用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物、检测试剂及其应用

1.本发明设计一种用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物、检测试剂及其应用。
技术背景
2.随着核电、同位素和放射治疗的广泛应用，人们长期低剂量电离辐射暴露的机会越来越多。同时，饮食结构的变化使得高糖高脂饮食方式带来的糖尿病发病人群不断增加。长期低剂量辐射联合高糖高脂饮食带来的健康影响越来越引起广泛关注。
3.地球上存在相当数量的放射矿资源和放射矿废渣，它们释放出的各种射线，通过电离和激发作用，对微生物、动植物、人类造成长期的潜在低剂量辐射危害。比如，我国有多处铀废石和铀尾矿等固体废物堆放场地，铀废石铀尾矿中含有多种放射性核素，环境中的放射性核素既可通过电离和激发作用释放出各种射线，对生物体造成辐射损伤，又可进入生物体对其造成内照射损伤，威胁健康。此外，人类长期接触低剂量辐射的风险日益增加。放疗科医护人员长期操作x射线对正常人进行体检或者诊断和检查患者；军队人员长期进行武器装甲及金属质量检测；国家安保人员进行反恐安检等。
4.根据联合国原子辐射效应科学委员会(unscear)1986年的报告书规定，就人体照射而言，将剂量在0.2gy以内的低let(传能线密度)辐射和剂量在0.05gy的高let辐射之间，同时剂量率在0.05m gy/min以内的辐射定义为低水平辐射。在实际研究中，照射剂量符合上述条件而剂量率高于0.05m gy/min的辐射称为低剂量电离辐射(ldr)。研究表明长期低剂量辐射暴露对机体可以造成不可逆损伤，有可能引发恶性肿瘤、血液系统疾病及炎症纤维化等不良反应。个体暴露于低剂量电离辐射后，可能在几小时或几天内不会出现明显的症状，也可能在数年后才表现出造血系统和免疫系统的进行性损伤及致癌效应。
5.糖尿病(diabetes mellitus，dm)是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以血糖升高为特征的代谢性疾病，其受环境因素和遗传因素的影响。目前糖尿病导致的死亡率较高，在发达国家仅次于心血管疾病和恶性肿瘤。长期糖尿病引起的并发症，可以导致器官的功能障碍和衰竭。有研究发现长期低剂量辐射暴露可以促进糖尿病的发生发展，以往对于糖尿病的诊断往往重视血糖标准的制定，高糖高脂饮食作为危险因素对糖尿病的发病影响，而忽视了环境中物理因素如电离辐射对机体的影响。因此，开发一种同时考虑环境电离辐射联合高糖高脂因素暴露的糖尿病诊断粪便生物标志物具有重要意义，对早期低剂量辐射风险的评估和暴露人群的糖尿病管理都具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明的发明人通过超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠粪便进行代谢组学分析，获得了一种用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物，其灵敏度和特异性高，预测性好，可用于糖尿病人群特别是长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露糖尿病人群的早期诊断或预防。
7.为此，本发明的第一方面提供了一种用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物，所述粪便生物标志物包括2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸、吲哚乙酸、对羟基苯乙酸、醋酸、甲状腺素、4-羟基苯丙酮酸、肉豆蔻酸或苯乙酸中的一种或多种。
8.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物包括甲状腺素、醋酸、对羟基苯乙酸、苯乙酸、4-羟基苯丙酮酸或肉豆蔻酸中的一种或多种，以及2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸或吲哚乙酸中的一种或多种。
9.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物包括2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸、吲哚乙酸、对羟基苯乙酸、醋酸、甲状腺素、4-羟基苯丙酮酸、肉豆蔻酸和苯乙酸。
10.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物来源于粪便。
11.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物通过基于液相色谱-质谱联用分析的代谢组学方法获得。
12.根据本发明的一些实施方式，所述糖尿病为长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露所致的糖尿病。
