精确地定位到对蛋白结构和功能具有重大影响的氨基酸，同时更进一步提高了筛选结果的阳性率。[0045]由于foldx完全以经验为主导，在确保除了突变位点以外其他的残基不会移动后，再利用经验公式，进行自由能计算。然而，rosetta是利用笛卡尔空间坐标寻找能量最低的侧链构象，结合经验的热力学数据和大分子结构数据的统计函数进行饱和突变，是通过解释突变体的主干变化进行预测。本发明取两者预测结果的交集，进一步提高预测结果的准确性。附图说明[0046]图1整个方法的筛选流程示意图。[0047]图2为空腔附近氨基酸位点的筛选结果图，氨基酸用棍棒模型表示。[0048]图3为突变体的最终筛选结果，网状表示空腔，突变位点用黑色标签表示，活性中心用红色标签表示，虚线表示空腔与突变位点的空间距离。[0049]图4为漆酶的3d结构以及内部空腔的计算结果。[0050]图5为谷氨酰胺转氨酶的3d结构以及内部空腔的计算结果。具体实施方式[0051]实施例1：米黑根毛脂肪酶(rhizomucormieheilipaserml)[0052]1、关键内部空腔和突变位点的筛选[0053]本实例以野生型rml的晶体结构(pdbid:3tgl,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，然后加入9个na 中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后在周期边界条件下进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman进行压力耦合。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟，整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同的初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0054]通过gmx_cluster程序进行聚类分析选取代表性构象。然后，利用aqua-duct程序分析模拟轨迹并利用mcvol计算空腔(将腔体的最小体积限制在不小于的范围内)，筛选到了6个内部关键空腔。通过b-factor排序筛选到80个氨基酸残基(aa)，随后以空腔为媒介筛选出对空腔贡献率大于30％的38个aa位点(图1)。排除活性三联体范围的aa从而筛选出19个aa。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性(即，取两者计算结果的交集)，我们获得了6个aa潜在突变位点。结果如表1设计了8个潜在的突变体：s20v/t145l、y16f/s20v、s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l。[0055]2、突变体的构建及酶学性质表征[0056]选取来自rhizomucormiehei来源的脂肪酶(rml)作为研究对象(genbank：kp164599.1，其编码区碱基序列和氨基酸序列见序列表)。rml采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28a，宿主为e.colijm109。首先构建了重组质粒pet-28a-wt，作为后续构建t1脂肪酶突变体的模板。在rml脂肪酶基因的5’端和3’端分别添加bamhi和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用bamhi和ecori分别对合成的rml脂肪酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：rml脂肪酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xqbuffer5μl；bamhi和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对rml基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对rml基因和载体pet-28a进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。[0057]突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表1所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28a-rml为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28a-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0058]表1突变体引物序列[0059][0060][0061]将8个rml突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0062]采用棕榈酸对硝基苯酯(p-npp)为底物检测酶活，酶活力测定体系为3ml，测定步骤如下：先将1.8mlph为8.0的50mol·l-1tris-hcl缓冲溶液与100μl底物混合，45℃反应10min。样品管中加入纯化酶液100μl(稀释到合适浓度)，对照管中加入灭活的酶液100μl，立即混匀计时，45℃准确反应10min。反应结束后立即加入500μl10％的三氯乙酸终止反应。再加入500μl10％的na2co3溶液显色，于405nm处测定吸光度。[0063]脂肪酶酶活计算公式：[0064][0065]a—样品酶活(u·ml-1)[0066]a1—样品吸光度od值[0067]a0—空白吸光度od值[0068]k—对硝基酚标准曲线的斜率[0069]c0—对硝基酚标准曲线的截距[0070]n—稀释倍数[0071]v1—反应液的体积(ml)[0072]v2—酶液的体积(ml)[0073]t—反应时间(min)[0074]脂肪酶活力单位的定义：在固定温度和ph条件下，每分钟水解底物释放出1μmol游离脂肪酸所需的酶量，将其定义为一个酶活力单位(u)。本发明中，1u是指在45℃，ph为8.0时，野生型及突变体t1脂肪酶每分钟水解棕榈酸对硝基苯酯产生1μmol游离对硝基苯所需的酶量。[0075]表2表明突变体s20v/t145l、s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l比活相对于野生型分别提高了2.86倍、5.56倍、4.51倍、3.73倍、4.95倍、5.5倍和9.95倍。