甲磺酸伊马替尼有关物质及其制剂有关物质的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析检测技术领域，特别涉及一种甲磺酸伊马替尼有关物质及其制剂有关物质的检测方法。


背景技术：

2.甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)，结构如式1所示，是21世纪初novartis pharmaceuticals推出的首个小分子酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制酪氨酸激酶与三磷酸腺苷之间的相互作用，减弱参与细胞信号转导的蛋白质磷酸化，抑制肿瘤细胞的增殖，临床上主要用于治疗慢性粒细胞白血病、胃肠道间质瘤、pdgfr基因重组引发的骨髓增生异常、fip1l1-pdgfra重排导致的慢性嗜酸粒细胞白血病等，
[0003][0004]
近几年甲磺酸伊马替尼陆续进入各省市医保目录，国内生产销售量迅速增加，研究制定甲磺酸伊马替尼的质量标准，控制原料及其制剂的质量越来越重要。根据相关的生产工艺及稳定性资料，已确认中国厂家生产的甲磺酸伊马替尼中存在8种杂质，结构如式2-9所示。研究现有资料发现，杂质g和杂质e分离难度很大，且杂质i和j结构仅相差一个甲基，基本同时出峰，尚未报道能同时实现上述8种杂质和甲磺酸伊马替尼有效分离的检测方法，因此，研究一种能够同时分离上述9种物质的方法，对控制甲磺酸伊马替尼质量，提高生产效率具有重要的意义。
[0005]
[0006]


技术实现要素：

[0007]
本发明提供一种甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法。所述方法能够在一个液相色谱系统中，同时实现甲磺酸伊马替尼及8种杂质的有效分离，特别是首次能够对结构性质极为相似的杂质i、杂质j，杂质g和杂质e同时进行分离，耐用性强，准确可靠，灵敏度高，可用于甲磺酸伊马替尼质量控制。
[0008]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，使用十八烷基键合硅胶色谱柱，以含0.08～0.12％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液为流动相a，以含0.25～0.35％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液乙腈混合溶液为流动相b，流速1.0～1.5ml/min，柱温30～50℃，检测波长为230～240nm，按表1程序梯度洗脱，
[0009]
表1梯度洗脱程序表
[0010]
[0011][0012]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的十八烷基键合硅胶色谱柱为waters sunfire c
18
色谱柱；优选地，所述的十八烷基键合硅胶色谱柱为waters sunfire c
18
色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)。
[0013]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的流动相a为含0.09～0.11％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液；优选地，所述的流动相a的配制方法为先配制含0.11～0.14％己烷磺酸钠、0.81～0.94％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，最后用水稀释成含0.09～0.11％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液；进一步优选地，所述的流动相a的配制方法为先配制含0.125％己烷磺酸钠、0.85％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，最后用水稀释成含0.1％己烷磺酸钠、0.68％磷酸二氢钾的缓冲液。
[0014]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的流动相b为含0.28～0.32％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液，与乙腈按体积比25～40：75～60混合的混合溶液；优选地，所述的流动相b的配制方法为先配制含0.35～0.40％己烷磺酸钠、0.81～0.94％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，再用水稀释成含0.28～0.32％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液，最后与乙腈按体积比30～35：70～65混合的混合溶液；进一步优选地，所述的流动相b的配制方法为先配制含0.375％己烷磺酸钠、0.85％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，再用水稀释成含0.3％己烷磺酸钠、0.68％磷酸二氢钾的缓冲液，最后与乙腈按体积比33：67混合的混合溶液。
[0015]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的流速为1.5ml/min。
[0016]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的柱温为30～40℃；优选地，所述的柱温为35℃。
[0017]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼有关物质的检测方法，所述的检测波长为230nm。
[0018]