13.本发明的发明人通过超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠粪便进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型构建及判别分析，从而发现正常小鼠和长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露小鼠之间的特征性差异代谢物，并进一步分析特征性差异代谢物的含量变化，找到了由长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露引起的特异性差异代谢产物，即长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露所致糖尿病的早期诊断分子标志物。本发明获得所述粪便生物标志物采用的方法具有方便快捷的特点，并且能够准确反映长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露小鼠与正常小鼠的代谢谱差异，特异性高。
14.本发明的第二方面提供了一种用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物的检测试剂，所述检测试剂包括检测第一方面所述的粪便生物标志物的试剂。
15.本发明的第三方面提供了一种用于诊断或预防糖尿病的粪便生物标志物的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第二方面所述的检测试剂。
16.本发明的第四方面提供了一种粪便生物标志物在制备用于诊断或预防糖尿病的试剂盒中的应用，其中，所述粪便生物标志物包括2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸、吲哚乙酸、对羟基苯乙酸、醋酸、甲状腺素、4-羟基苯丙酮酸、肉豆蔻酸或苯乙酸中的一种或多种。
17.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物包括甲状腺素、醋酸、对羟基苯乙酸、苯乙酸、4-羟基苯丙酮酸或肉豆蔻酸中的一种或多种，以及2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸或吲哚乙酸中的一种或多种。
18.根据本发明的一些实施方式，所述粪便生物标志物包括2-羟基己酸、苯丙氨酸、缬氨酸、乙酰色氨酸、十九烷酸、草酸、吡啶甲酸、α-羟基异丁酸、吲哚乙酸、对羟基苯乙酸、醋酸、甲状腺素、4-羟基苯丙酮酸、肉豆蔻酸和苯乙酸。
19.根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒包括用于检测所述粪便生物标志物的物质和可选的所述粪便生物标志物的标准品。
20.根据本发明的一些实施方式，通过基于液相色谱-质谱联用分析的代谢组学方法测定所述粪便生物标志物的水平。
21.根据本发明的一些实施方式，通过基于液相色谱-质谱联用分析的代谢组学方法测定受试者的粪便样品中所述粪便生物标志物的水平。
22.根据本发明的一些实施方式，所述糖尿病为长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露所致的糖尿病。
23.本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
24.1)采集来自受试者的粪便样品，进行预处理，获得能够进行标志物测定的待测样品；
25.2)测定步骤1)获得的待测样品中所述粪便生物标志物的水平；
26.3)将步骤2)中获得的所述粪便生物标志物的水平与健康对照的参考值进行比较。
27.根据本发明的一些实施方式，所述健康对照为所述粪便生物标志物的标准品。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.(1)本发明提供了一种用于糖尿病特别是长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露所致的糖尿病的早期诊断或预防的粪便生物标志物，该粪便生物标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(auc)均大于0.9，表明本发明提供的粪便生物标志物的预测性较好。
30.(2)本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠粪便进行代谢组学分析，方便快捷，并且能够准确反映长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露小鼠与正常小鼠的代谢谱差异，特异性高，可用于糖尿病人群特别是长期低剂量放射与高糖高脂饮食联合暴露糖尿病人群的早期诊断或预防。
附图说明
31.图1示出了根据本发明的实施例1得到的不同处理组小鼠的代谢物差异分析图。
32.图2示出了根据本发明的实施例1得到的不同处理组小鼠代谢物的主成分分析图，pc1表示第一主成分，pc2表示第二主成分，pc3表示第三主成分，百分比则表示主成分对样品差异的贡献率。
33.图3示出了根据本发明的实施例1得到的差异表达代谢物谱的聚类分析图。
34.图4示出了根据本发明的实施例1得到的差异表达代谢物谱的功能预测分析。
35.图5示出了根据本发明的实施例1得到的不同处理组小鼠粪便中菌群丰度差异。
36.图6示出了根据本发明的实施例2中不同处理组小鼠接受粪便细菌灌胃的时间线。
37.图7示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的血糖水平。
