一种基于分子信标筛选三螺旋DNA嵌入剂的“turnon”型荧光传感器

一种基于分子信标筛选三螺旋dna嵌入剂的“turn on”型荧光传感器
技术领域
1.本发明涉及一种基于分子信标筛选三螺旋dna嵌入剂的“turnon”型荧光传感器，属于生物传感器领域。


背景技术：

2.三螺旋dna在分子识别、基因表达调控和基因疾病的诊疗等方面有重要作 用，一直是人们关注的热点。三螺旋dna通常由第三条链(tfo)与同型嘌呤
· 同型嘧啶双螺旋dna(dsdna)形成。平行三螺旋dna因为tfo中胞嘧啶碱基 需要质子化才能形成c
·
g*c

三碱基体(其中
·
表示watson-crick键，*表示 hoogsteen键)，在生理条件下很难形成。构成三螺旋dna的hoogsteen氢键 的稳定性也远低于双螺旋dna的watson-crick氢键。由于这些原因，三螺旋 dna在生理条件下的实际应用大大受限，克服这一限制的方法就是筛选嵌入剂 增加三螺旋dna的稳定性。因此建立筛选三螺旋dna嵌入剂的传感器具有重 要意义。
3.筛选三螺旋dna嵌入剂的方法有金纳米溶胶法、高效液相色谱-质谱法、竞 争透析法、紫外-可见分光光度法解链实验等。但这些方法大多劳动强度较大， 相对较复杂和缓慢，有些还需要昂贵的精密设备。相对而言，荧光法具有操作 简单、成本低、灵敏度高等优点，得到广泛应用。tseng等报道了一种筛选三螺 旋dna稳定试剂的“turn-off”型荧光法。然而，最理想的荧光传感器具有“turn-on
”ꢀ
型特性，以降低背景噪声，同时具有高灵敏度和高选择性。vasquez等构建了一 种嵌入剂置换法用于筛选三螺旋dna稳定试剂，该方法虽然简单、快速，但要 求被筛选的稳定试剂与三螺旋dna的键合能力必须高于嵌入剂-甲氧檗因。
4.分子信标(molecular beacon，mb)最早由tyagi和kramer于1996年提出， 是一种中间为环、两端碱基互补为茎的发夹结构寡聚核苷酸序列，其茎的两端分 别标记有荧光基团和猝灭基团。mb已成为一种dna探针，广泛应用于各种目 标分析物，如凝血酶、转录因子、核酸、信使rna(mrna)、重金属离子、 microrna(mirna)等。这里，发明人拟利用mb与目标双螺旋dna之间三螺 旋dna的形成需要嵌入剂的稳定作用，构建了一种“turn-on”型荧光法筛选稳 定三螺旋dna嵌入剂的传感器。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是：提供一种基于分子信标筛选三螺旋 dna嵌入剂的“turn on”型荧光传感器，解决构成三螺旋dna的 hoogsteen氢键稳定性较差的技术问题。
6.本发明的技术方案是：一种基于分子信标筛选三螺旋dna嵌入剂 的“turn on”型荧光传感器，所述的传感器包含一条具有茎环结构 的双标记dna ccp2和一条双螺旋dna t18ab，所述的双标记dna序 列如所示seq id no.1，所述的双螺旋dna序列如seq id no.2和seqid no.3所示。
7.进一步的，所述的传感器还包含精胺。
8.进一步的，所述的传感器的工作条件为：5～50mmol/l pbs作为 工作缓冲溶液，0.01～0.15mmol/l精胺，传感器序列ccp2与t
18ab
均 为20～200nmol/l。
9.进一步的，所述的pbs中包含15mmol/l nano3。
10.进一步的，所述的嵌入剂包含黄藤素和新霉素。
11.优选的，所述的传感器的工作条件为：20mmol/l pbs作为工作 缓冲溶液，0.06mmol/l精胺，传感器序列ccp2与t
18ab
均为100 nmol/l。
12.本发明的有益效果：本发明涉及一条具有茎环结构的双标记dna (ccp2)和一条特定的双螺旋dna(t
18ab