其中，s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l的tm值分别提高了8.89℃、8.9℃、10.47℃、0.7℃、11.98℃、11.01℃。综合阳性率高达75％。同时，动力学参数结果表明，s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l的催化效率分别提高了99％、92％、113％、140％、81％、386％。[0076]表2突变体比酶活、熔融温度、半衰期以及动力学参数[0077][0078]实施例2：枯草芽孢杆菌漆酶(bsl)[0079]为了证明该方法的一个普适性，根据酶的分类，选取了在工业上应用较强的漆酶，属于氧化还原酶大类(rml属于水解酶)，在食品中应用非常广泛。例如：改善面包烘培后的质地、外观、味道；去除啤酒、白酒、苹果汁、葡萄汁加工中的一些不利酚类化合物，保持其风味，降低它们的变色和变质的速度。[0080]1关键内部空腔和突变位点的筛选[0081]本实例以野生型漆酶的晶体结构(pdbid:1w8r,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，加入na /cl-1中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman调节压力。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟。整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0082]聚类分析选取不同平行具有代表性的构象。然后通过aquc-duct分析蛋白轨迹并利用mcvol进行空腔计算(腔体的最小体积限制在不小于的范围)，筛选到8个内部关键空腔(图4)。按照b-factor值由大到小排序，结合关键空腔筛选出空腔贡献率大于30％的氨基酸残基。通过约束活性三联体进一步筛选出25个氨基酸残基。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性，鉴定了6个潜在的突变体，t102v，t102m，s258a，t340l，t102f，g271m。[0083]2突变体的构建[0084]选取来自bacillussubtili来源的漆酶(bsl)作为研究对象(genbank：cp053102.1)。bsl采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28a，宿主为e.colijm109和e.colibl21(de3)。首先构建了重组质粒pet-28a-wt，作为后续构建漆酶突变体的模板。在漆酶基因的5’端和3’端分别添加bamhi和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用bamhi和ecori分别对合成的漆酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：漆酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xqbuffer5μl；bamhi和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对bsl基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对bsl基因和载体pet-28a进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表3所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28a-wt为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28a-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0085]表3突变体引物序列[0086][0087]3蛋白诱导表达、纯化及酶学性质测定[0088]蛋白诱导表达条件：20℃，200r·min-1，2mmcuso4，iptg终浓度0.5mm，诱导12-16h。诱导结束后离心收集上请为粗酶液。本实验采用的载体pet-28a自带his标签，因此采用镍离子亲和层析原理对粗酶液进行纯化，纯化前粗酶液于4℃，12000rmin-1离心10min，再用0.22μm的水系过滤器过滤上请，进一步去杂质。将6个bsl突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0089]用分光光度计检测漆酶与底物反应后的吸光度，计算漆酶活性。酶的活性定义为每分钟氧化1μmol底物时所需的酶量为1个酶活单位(u)。总反应体系为1.5ml，2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(abts)为底物时，体系含终浓度为1mmabts，纯化酶液以及磷酸盐缓冲液，30℃水浴3min后于420nm处测定od值，所有反应均重复3次。[0090]表4表明突变体t102v，t102m，s258a，t340l，t102f，g271m比活相对野生型分别提高37％，170％，113％，97％，10％，73％。同时，所有突变体的动力学常数均得到了提高，表明漆酶的催化效率得到了提高。突变体t102v，t102m，s258a，g271m在70℃下半衰期分别提高11min，58min，16min，14min，表明热稳定性显著提高。[0091]表4野生型及突变体比酶活、t1/2以及动力学参数[0092][0093]实施例3：微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(microbialtransglutaminase,mtg)[0094]同理，为了证明该方法的一个普适性，根据酶的分类，同样选取了在工业上应用较强的微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，属于转移酶大类，被誉为21世纪超级粘合剂，在食品中应用非常广泛。例如：在肉制品中应用最广泛，可将碎肉粘结成块，改善食品质构，提高肉制品的口感，风味组织结构和营养。