38.图8示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的葡萄糖耐量。
39.图9示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的胰岛素耐量。
40.图10示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的胰岛素水平。
41.图11示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的胰岛素抵抗指数。
42.图12示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的空腹血糖值。
43.图13示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的脯氨酸水平。
44.图14示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后的脂多糖水平。
45.图15示出了根据本发明的实施例2得到的不同处理组小鼠灌胃后代表性灰色脂肪和肝组织的h&e染色情况。
具体实施方式
46.以下结合实例和附图对本发明的具体实施作出进一步说明，旨在说明本发明，而不应视为对本发明的限制。
47.若未特别指明，实施例中所用的方法为本领域技术人员所熟知的常规方法。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品。
48.本发明中，正交偏最小二乘判别分析(opls-da)能够将x矩阵信息分解成与y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。具体流程为：使用simca软件对数据进行对数转换加uv格式化处理，首先对第一主成分进行opls-da建模分析，模型的质量用7折交叉验证(7-fold cross validation)进行检验；然后用交叉验证后得到的r2y(模型对分类变量y的解释度)和q2(模型的预测性)对模型有效性进行评判；最后通过置换检验(permutation test)，随机200次改变分类变量y的排列顺序得到不同的随机q2值，从而对模型有效性做进一步的检验。
49.本发明中，单因素方差分析(one-way anova)也称为f检验，是通过对数据变异的分析来推断两个或多个样本均数所代表的总体均数是否有差别的一种统计推断方法。简单的来说，就是用来检验同一个影响因素的不同水平对因量是否有影响的一种方法。与通常的统计推断问题一样，方差分析的任务也是先根据实际情况提出原假设h0与备择假设h1，然后寻找适当的检验统计量进行假设检验。
50.本发明中，p值即概率，反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的p值，一般以p《0.05为显著，p《0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于p值即概率，反映某一事件发生的可能性大小。
51.实施例1
52.(1)用6-8周龄健康小鼠进行实验，将小鼠分成四个实验组，每组3只小鼠，分别为：正常对照组(con)、低剂量辐射组(ldr)、高糖高脂饮食组(hfd)、高糖高脂饮食联合低剂量辐射组(ldr hfd)；正常对照组不做处理，低剂量辐射组小鼠通过每周照射1次钴60射线，剂量为0.05gy，连续照射10周，高糖高脂饮食组采用高糖高脂饮食喂养，高糖高脂饮食联合低剂量辐射组为高糖高脂饮食和每周照射1次钴60射线，剂量为0.05gy，连续照射10周。小鼠饲养时间为3个月。
53.(2)分别收集四个实验组小鼠的粪便样本，加入90μl甲醇，涡旋混匀后于4℃沉淀蛋白过夜，然后4℃下10000g离心10min，取上清液即得供试品溶液；样品在冰浴上解冻以减少样品降解。将约10mg样本转移至1.5ml离心管中，加入25μl水和氧化锆珠研磨3分钟。加入185μl乙腈/甲醇(8/2)提取代谢物。18000g下离心20min，之后将上清转移至96孔板中，每孔加入20μl衍生试剂，30℃衍生化60min。加入350μl50％体积分数的冰冷甲醇进行稀释。在-20℃冷藏20min，在4000g和4℃下离心30min。吸取135μl上清液与15μl内标于新的96孔板中，之后进行上机检测。
54.(3)使用超高效液相色谱-串联质谱法检测供试品溶液用于本实施例代谢产物的
定量。利用常规的色谱条件：预柱：acquitybeh c18色谱柱(2.1
×
5mm，1.7μm，美国waters公司)，分析柱:acquitybeh c18色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm，美国waters公司)，进样量5μl，柱温40℃，流动相a-0.1％甲酸，流动相b-乙腈/ipa(90:10)，流速0.4ml/min；梯度洗脱程序如下：0-1min，5％b；1-12min，5-80％b；12-15min，80-95％b；15-16min，95-100％b；16-18min，100％b；18-18.1min，100-5％b；18.1-20min，5％b。质谱ms条件：电喷雾电离(esi)源，正负离子电离模式。源温度150℃，脱溶剂温度550℃，脱溶剂气流速1000l/hr。