本发明提供的甲磺酸伊马替尼及其制剂有关物质的检测方法，包括如下步骤：
[0019]
(1)取伊马替尼或伊马替尼制剂样品适量，加盐酸甲醇溶液溶解制成样品溶液；
[0020]
(2)采用高效液相色谱法，使用十八烷基键合硅胶色谱柱，以含0.08～0.12％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液为流动相a，以含0.25～0.35％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液乙腈混合溶液为流动相b，流速1.0～1.5ml/min，柱温30～50℃，检测波长为230～240nm，按表1程序梯度洗脱，获得高效液相色谱分析图。
[0021]
本发明在建立分析方法时发现，杂质i和杂质j性质太过相似，极难完全分离。本发明人按照甲磺酸伊马替尼标准ybh03852014、ybh01712017及ep9.0有关物质的方法，考察杂质分离情况，发现三种方法的液相条件下，杂质i和杂质j均在同一位置出峰，无法分离，同时还存在杂质h和杂质f、主峰与杂质a分离效果不理想等情形，结果见附图1～3。
[0022]
本发明人发现，流动相的种类对有关物质的分离度影响很大，尝试多种流动相均未能有效分离上述9种物质，本发明人意外发现，含0.08～0.12％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液为流动相a，以含0.25～0.35％己烷磺酸钠、0.6～0.8％磷酸二氢钾的缓冲液乙腈混合溶液为流动相b，调节梯度洗脱程度，能够保证伊马替尼及各杂质峰形尖锐的同时，主峰及各杂质分离度较好，尤其是杂质i和j开始分离；本发明人发现，进一步优化流动相配比，流动相a的配制为：先配制含0.11～0.14％己烷磺酸钠、0.81～0.94％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，最后用水稀释成含0.09～0.11％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液，流动相b的配制为：先配制含0.35～0.40％己烷磺酸钠、0.81～0.94％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，再用水稀释成含0.28～0.32％己烷磺酸钠、0.65～0.75％磷酸二氢钾的缓冲液，最后与乙腈按体积比30～35：70～65混合的混合溶液，调节梯度洗脱程度，能得到伊马替尼主峰及杂质完全分离、各峰峰形对称、拖尾因子小的分离效果；本发明人最终发现，先配制含0.125％己烷磺酸钠、0.85％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，最后用水稀释成含0.1％己烷磺酸钠、0.68％磷酸二氢钾的缓冲液，作为流动相a；配制含0.375％己烷磺酸钠、0.85％磷酸二氢钾的缓冲液，然后用磷酸调节ph值至2.5
±
0.5，再用水稀释成含0.3％己烷磺酸钠、0.68％磷酸二氢钾的缓冲液，将配的的缓冲液与乙腈按体积比33：67混合的混合溶液作为流动相b，按表1的梯度洗脱程序洗脱，能得到如附图4所示的伊马替尼及杂质分离液相色谱图。
[0023]
本发明人还发现，流动相ph对杂质分离度影响较大。本发明人发现意外发现，当ph为2.5
±
0.5时，杂质g、杂质e、杂质h、伊马替尼、杂质j分离度最佳，色谱柱寿命长。
[0024]
本发明人发现，不同品牌的色谱柱对分离效果有一定的影响，选择waters sunfire色谱柱时，柱效最佳，且新旧色谱柱考察结果差异不显著。
[0025]
术语解释
[0026]
本发明所述的“％”在梯度洗脱表中，是指体积比(ml/ml)，在流动相的配制中是指溶液100ml中含有溶质若干克(g/ml)。
附图说明
[0027]
图1是甲磺酸伊马替尼标准ybh03852014有关物质液相色谱条件下的伊马替尼及各杂质高效液相色谱图，其中，杂质i和杂质j几乎在同一位置出峰，杂质h和f同一位置出峰；
[0028]
图2是甲磺酸伊马替尼标准ybh01712017有关物质液相色谱条件下的伊马替尼及各杂质高效液相色谱图，其中，杂质i和杂质j在同一位置出峰，主峰和杂质a分离度差；
[0029]
图3是甲磺酸伊马替尼ep9.0有关物质液相色谱条件下的伊马替尼及各杂质高效液相色谱图，杂质i和杂质j同一位置出峰，杂质h和f分离度差；
[0030]
图4是本发明提供的液相色谱条件下的伊马替尼及各杂质高效液相色谱图，其中，
1是杂质c；2是杂质a；3是杂质g；4是杂质e；5是杂质h；6是甲磺酸伊马替尼；7是杂质f；8是杂质i；9是杂质j。
具体实施方式
[0031]
仪器：water 2695高效液相色谱仪(美国waters公司，配备pda检测器)；mettler toledo xpe205电子分析天平(瑞士mettler公司)。
[0032]
药品与试剂：甲磺酸伊马替尼对照品(正大天晴药业，批号：2016001,纯度99.9％)；杂质a(正大天晴药业，批号：20180106,纯度：99.3％)；杂质c(南京沃伦科技有限公司，批号：20160310，纯度：99.9％)；杂质e(正大天晴药业，批号：20180115,纯度：99.5％)；杂质f(正大天晴药业，批号：20180115，纯度：99.6％)；杂质g(正大天晴药业，批号：20180115，纯度：99.3％)；杂质h(正大天晴药业，批号：20170112,纯度：98.9％)；杂质i(toronto research chemicals inc，批号：3-mrs-77-3，纯度：100％)；杂质j(深圳斯坦德化工科技有限公司，批号：1567517i-hb-08，纯度：98.5％)；甲磺酸伊马替尼原料药(石药欧意药业，批号695171257，695180104，695180203)；己烷磺酸钠、无水磷酸二氢钾为分析纯；乙腈为色谱纯，自制超纯水。