[0095]1关键内部空腔和突变位点的筛选[0096]本实例以野生型谷氨酰胺转氨酶的晶体结构(pdbid:3iu0,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，加入na /cl-1中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman调节压力。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟。整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0097]选取不同平行的模拟结构通过聚类分析选取代表性构象。利用aquc-duct分析蛋白轨迹并利用mcvol进行空腔计算(腔体的最小体积限制在不小于的范围)，筛选到7个内部关键空腔(图5)。按照b-factor值由大到小排序，随后筛选出空腔贡献率大于30％的氨基酸残基。通过约束活性三联体进一步筛选出36个氨基酸残基。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性，鉴定了7个潜在的突变体，g264f，g264l，g264m，n285f，t309f，t309l，t367m。[0098]2突变体的构建[0099]选取来自streptomycesmobaraensis来源的谷氨酰胺转氨酶(stg)作为研究对象(genbank：y18315.1)。stg采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28c，宿主为e.colijm109和e.colibl21(de3)。首先构建了重组质粒pet-28c-wt，作为后续构建漆酶突变体的模板。在漆酶基因的5’端和3’端分别添加xbai和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用xbai和ecori分别对合成的stg全长基因和pet-28c载体进行双酶切，反应体系为50μl：stg基因(或pet-28c质粒)20μl；10xqbuffer5μl；xbai和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对stg基因及pet-28c质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对stg基因和载体pet-28c进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28c质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表4所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28c-wt为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28c-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0100]表5突变体引物序列[0101][0102]3蛋白诱导表达、纯化及酶学性质测定[0103]蛋白诱导表达条件：20℃，200r·min-1，iptg终浓度0.5mm，诱导12-16h。诱导结束后离心收集上请为粗酶液。本实验采用的载体pet-28c自带his标签，因此采用镍离子亲和层析原理对粗酶液进行纯化，纯化前粗酶液于4℃，12000rmin-1离心10min，再用0.22μm的水系过滤器过滤上请，进一步去杂质。将6个bsl突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0104]用分光光度计检测stg与底物反应后的吸光度(600nm)，计算stg活性。酶活力单位(u)定义为：37℃时每分钟催化底物生成1μmoll-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量。比酶活(u/mg)定义为：每毫克蛋白具有的酶活力单位。样品酶活的测定如下：以200μl此经适当稀释的酶液与500μl底物试剂混合，37℃水浴10min后迅速加入200μl10％三氯乙酸，37℃水浴5min，反应液4000r/min离心5min，取上清于525nm波长处测定吸光值，计算酶活，所有反应均重复3次。[0105]表6表明突变体g263l，g263m，n284f，t308f，t366m比活相对野生型分别提高14％，125％，78％，64％，44％。同时，催化常数分别提高7.84％，2.57％，64.71％，49.02％，29.41％表明谷氨酰胺转氨酶的催化效率得到了提高。g263l，g263m，n284f，t308f，t366m的t1/2分别提高22％，214％，8％，72％，48％，表明这些突变体的热稳定性显著提高。[0106]表6野生型及突变体比酶活以及动力学参数[0107][0108]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12
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：：2.酶(enzyme)通常是指由活细胞产生的具有高度特异性和催化作用的蛋白质或rna，易受温度、ph等众多外界环境因素的影响。根据催化的反应类型的不同，可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶等六大类。因酶具有良好的催化功能，在食品、医药、油脂生产和加工以及化妆品等工业领域均得到了广泛应用。3.然而，实际工业生产中，由于较严苛复杂的工业条件，酶经常在温度、压力和溶液等各种外部干扰下发生结构转变，从而影响其稳定性和催化活性。因此，增强酶的稳定性和活性是工业生产中的一条必经之路。但是，在酶进化的过程中，经常伴随着热稳定性和催化活性间的折中，最后导致两者的提高只能取其一。例如，shi等对ntu03脂肪酶盖子区域的第189号天冬氨酸残基进行突变后导致该酶活性升高，但是热稳定性下降(shihtw,pantm.substitutionofasp189residuealterstheactivityandthermostabilityofgeobacillussp.ntu03lipase[j].biotechnologyletters,2011,33(9):1841-1846.)。