)作为筛选三螺旋dna嵌入 剂的传感器序列。当没有嵌入剂(有机药物分子)存在时，双标记 dna两端碱基互补配对形成茎环结构，标记的荧光团与淬灭基团密切 靠近，荧光信号相对较弱；当有嵌入剂存在时，由于嵌入剂具有稳定 三螺旋dna的作用，两条传感器序列形成分子间三螺旋dna，双标记 dna的茎环结构打开，荧光信号增强，基于这一原理构筑了双标记荧 光法筛选三螺旋dna嵌入剂的传感器。优化后确定传感器的实验条件 为：20mmol/l pbs(ph 7.5，含15mmol/l nano3)作为工作缓冲溶 液，0.06mmol/l精胺，传感器序列ccp2与t
18ab
均为100nmol/l。 采用该传感器方法对黄藤素、黄连素、新霉素、卡那霉素、eb、dapi、 四环素等有机药物分子进行嵌入剂筛选，通过多次实验发现加入黄藤 素、黄连素、新霉素三种药物分子的荧光强度增加较为明显，说明这 些药物分子有稳定三螺旋dna的嵌入剂效果，然而卡那霉素、eb、 dapi、四环素等则没有明显的嵌入剂作用。对药物本身的荧光及其对 荧光团的干扰进行了测试，发现信号都非常弱，则三种药物分子的加 入导致荧光增强是由于其稳定三螺旋dna引起。采用圆二色谱对有无 有机药物分子的溶液进行研究，发现存在黄藤素、黄连素、新霉素时 三螺旋dna的特征圆二色谱峰强度明显增加，与荧光光谱结果一致。。
附图说明
13.图1为实验可行性分析，(a)100nmol/l ccp2；(b)a 100nmol/l t
18ab
；(c)b 4μmol/l黄连素；
14.图2为有无黄连素溶液的圆二色谱，(a)7.5μmol/l ccp2；(b) a 7.5μmol/l t
18ab
；(c)b 0.13mmol/l黄连素；
15.图3为精胺浓度的优化，(a)不同精胺浓度溶液在705nm的荧 光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/l黄连素)；(b)不同精胺浓 度下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。精胺的浓度分别 为0.02mmol/l、0.06mmol/l、0.12mmol/l、0.18mmol/l、0.30 mmol/l；
16.图4为ph的优化，(a)不同ph溶液在705nm的荧光强度(a： 无黄连素，b：有4μmol/l黄连素)；(b)不同ph下加与不加黄连 素的溶液荧光强度的增加百分比；
17.图5为存在不同有机药物分子溶液的荧光光谱，(a)有机药物 分子分别为：(a)无药物分子，(b)8μmol/l新霉素，(c)8μmol/l 黄藤素，(d)8μmol/l黄连素，(e)2μmol/l coralyne；(b) 有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(f)8μmol/l eb，(g) 8μmol/l dapi，(h)8μmol/l卡那霉素，(i)8μmol/l四环素；
18.图6为存在不同有机小分子溶液在705nm的荧光强度，有机药物 分子分别为：无药物分子，8μmol/l黄藤素，8μmol/l黄连素，2 μmol/l coralyne，8μmol/l新霉素，8μmol/l四环素，8μmol/l 卡那霉素，8μmol/l dapi，8μmol/l eb；
溶液加热到90℃保持5分钟后退火)结合， 加入嵌入剂(有机药物分子)后，dna结构发生转化，折叠形成分子 间三螺旋dna，两端标记的荧光团与淬灭基团相互远离，荧光信号增 强；当无有机药物分子存在时，荧光信号相对较弱；另外还在体系里 面加入了精胺，精胺在三螺旋dna形成的过程中起到辅助作用，据此 建立双标记荧光法筛选三螺旋dna嵌入剂的传感器研究。
48.dna浓度的测定
49.分别在ccp2、ccp2(无标记)、t
18a
、t
18b
的离心管中加入指定体 积的20mmol/l pbs7.5的缓冲溶液(开盖前先离心30～60s)，放 在旋涡混合仪上震荡使其充分溶解，取出10μl加20mmol/l pbs7.5 的缓冲溶液稀释100倍，然后用紫外可见分光光度计对它们进行定 量。
50.荧光光谱的测定
51.(1)样品的制备
52.实验步骤：室温24℃下，在ph 7.5的20mmol/l pbs缓冲溶液 (含15mmol/l nano3)中，加入10μl 5μmol/l t
18ab