55.(4)进一步使用正交偏最小二乘判别分析(opls-da)筛选差异代谢物，并通过单因素方差分析(one-way anova)对各组间的差异变量进行统计学分析，p《0.05表明差异有统计学意义。当投影中的变量重要性(vip)》2，p《0.05且最小变异系数(cv)≥30时，被认为是差异代谢物。表1示出了根据小鼠的粪便代谢组学分析得到的差异代谢物，表明不同代谢物在正常对照组、低剂量辐射组、高糖高脂饮食组和高糖高脂饮食联合低剂量辐射组中的表达差异。
56.表1
57.代谢物p值2-羟基己酸0.022109128苯丙氨酸0.022109128缬氨酸0.022109128乙酰色氨酸0.022109128十九烷酸0.022109128草酸0.022109128吡啶甲酸0.022109128α-羟基异丁酸0.027323722吲哚乙酸0.027323722对羟基苯乙酸0.027323722醋酸0.034863256甲状腺素0.0348632564-羟基苯丙酮酸0.03899022肉豆蔻酸0.03899022苯乙酸0.03899022
58.图1为不同处理组小鼠的代谢物差异分析图，表明经过不同处理的小鼠的代谢物具有显著差异。图2为不同处理组小鼠代谢物的主成分分析图，其中，a、b、c、d分别代表正常对照组、低剂量辐射组、高糖高脂饮食组和高糖高脂饮食联合低剂量辐射组，pc1表示第一主成分，pc2表示第二主成分，pc3表示第三主成分；百分比则表示主成分对样品差异的贡献率，不同颜色代表样品属于不同的分组，两点之间的距离越远，表示两个样品的代谢物差异越大。图3为所得到的差异表达代谢物谱的聚类分析图。图4预测了与差异表达代谢物相关的细胞功能，为进一步研究差异表达代谢物的功能提供理论依据；其中，x轴基于pathway impact value(来自通路拓扑分析)，；y轴基于p值(来自通路富集分析)；节点颜色基于p值，由浅到深，p值由大到小，节点半径基于其pathway impact value，由小到大，impact值由小
到大。
59.对上述不同处理组小鼠粪便样品中的菌群进行测定，结果如图5所示。图5示出了不同处理组小鼠粪便中菌群丰度的差异，代表不同菌群的相对丰度，其中，*p《0.05；**p《0.01。
60.实施例2
61.本实施例研究了hfd(高糖高脂饮食组)、ldr hfd(高糖高脂饮食联合低剂量辐射组)小鼠的粪便菌群移植对胰岛素敏感性、脯氨酸(pa)代谢和pycr1表达的影响。将健康对照组、hfd病例和ldr hfd病例的粪便悬液移植小鼠，分别定义为trans-con、trans-hfd和trans-hfd ldr。图6示出了肠道微生物群抗生素耗尽后的小鼠接受粪便细菌灌胃的时间线，其中，每组采用5只小鼠，在饮用水中用抗生素治疗4天后，每周两次用粪便悬浮液灌胃小鼠，于肠道微生物群抗生素耗尽后的第25天进行检测。图7-14分别显示了不同处理组小鼠灌胃后的检测的血糖水平、葡萄糖耐量、胰岛素耐量、胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、空腹血糖值、脯氨酸水平、脂多糖水平的结果，图15不同处理组小鼠灌胃后代表性灰色脂肪和肝组织的h&e染色情况。
62.图7表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其血糖水平下降更快，且高糖高脂饮食联合低剂量辐射组比高糖高脂饮食组血糖水平下降更快。
63.图8表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其葡萄糖耐量显著增加，且高糖高脂饮食联合低剂量辐射组其葡萄糖耐量更大。
64.图9表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其胰岛素耐量显著增加，且高糖高脂饮食联合低剂量辐射组其胰岛素耐量更大。
65.图10表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其胰岛素水平显著下降，但高糖高脂饮食联合低剂量辐射组与高糖高脂饮食组之间无明显差异。
66.图11表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其胰岛素抵抗指数显著增大，但高糖高脂饮食联合低剂量辐射组与高糖高脂饮食组之间无明显差异。
67.图12表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其空腹血糖值显著增大，但高糖高脂饮食联合低剂量辐射组与高糖高脂饮食组之间无明显差异。
68.图13表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其脯氨酸水平显著增高，但高糖高脂饮食联合低剂量辐射组与高糖高脂饮食组之间无明显差异。
69.图14表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组接受粪便悬浮液移植后其lps水平显著增高，且高糖高脂饮食联合低剂量辐射组比高糖高脂饮食组的lps水平更高。
70.图15则表明，与健康对照组相比，高糖高脂饮食组和高糖高脂饮食联合低剂量辐射组中空泡增多变大，细胞核的固缩和染色质的边集和核的碎裂更严重。
71.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。