但也有少数关于酶稳定性与催化活性同时得到改善的相关报道。例如，wong等人通过同源建模和分子对接的方法对来源于trigonopsisvariabilis的d-氨基酸氧化酶进行改造，使突变体phe54tyr的热稳定性以及活性同时提高(kamalmz,ahmads,molugutr,etal.invitroevolvednon-aggregatingandthermostablelipase:structuralandthermodynamicinvestigation[j].jmolbiol,2011,413(3):726-741.)。尽管已有部分研究披露了同时提高稳定性和活性的方法，但并没有系统性的研究其机制问题，盲目性较大，因此需要开发一种提高酶特性的通用方法。[0004]对于氨基酸呈现紧密排列的天然蛋白，其独特的原子堆积对蛋白质的功能、稳定性、活性和选择性等有重要影响，研究者们称之为“cavity”，即空腔。通常根据功能可将其分为3类：域间空腔、域内空腔、亚基间空腔。其中，域内空腔已被广泛认为是对天然蛋白的热稳定性和催化活性最大的贡献者。它的大小和空间排列对蛋白的稳定性和催化活性有巨大影响。因此如何筛选蛋白中对稳定性和催化活性有重要作用的关键空腔至关重要。关于利用空腔来提高酶的稳定性和催化活性，目前主要的做法是通过氨基酸残基突变来创造空腔或减小空腔的体积，未有针对空腔进行一个系统性的筛选。[0005]分子动力学(moleculardynamics,md)模拟是指基于牛顿经典力学发展的计算方法来模拟蛋白体系中所有原子的运动轨迹，它增加了我们对蛋白质调控元件如门以及环的构象变化认识。它提高了我们对溶剂在蛋白质折叠和稳定性，在塑造酶的活性和选择性，或在药物设计中的作用的理解。目前，分子动力学模拟的应用方法主要是在恒温恒压条件下对蛋白以及小分子等体系进行运动轨迹的模拟并分析。[0006]aqua-duct是一款开源的python软件，旨在使用小配体作为分子探针，从分子内空隙的角度来分析生物大分子，不仅考虑了隧道和空穴几何形状随时间的时间演变，还考虑了排列在大分子内部的特定氨基酸的物理化学性质。目前主要用于分析整个蛋白质内部(如空腔和隧道)的结构，以及内部结构中隧道和空腔的功能。[0007]rosetta是一款用于模拟大分子结构的全面的一套软件，作为一种灵活的多用途应用程序，它包括了用于蛋白质和核酸的结构预测、设计和重构的工具。使用笛卡尔空间坐标搜索能量最低的侧链构象，并结合小分子的实验热力学数据和大分子高分辨率结构数据的统计函数进行饱和突变(h.park,p.bradley,p.greisen,y.liu,v.k.mulligan,d.e.kim,d.baker,f.dimaio,simultaneousoptimizationofbiomolecularenergyfunctionsonfeaturesfromsmallmoleculesandmacromolecules.journalofchemicaltheory&computation,6201(2016).)。目前常用于疫苗、新材料、靶向蛋白质结合剂和酶设计的开发。[0008]thefoldxsuit已经可以实现高级蛋白质设计功能，它是以经验为导向，在不改变突变位点周围氨基酸结构的情况下进行饱和突变(j.schymkowitz,j.borg,f.stricher,r.nys,f.rousseau,l.serrano,thefoldxwebserver:anonlineforcefield.nucleicacidsres33,w382-388(2005))。目前常用于蛋白质的设计以及稳定性预测等。技术实现要素：[0009]本发明的目的在于提供一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的方法，旨在解决工业生产中酶的热稳定性低、催化活性较低的问题。本发明方法可操作性强，以少的工作量达到高的阳性率，具有一定的通用性同时也具有很高的工业应用潜力。[0010]为了实现上述发明目的，本发明提供了一种空腔工程化技术提高酶热稳定性和催化活性的进化方法，首先，对待进化的酶蛋白结构进行分子动力学模拟，再利用aqud-duct程序分析内部空腔/隧道变化过程，结合mcvol程序计算并筛选出内部关键空腔，统计对内部关键空腔贡献大于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点范围内的残基位点避免对活性造成较大影响；再通过foldx5.0和rosetta对剩余氨基酸位点进行预测，筛选出潜在的具有高稳定性和催化活性的突变体。具体地，本发明方法包括以下步骤：[0011](1)对酶蛋白进行分子动力学模拟，每个蛋白以随机初始速度进行5个平行，每个平行时长30ns；[0012](2)筛选酶蛋白内部关键空腔，具体的，以均方根偏差(rmsd)矩阵为根本将所有平行下的分子动力学模拟轨迹进行聚类分析并挑选出代表性构象(即蛋白构象的平均构象)，提高预测的准确性，然后，利用mcvol程序计算所有代表性构象的内部空腔，统计并筛选出出现频率高于80％的空腔，作为内部关键空腔，这样的空腔对蛋白的稳定性和功能性有重要作用；[0013](3)虚拟筛选酶蛋白潜在突变体，具体的，首先根据温度因子b-factor排序，统计步骤(2)挑选出的代表性构象中b-factor排名前80的氨基酸残基，再结合步骤(2)筛选出的内部关键空腔，统计不同平行下每个内部关键空腔附近出现频率高于30％的氨基酸残基，同时排除活性位点范围内的残基位点尽可能避免突变对催化活性的影响，再利用rosetta和foldx5.0进行虚拟饱和突变、构建突变体文库、筛选出δδg《0的即为潜在突变体；[0014](4)体外定向进化实验及酶学性质表征，具体的，选择上述方法筛选出的潜在突变体，利用定点突变实验技术，对目标位点氨基酸进行突变，逐步进行转化、测序验证、诱导表达、分离纯化、酶学性质测定以及tm值测定等实验，最终鉴定出鲁棒性显著提高的突变体。[0015]进一步地，本发明步骤(1)所进行的分子动力学模拟，具体步骤如下：采用gromacs(是用于研究生物分子体系的分子动力学程序包)进行分子动力学模拟；模拟时选择amber99力场，创建一个立方体盒子同时使蛋白质置于盒子中心(蛋白质距离盒子边缘最短为1.0nm)，使用水模型添加溶剂(水模型采用tip4p)，紧接着中和电荷使整个体系达到平衡状态；采用最速下降法对整个系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理；然后，在周期边界条件下进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k；最后，进行成品模拟，整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用particle-meshewald(pme)方法计算远距离静电势能，以随机的初始速度执行五次，模拟时长为30ns。