，再加入10μl3mmol/l精胺溶液，然后再分别加入
①
无有机药物小分子、
②
10μl400μmol/l黄藤素、
③
10μl 400μmol/l黄连素、
④
10μl 400μmol/l 新霉素、
⑤
10μl 400μmol/l四环素、
⑥
10μl 400μmol/l卡那霉 素、
⑦
10μl 400μmol/l dapi、
⑧
10μl 400μmol/l eb，最后卡 表每过一分钟加入10μl 5μmol/l双标记dna序列(ccp2)，摇匀， 保留55min，其余荧光光谱的测定实验步骤和上述步骤类似。
53.(2)样品荧光光谱的测定
54.准备好待测样品，保留55min后开始测量，
①
先打开电脑；
②ꢀ
打开仪器；
③
打开软件fluoracle，初始化完成后，软件跳出signalrate对话框，在其界面调节样品信号，在source of light path中 选择光源为xenon lamp，detector of light path中选择检测器为 visible pmt-900，选完后，将excitation和emission的 bandwidth(也就是狭缝)调到4.00nm；
④
在setup里面打开氙灯；
ꢀ⑤
在λ里面设置参数，激发波长为684nm，扫描范围为694～750nm；
ꢀ⑥
将待测样品放入卡槽里面，点击emission scan模式(ctrl m 回 车)，开始扫描溶液的荧光发射光谱，每间隔一分钟测量一个样。
55.圆二色谱的测定
56.1.样品的制备
57.(1)空白缓冲溶液：工作缓冲溶液(20mmol/l pbs 7.5(含 有0.06mmol/l的精胺、15mmol/l nacl))；(2)t
18ab
溶液：工作 缓冲溶液 7.5μmol/l t
18ab
；(3)无标记ccp2溶液：工作缓冲溶液 7.5μmol/l无标记-ccp2；(4)无标记ccp2与t
18ab
混合溶液：7.5 μmol/l t
18ab
工作缓冲溶液 7.5μmol/l无标记-ccp2；(5)(4) 0.13 mmol/l黄藤素；(6)(4) 0.13mmol/l黄连素；(7)(4) 0.03 mmol/l新霉素；(8)(4) 0.13mmol/l四环素；(9)(4) 0.13 mmol/l卡那霉素；(10)(4) 0.13mmol/l dapi；(11)(4) 0.13 mmol/l eb。配制待测溶液的时候需要卡表，每间隔5分钟配一个样， 保留30分钟后开始测量。
58.2.圆二色谱的测定
59.配制好待测样品，保留30分钟后开始测量，首先打开氮气的阀 门，通氮气吹扫10min左右，再打开电源，打开电脑和软件，将步 长设置为1nm，宽带设置为1nm，响应时间设置为0.25s，采用圆 二色谱仪扫描溶液在200～320nm的光谱图，每一个样要扫描3次， 样品
平均扣除空白缓冲溶液平均得到每个对应样的结果。
60.可行性分析
61.为了检验双标记dna序列(ccp2)筛选三螺旋dna嵌入剂实验可 行性。选择了比较经典的稳定三螺旋dna的嵌入剂(黄连素)进行试 验，测试如下：(a)ccp2 精胺；(b)ccp2 t
18ab
精胺；(c)ccp2 5 μmol/l t
18ab
黄连素 精胺的三种反应溶液，结果如图1所示。
62.20mmol/l pbs(na2hpo
4-nah2po4磷酸缓冲盐溶液，ph 7.5，含15 mmol/l nano3)缓冲溶液，0.06mmol/l精胺，混合保留时间55分钟。 (a)100nmol/l ccp2；(b)a 100nmol/l t
18ab
；(c)b 4μmol/l 黄连素。
63.上述实验结果表明，当反应溶液中没有t
18ab
和黄连素时，荧光强 度较弱(如图1曲线a)；当反应溶液中有t
18ab
但无黄连素时，荧光 强度略有增强(曲线b)，说明有少量三螺旋dna形成；当反应溶液 中同时有t
18ab
和黄连素存在时，荧光强度明显增强(曲线c)，说明 黄连素有稳定三螺旋dna的效果。该结果表明利用双标记dna序列 (ccp2)作为传感器序列筛选稳定三螺旋dna的嵌入剂切实可行。