[0033]
色谱条件：采用waters sunfire c
18
色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g、己烷磺酸钠1.0g，加水800ml溶解后，用磷酸调节ph值至2.5，加水至1000ml)作为流动相a，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g、己烷磺酸钠3.0g，加水800ml溶解后，用磷酸调节ph值至2.5，加水至1000ml)-乙腈(33：67)作为流动相b；流速1.5ml/min；柱温35℃；进样量20μl；检测波长：230nm；梯度洗脱程序如表1所示。
[0034]
溶液配制：对照品溶液的配制 分别精密称取甲磺酸伊马替尼及各杂质对照品适量，用盐酸甲醇[0.1mol/l盐酸溶液-甲醇(6:4)]溶解并稀释制成每1ml中含各组分约100μg的对照品储备液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加盐酸甲醇稀释成每1ml中含各组分约1μg的对照品溶液。另以盐酸甲醇为空白溶液。
[0035]
供试品溶液的配制 精密称取甲磺酸伊马替尼适量，用盐酸甲醇溶解并稀释制成每1ml中含甲磺酸伊马替尼0.5mg的供试品溶液。
[0036]
实施例1专属性试验
[0037]
精密称取杂质a、c、e、f、g、h、i、j甲磺酸伊马替尼对照品各适量，加0.1mol/l盐酸溶液-甲醇(4：6)制备成每1ml中约含10μg的混合对照品溶液，分别取空白溶液(盐酸溶液-甲醇(4：6))、上述混合对照品溶液、单个组分对照品溶液，注入液相色谱，按上述色谱条件测定，结果见图4，伊马替尼及杂质a、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j均能实现良好的分离，保留时间分别为31.04、19.186、6.04、27.96、32.53、27.48、29.92、49.20、49.71min，空白溶剂不干扰测定。
[0038]
分别称取甲磺酸伊马替尼约20mg，按下列方法处理：(1)加1mol﹒l-1
hcl溶液2ml溶解，放置2小时，加1mol﹒l-1
naoh溶液2ml中和，加溶剂稀释，作为酸降解样品；(2)加1mol﹒l-1
naoh溶液2ml并放置2小时，加1mol﹒l-1
hcl溶液2ml中和，加溶剂稀释，作为碱降解样品；(3)加30％过氧化氢溶液3ml，80℃水浴加热20分钟，加溶剂稀释，作为氧化降解样品；(4)加10ml溶剂溶解,水浴加热2小时，加溶剂稀释后作为高温降解样品；(5)加10ml溶剂溶解，至紫外254nm灯下光照48h，加溶剂稀释，作为光照破坏降解样品。结果显示：甲磺酸伊马替尼
在酸、碱、高温、光照均会降解，尤其在氧化条件下降解产物较多，在本发明色谱条件下，各降解产物分离度良好。
[0039]
实施例2精密度考察试验
[0040]
取对照品溶液，连续进样6次，以伊马替尼及杂质a、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j峰面积的相对标准偏差评价，结果均符合要求，见表2。
[0041]
表2
[0042][0043]
实施例3线性范围考察试验
[0044]
从对照品储备液中精密量取0.1、0.25、0.5、1、1.5、2ml，分别置100ml量瓶，用溶剂稀释成每1ml中约分别含0.1μg、0.3μg、1.0μg、1.5μg、2.0μg系列浓度标准溶液，摇匀，作为线性系列溶液。以质量浓度x对峰面积y进行线性回归，结果见表2。
[0045]
实施例4校正因子考察试验
[0046]
以甲磺酸伊马替尼线性方程斜率与杂质线性方程斜率的比值计算校正因子，杂质a、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j校正因子依次为1.20、1.11、0.94、1.00和0.94、0.87、0.97、1.07(甲磺酸伊马替尼的校正因子按1.0计)。
[0047]
实施例5检测限与定量限
[0048]
取浓度约0.1μg/ml的混合对照溶液,精密量取20μl，注入液相色谱。甲磺酸伊马替尼及杂质a、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j的检测限分别为0.004、0.009、0.011、0.008、0.011、0.009、0.005、0.021、0.026μg﹒ml-1
(s/n＝3)，定量限分别为0.014、0.032、0.037、0.027、0.035、0.029、0.018、0.069、0.088μg﹒ml-1
(s/n＝10)。
[0049]
实施例6回收率试验
[0050]
取甲磺酸伊马替尼原料药，用溶剂配成每1ml约含0.5mg的供试品稀释液。取杂质对照品储备液约0.8、1、1.2ml置100ml量瓶，用供试品稀释液稀释至刻度，每个浓度平行3份，精密量取20μl注入液相色谱，记录色谱图，结果均符合要求，见表2。
[0051]
实施例7稳定性试验
[0052]
取供试品及对照品溶液，在室温下分别在0h,3h,6h进样，记录色谱图，以峰面积的相对标准偏差评价，表明伊马替尼及杂质a、杂质c、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j在6h内稳定，见表2。
[0053]
实施例8耐用性试验
[0054]
取专属性项下混合对照品溶液，对流动相比例、柱温、流速、色谱柱等进行考察。结果显示，柱温(
±
5℃)、流速(
±
0.2ml)对各组分分离度影响极小，流动相中己烷磺酸钠浓度、乙腈比例变化小于10％时，各组分间分离度仍大于5，峰面积基本不变。
[0055]
实施例9样品测定
[0056]
按上述方法，对3批甲磺酸伊马替尼原料药进行检测，结果表明各批样品均符合规定，结果见表3。
[0057]
表3样品有关物质测定结果表(％)
[0058]