[0016]进一步地，本发明步骤(2)所述聚类分析采用gromacs自带工具gmx_cluster来进行。选择gromos算法进行聚类分析，并进行测试，调整cutoff和均方根偏差(rmsd)的最小值，保证聚类结果为3-5类，挑选出最具代表性的构象(每个聚类下的平均构象)。[0017]进一步地，本发明步骤(2)利用mcvol程序计算所有代表性构象的内部空腔时，探针半径设置为针半径设置为空腔最小体积不小于(小于的空腔被丢弃)，水分子的体积设置为[0018]进一步地，本发明步骤(2)所述温度因子b-factor由b-fitter程序计算。[0019]进一步地，本发明步骤(3)所述rosetta和foldx虚拟饱和突变流程如下：[0020]foldx(http://foldxsuite.crg.eu/)预测：对酶进行虚拟饱和突变之前先通过repairpdb和optimize模块进行修正与优化，运行次数被设置为3次以获得平均结果，其他设置使用默认值；[0021]rosetta(https://www.rosettacommons.org/)预测：在进行rosetta计算δδg之前，先对蛋白结构进行fastrelax，使得蛋白结构有一定的松弛，保证晶体结构中的原子尽可能接近其原始位置，松弛时对蛋白结构的主干和支链进行限制，以避免偏转过大，松弛次数设为40；然后，从40个松弛结构中选取能量评分最低的一个蛋白结构(野生型以及突变体最佳的侧链排布方式)用于下一步的能量计算，选择自由能差δδg《0的突变体；[0022]取foldx预测结果和rosetta预测结果的交集作为用于体外定向进化实验的潜在突变体。[0023]本发明步骤(4)体外定向进化实验及酶学性质表征，具体包括如下步骤：[0024]①设计用于突变目标位点的引物序列，通过pcr突变目标位点的碱基序列，待测序验证正确后，将突变正确的序列与表达载体连接并转入大肠杆菌或酵母中进行诱导表达，若为胞内蛋白，则超声破碎后离心收集上清液即为蛋白粗酶液；若为胞外蛋白，直接离心收集上清即为蛋白粗酶液；[0025]②使用镍离子亲和层析柱或离子交换层析柱并用aktaavant蛋白纯化仪对粗酶液进行纯化；[0026]③纯酶液去盐：使用10kda的超滤管进行超滤，每个样品至少超滤3次，将超滤后的酶液稀释至蛋白浓度为0.01-0.1mgml-1，利用圆二色谱仪测定样品的熔融温度(tm)，温度梯度设置为30-90℃。[0027]本发明还提供应用上述方法得到的活性和热稳定性提高的酶突变体，包括：[0028](1)脂肪酶突变体：[0029]t17v/s23a/t145i，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸、将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及145位的苏氨酸替换为异亮氨酸；或，[0030]t17v/s23a/t194l，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸、将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及194位的苏氨酸替换为亮氨酸；或，[0031]t17v/s23a，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸以及将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸；或，[0032]t17v/t194l，是在seqidno:2的基础上，将第17位的苏氨酸替换为缬氨酸以及将第194位的苏氨酸替换为亮氨酸；或，[0033]s23a/t145i，是在seqidno:2的基础上，将第23位的丝氨酸替换为丙氨酸以及将第145位的苏氨酸替换为异亮氨酸。[0034](2)漆酶突变体：[0035]t102m，是在seqidno:4的基础上，将第102位的苏氨酸替换为甲硫氨酸；或，[0036]s258a；是在seqidno:4的基础上，将第258位的丝氨酸替换为丙氨酸。[0037](3)谷氨酰胺转氨酶突变体：[0038]g263m，是在seqidno:6的基础上，将第263位的甘氨酸替换为甲硫氨酸；或，[0039]n284f，是在seqidno:6的基础上，将第284位的天冬酰胺替换为苯丙氨酸；或，[0040]t308f，是在seqidno:6的基础上，将第308位的苏氨酸替换为苯丙氨酸。[0041]有益效果[0042]经体外实验验证，使用本发明上述方法筛选的突变体，能够同时提高热稳定性和催化活性，阳性突变体率高。本发明方法具有良好的应用前景。[0043]本发明通过对蛋白模拟轨迹进行聚类分析，挑选出代表性构象，可以实现更加系统且全面地分析蛋白构象波动，提高了虚拟预测的精确度。[0044]本发明筛选蛋白代表性构象的内部关键空腔，再以内部关键空腔为探针，同时以形成这些内部关键空腔的氨基酸残基位点为潜在突变位点，筛选潜在的阳性突变体，可以实现更加精确地定位到对蛋白结构和功能具有重大影响的氨基酸，同时更进一步提高了筛选结果的阳性率。[0045]由于foldx完全以经验为主导，在确保除了突变位点以外其他的残基不会移动后，再利用经验公式，进行自由能计算。然而，rosetta是利用笛卡尔空间坐标寻找能量最低的侧链构象，结合经验的热力学数据和大分子结构数据的统计函数进行饱和突变，是通过解释突变体的主干变化进行预测。本发明取两者预测结果的交集，进一步提高预测结果的准确性。附图说明[0046]图1整个方法的筛选流程示意图。[0047]图2为空腔附近氨基酸位点的筛选结果图，氨基酸用棍棒模型表示。[0048]图3为突变体的最终筛选结果，网状表示空腔，突变位点用黑色标签表示，活性中心用红色标签表示，虚线表示空腔与突变位点的空间距离。[0049]图4为漆酶的3d结构以及内部空腔的计算结果。[0050]图5为谷氨酰胺转氨酶的3d结构以及内部空腔的计算结果。