64.实验机理的探讨
65.为了进一步证明双标记dna序列(ccp2)作为传感器序列筛选嵌 入剂的实验可行性，考察了黄连素对稳定三螺旋dna的作用机理，采 用圆二色谱对有无黄连素的溶液进行研究。20mmol/l pbs(ph 7.5， 含15mmol/l nacl，0.06mmol/l精胺)缓冲溶液，反应溶液保留30分钟。(a)7.5μmol/l ccp2；(b)a 7.5μmol/l t
18ab
；(c) b 0.13mmol/l黄连素。
66.如图2所示，210nm处的负峰为三螺旋dna的特征峰，当溶液中 无黄连素存在时，在210nm处有一个较弱的负圆二色峰(曲线b)， 这是由于形成少量三螺旋dna的缘故；但当溶液中存在黄连素时，210 nm处的负圆二色峰变得更强(曲线c)，说明黄连素在该体系中促进 了三螺旋dna形成。该实验结果表明，实验可行性分析中加入黄连素 导致的荧光增强是通过其稳定三螺旋dna引起。
67.精胺浓度对体系的影响
68.双标记荧光法筛选三螺旋dna嵌入剂的传感器受多种因素的影 响，为了获得加入相同量嵌入剂(黄连素)产生最大信号变化值，对 影响溶液荧光值的实验条件进行优化，以便加入嵌入剂能产生最大荧 光值改变值δif(δif＝i
f-i
f0
)(if：有黄连素；i
f0
：无黄连素)。 测量溶液在694-750nm波长范围的荧光光谱图，结果见图3所示。
69.20mmol/l pbs(ph 7.5，含15mmol/l nano3)缓冲溶液，100 nmol/l t
18ab
，100nmol/l ccp2。(a)不同精胺浓度溶液在705nm 的荧光强度(a：无黄连素，b：有4μmol/l黄连素)；(b)不同精 胺浓度下加与不加黄连素的溶液荧光强度的增加百分比。精胺的浓度 分别为0.02mmol/l、0.06mmol/l、0.12mmol/l、0.18mmol/l、 0.30mmol/l。
70.如图3所示，虽然加与不加黄连素溶液的荧光强度差异随着精胺 浓度的增加而增加(图a)，但荧光强度增加百分比在精胺浓度为0.06 mmol/l时最高(图b)，当精胺浓度小于或大于0.06mmol/l时，溶 液加与不加黄连素导致的荧光强度增加的百分比明显更低，因此，选 择浓度为0.06mmol/l的精胺作为最佳实验条件。
71.缓冲溶液ph值对体系的影响
72.双标记荧光法筛选三螺旋dna嵌入剂的传感器受多种因素的影 响，为了获得加入相同量嵌入剂(黄连素)产生最大信号变化值，对 影响溶液荧光值的实验条件进行优化，以
便加入黄连素能产生最大荧 光值改变值δif(δif＝i
f-i
f0
)(if：有黄连素；i
f0
：无黄连素)。
73.20mmol/l pbs(ph 7.5，含15mmol/l nano3)缓冲溶液，100nmol/lt
18ab
，100nmol/l ccp2，精胺反应浓度为0.06mmol/l，混合溶液保 留55分钟。(a)不同ph溶液在705nm的荧光强度(a：无黄连素， b：有4μmol/l黄连素)；(b)不同ph下加与不加黄连素的溶液荧 光强度的增加百分比。
74.如图4所示，虽然ph为7.3时加与不加黄连素的溶液荧光强度 的增加百分比最大(图b)，但ph为7.3时有无黄连素溶液的荧光 背景较高(图a)，所以不选用ph 7.3作为最佳实验条件，而当ph 为7.5时，有无黄连素溶液的荧光背景相对较低，加与不加黄连素溶 液的荧光强度增加的百分比也比较合适，因此，选择ph值为7.5的 缓冲溶液作为最佳实验条件。
75.不同有机药物分子溶液的荧光光谱
76.为了筛选稳定三螺旋dna的嵌入剂，考察了coralyne(cor)、 黄藤素(pal)、黄连素(ber)、新霉素(neo)、四环素(tc)、 卡那霉素(kan)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、eb等8种有 机药物分子与传感器作用的荧光光谱，记录含有不同有机药物分子的 反应溶液在波长λ为705nm处的荧光强度，并根据所测结果绘图6。 20mmol/l pbs(ph 7.5，含15mmol/l nano3)缓冲溶液，0.06mmol/l 精胺，100nmol/l t