具体实施方式[0051]实施例1：米黑根毛脂肪酶(rhizomucormieheilipaserml)[0052]1、关键内部空腔和突变位点的筛选[0053]本实例以野生型rml的晶体结构(pdbid:3tgl,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，然后加入9个na 中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后在周期边界条件下进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman进行压力耦合。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟，整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同的初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0054]通过gmx_cluster程序进行聚类分析选取代表性构象。然后，利用aqua-duct程序分析模拟轨迹并利用mcvol计算空腔(将腔体的最小体积限制在不小于的范围内)，筛选到了6个内部关键空腔。通过b-factor排序筛选到80个氨基酸残基(aa)，随后以空腔为媒介筛选出对空腔贡献率大于30％的38个aa位点(图1)。排除活性三联体范围的aa从而筛选出19个aa。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性(即，取两者计算结果的交集)，我们获得了6个aa潜在突变位点。结果如表1设计了8个潜在的突变体：s20v/t145l、y16f/s20v、s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l。[0055]2、突变体的构建及酶学性质表征[0056]选取来自rhizomucormiehei来源的脂肪酶(rml)作为研究对象(genbank：kp164599.1，其编码区碱基序列和氨基酸序列见序列表)。rml采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28a，宿主为e.colijm109。首先构建了重组质粒pet-28a-wt，作为后续构建t1脂肪酶突变体的模板。在rml脂肪酶基因的5’端和3’端分别添加bamhi和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用bamhi和ecori分别对合成的rml脂肪酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：rml脂肪酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xqbuffer5μl；bamhi和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对rml基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对rml基因和载体pet-28a进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。[0057]突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表1所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28a-rml为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28a-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0058]表1突变体引物序列[0059][0060][0061]将8个rml突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0062]采用棕榈酸对硝基苯酯(p-npp)为底物检测酶活，酶活力测定体系为3ml，测定步骤如下：先将1.8mlph为8.0的50mol·l-1tris-hcl缓冲溶液与100μl底物混合，45℃反应10min。样品管中加入纯化酶液100μl(稀释到合适浓度)，对照管中加入灭活的酶液100μl，立即混匀计时，45℃准确反应10min。反应结束后立即加入500μl10％的三氯乙酸终止反应。再加入500μl10％的na2co3溶液显色，于405nm处测定吸光度。[0063]脂肪酶酶活计算公式：[0064][0065]a—样品酶活(u·ml-1)[0066]a1—样品吸光度od值[0067]a0—空白吸光度od值[0068]k—对硝基酚标准曲线的斜率[0069]c0—对硝基酚标准曲线的截距[0070]n—稀释倍数[0071]v1—反应液的体积(ml)[0072]v2—酶液的体积(ml)[0073]t—反应时间(min)[0074]脂肪酶活力单位的定义：在固定温度和ph条件下，每分钟水解底物释放出1μmol游离脂肪酸所需的酶量，将其定义为一个酶活力单位(u)。本发明中，1u是指在45℃，ph为8.0时，野生型及突变体t1脂肪酶每分钟水解棕榈酸对硝基苯酯产生1μmol游离对硝基苯所需的酶量。[0075]表2表明突变体s20v/t145l、s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l比活相对于野生型分别提高了2.86倍、5.56倍、4.51倍、3.73倍、4.95倍、5.5倍和9.95倍。其中，s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l的tm值分别提高了8.89℃、8.9℃、10.47℃、0.7℃、11.98℃、11.01℃。综合阳性率高达75％。同时，动力学参数结果表明，s23a/t145i、t17v/t194l、t17v/s23a、t145i/t194i、t17v/s23a/t145i、t17v/s23a/t194l的催化效率分别提高了99％、92％、113％、140％、81％、386％。[0076]表2突变体比酶活、熔融温度、半衰期以及动力学参数[0077][0078]实施例2：枯草芽孢杆菌漆酶(bsl)[0079]为了证明该方法的一个普适性，根据酶的分类，选取了在工业上应用较强的漆酶，属于氧化还原酶大类(rml属于水解酶)，在食品中应用非常广泛。例如：改善面包烘培后的质地、外观、味道；去除啤酒、白酒、苹果汁、葡萄汁加工中的一些不利酚类化合物，保持其风味，降低它们的变色和变质的速度。[0080]1关键内部空腔和突变位点的筛选[0081]本实例以野生型漆酶的晶体结构(pdbid:1w8r,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，加入na /cl-1中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman调节压力。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟。整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0082]聚类分析选取不同平行具有代表性的构象。然后通过aquc-duct分析蛋白轨迹并利用mcvol进行空腔计算(腔体的最小体积限制在不小于的范围)，筛选到8个内部关键空腔(图4)。按照b-factor值由大到小排序，结合关键空腔筛选出空腔贡献率大于30％的氨基酸残基。通过约束活性三联体进一步筛选出25个氨基酸残基。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性，鉴定了6个潜在的突变体，t102v，t102m，s258a，t340l，t102f，g271m。[0083]2突变体的构建[0084]选取来自bacillussubtili来源的漆酶(bsl)作为研究对象(genbank：cp053102.1)。bsl采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28a，宿主为e.colijm109和e.colibl21(de3)。首先构建了重组质粒pet-28a-wt，作为后续构建漆酶突变体的模板。在漆酶基因的5’端和3’端分别添加bamhi和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用bamhi和ecori分别对合成的漆酶全长基因和pet-28a载体进行双酶切，反应体系为50μl：漆酶基因(或pet-28a质粒)20μl；10xqbuffer5μl；bamhi和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对bsl基因及pet-28a质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对bsl基因和载体pet-28a进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28a质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表3所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28a-wt为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28a-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0085]表3突变体引物序列[0086][0087]3蛋白诱导表达、纯化及酶学性质测定[0088]蛋白诱导表达条件：20℃，200r·min-1，2mmcuso4，iptg终浓度0.5mm，诱导12-16h。诱导结束后离心收集上请为粗酶液。本实验采用的载体pet-28a自带his标签，因此采用镍离子亲和层析原理对粗酶液进行纯化，纯化前粗酶液于4℃，12000rmin-1离心10min，再用0.22μm的水系过滤器过滤上请，进一步去杂质。将6个bsl突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0089]用分光光度计检测漆酶与底物反应后的吸光度，计算漆酶活性。酶的活性定义为每分钟氧化1μmol底物时所需的酶量为1个酶活单位(u)。总反应体系为1.5ml，2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(abts)为底物时，体系含终浓度为1mmabts，纯化酶液以及磷酸盐缓冲液，30℃水浴3min后于420nm处测定od值，所有反应均重复3次。[0090]表4表明突变体t102v，t102m，s258a，t340l，t102f，g271m比活相对野生型分别提高37％，170％，113％，97％，10％，73％。同时，所有突变体的动力学常数均得到了提高，表明漆酶的催化效率得到了提高。突变体t102v，t102m，s258a，g271m在70℃下半衰期分别提高11min，58min，16min，14min，表明热稳定性显著提高。[0091]表4野生型及突变体比酶活、t1/2以及动力学参数[0092][0093]实施例3：微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(microbialtransglutaminase,mtg)[0094]同理，为了证明该方法的一个普适性，根据酶的分类，同样选取了在工业上应用较强的微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，属于转移酶大类，被誉为21世纪超级粘合剂，在食品中应用非常广泛。例如：在肉制品中应用最广泛，可将碎肉粘结成块，改善食品质构，提高肉制品的口感，风味组织结构和营养。[0095]1关键内部空腔和突变位点的筛选[0096]本实例以野生型谷氨酰胺转氨酶的晶体结构(pdbid:3iu0,resolution)为初始模型，采用gromacs(2019.03版)进行分子动力学模拟。采用tip4p水模型，加入na /cl-1中和电荷使整个体系达到平衡状态。采用50000步的最速下降法对系统进行能量最小化，以保证结构正常、原子间距离合适以及几何构型合理，然后进行400ps的位置限制性预平衡(nvt、npt)，采用berendsen温度耦合将系统温度加热至313k，使用parrinell-rahman调节压力。待体系平衡后，移除限制进行成品模拟。整个模拟过程采用leap-frog算法进行积分，利用pme方法计算远距离静电势能。限定约束算法选择lincs，精度设置为1，4。邻近搜索的截断方式为verlet，搜索方式为格子搜索(grid)，为保证结果的可重复性与公正性，模拟均以不同初始速度执行五次，持续时间为30ns。[0097]选取不同平行的模拟结构通过聚类分析选取代表性构象。