18ab
，100nmol/l ccp2，混合保留时间55分钟。 (a)有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(b)8μmol/l新霉 素，(c)8μmol/l黄藤素，(d)8μmol/l黄连素，(e)2μmol/lcoralyne；(b)有机药物分子分别为：(a)无药物分子，(f)8μmol/leb，(g)8μmol/l dapi，(h)8μmol/l卡那霉素，(i)8μmol/l 四环素。
77.如图5和图6所示，加入黄藤素、黄连素、新霉素荧光值都有所 增强，说明这些有机药物分子有稳定三螺旋dna的作用；加入卡那霉 素、四环素的反应溶液荧光强度增加较弱，说明它们稳定三螺旋dna 的作用不明显；然而加入eb、dapi等荧光值降低，说明它们对该体 系的三螺旋dna没有稳定作用。
78.不同有机药物分子对荧光团荧光的影响
79.为了考察荧光增强是否由有机药物分子干扰双标记dna荧光团的 荧光导致，去掉参与形成三螺旋的无标记双链dna(t
18ab
)开展荧光 试验。如图7所示，与无药物分子(blank)的荧光强度相比，存在 不同有机药物分子的溶液荧光强度变化不大。该结果表明，前图6存 在不同有机药物分子引起的荧光增强，是由于对应药物稳定三螺旋 dna导致荧光强度的增长，而不是药物本身干扰双标记荧光团的荧光 引起的变化；而荧光强度的降低基本上是由于有机药物分子稳定双标 记ccp2的茎部分导致的。
80.不同有机药物分子本身的荧光背景
81.为了进一步考察荧光是不是有机药物分子本身被激发产生的，做 了一组无标记dna序列的选择性分析。20mmol/l pbs(ph 7.5，含 15mmol/l nano3)缓冲溶液，0.06mmol/l精胺，100nmol/l t
18ab
， 100nmol/l ccp2(无标记)，混合保留时间55分钟。有机药物分子 分别为：无药物分子，8μmol/l黄藤素，8μmol/l黄连素，2μmol/lcoralyne，8μmol/l新霉素，8μmol/l四环素，8μmol/l卡那霉素， 8μmol/l dapi，8μmol/l eb。
82.如图8所示，与无药物分子(blank)的荧光强度相比，存在不 同药物分子的溶液荧光强度变化不大。该结果表明，前图6存在不同 药物分子引起的荧光增强，是由于对应药物稳定三螺旋dna导致荧光 强度的增长，而不是有机药物分子本身被激发产生的荧光强度。
83.筛选三螺旋dna嵌入剂的圆二色谱
84.为了考察存在不同有机药物分子引起的溶液荧光强度变化是否 由三螺旋dna形成引起，采用圆二色谱对存在不同有机药物分子的溶 液进行研究。
85.实验方案同圆二色光谱的测定的实验步骤一样，配制好待测溶 液，采用圆二色谱仪扫描溶液在200～320nm的光谱图。
86.20mmol/l pbs(ph 7.5，含15mmol/l nacl，0.06mmol/l精 胺)缓冲溶液，7.5μmol/l ccp2，7.5μmol/l t
18ab
，反应溶液保留30分钟。(a)有机药物分子分别为：(a)无有机药物分子，(b) 0.13mmol/l coralyne，(c)0.13mmol/l黄藤素，(d)0.13mmol/l 黄连素，(e)0.03mmol/l新霉素；(b)有机药物分子分别为： (a)无有机药物分子，(f)0.13mmol/l四环素，(g)0.13mmol/l 卡那霉素；(h)0.13mmol/l dapi，(i)0.13mmol/l eb。
87.如图9所示，无药物分子的无标记dna溶液在210nm处有一个 负圆二色峰，说明有少量三螺旋dna形成。然而，当溶液中存在黄藤 素、黄连素、新霉素时，210nm处的负圆二色谱峰明显增强，说明 它们促进了三螺旋dna的形成，有稳定三螺旋的作用；而卡那霉素也 有稳定三螺旋dna的作用，只是相对较弱；eb和四环素则没有对应 的变化，说明基本没有稳定三螺旋dna的作用。圆二色谱实验结果与 荧光光谱结果基本一致。