利用aquc-duct分析蛋白轨迹并利用mcvol进行空腔计算(腔体的最小体积限制在不小于的范围)，筛选到7个内部关键空腔(图5)。按照b-factor值由大到小排序，随后筛选出空腔贡献率大于30％的氨基酸残基。通过约束活性三联体进一步筛选出36个氨基酸残基。最后，利用foldx和rosetta算法的互补性，鉴定了7个潜在的突变体，g264f，g264l，g264m，n285f，t309f，t309l，t367m。[0098]2突变体的构建[0099]选取来自streptomycesmobaraensis来源的谷氨酰胺转氨酶(stg)作为研究对象(genbank：y18315.1)。stg采用大肠杆菌表达系统进行蛋白表达，选用的质粒pet-28c，宿主为e.colijm109和e.colibl21(de3)。首先构建了重组质粒pet-28c-wt，作为后续构建漆酶突变体的模板。在漆酶基因的5’端和3’端分别添加xbai和ecori限制性酶切位点，将设计好的基因序列送往金唯智生物科技有限公司合成。用xbai和ecori分别对合成的stg全长基因和pet-28c载体进行双酶切，反应体系为50μl：stg基因(或pet-28c质粒)20μl；10xqbuffer5μl；xbai和ecori各2μl；ddh2o21μl。酶切条件：37℃，2h。酶切结束后，将酶切产物进行核酸凝胶电泳验证，根据目的条带大小切胶，用dna胶回收试剂盒对stg基因及pet-28c质粒的双酶切产物作胶回收处理。用t4dna连接酶对stg基因和载体pet-28c进行连接，反应体系为10μl：目的片段6μl；pet-28c质粒2μl；10xt4dnaligasebuffer1μl；t4dnaligase1μl，置于16℃金属浴过夜连接10-12h。连接结束后，使用pcr产物纯化试剂盒对目的基因与载体的连接产物进行纯化，转入e.colijm109于200r/min培养7h，之后转化液涂布含有硫酸卡那霉素(50μg/ml)的lb平板培养12-16h。挑取单菌落于含卡那霉素的lb培养基中震荡培养6-8h，进行菌液pcr验证和测序验证，验证正确的重组子进行后续实验。突变体重组质粒的构建。设计引物并送往金唯智生物科技有限公司合成，引物设计结果如表4所示。引物合成完毕，以重组质粒pet-28c-wt为模板进行全质粒pcr扩增，构建突变体重组质粒，pcr反应体系为50μl：ddh2o18μl；2xmaxbuffer25μl；dntpmix(10mm)1μl；pet-28c-wt模板1μl；上下游引物(10mm)各2μl；phantamaxsuper-fidelitydnaploymerase1μl。pcr反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用dpni酶对pcr产物进行消化，将消化产物转入质粒扩增菌株e.colijm109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入蛋白表达菌株e.colibl21(de3)于-20℃保存。[0100]表5突变体引物序列[0101][0102]3蛋白诱导表达、纯化及酶学性质测定[0103]蛋白诱导表达条件：20℃，200r·min-1，iptg终浓度0.5mm，诱导12-16h。诱导结束后离心收集上请为粗酶液。本实验采用的载体pet-28c自带his标签，因此采用镍离子亲和层析原理对粗酶液进行纯化，纯化前粗酶液于4℃，12000rmin-1离心10min，再用0.22μm的水系过滤器过滤上请，进一步去杂质。将6个bsl突变体进行克隆、表达并纯化，使用镍离子亲和层析柱(1ml/5mlhistrapff)和aktaavant蛋白质纯化仪对粗酶液进行纯化，纯化步骤如下：(1)冲洗系统管路：由于系统管路均保存于20％的乙醇中，需优先使用超纯水冲洗管路和泵。(2)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(10个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mm的结合缓冲液平衡柱子(10个柱体积)。(3)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mlmin-1(或5mlmin-1)的流速上样。(4)洗脱：先用咪唑终浓度为20mm的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mm的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(5)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，多次纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(6)将纯化收集的酶液进行sds-page验证，待验证成功后进行酶学性质测定。[0104]用分光光度计检测stg与底物反应后的吸光度(600nm)，计算stg活性。酶活力单位(u)定义为：37℃时每分钟催化底物生成1μmoll-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量。比酶活(u/mg)定义为：每毫克蛋白具有的酶活力单位。样品酶活的测定如下：以200μl此经适当稀释的酶液与500μl底物试剂混合，37℃水浴10min后迅速加入200μl10％三氯乙酸，37℃水浴5min，反应液4000r/min离心5min，取上清于525nm波长处测定吸光值，计算酶活，所有反应均重复3次。[0105]表6表明突变体g263l，g263m，n284f，t308f，t366m比活相对野生型分别提高14％，125％，78％，64％，44％。同时，催化常数分别提高7.84％，2.57％，64.71％，49.02％，29.41％表明谷氨酰胺转氨酶的催化效率得到了提高。g263l，g263m，n284f，t308f，t366m的t1/2分别提高22％，214％，8％，72％，48％，表明这些突变体的热稳定性显著提高。[0106]表6野生型及突变体比酶活以及动力学参数[0107][0108]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12当前第1页12
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