中药材溴元素含量检测方法与流程

1.本发明涉及一种中药材溴元素含量检测方法，尤其涉及能够简便、快捷、以较低成本进行中药材所含的溴元素的含量检测的方法。


背景技术：

2.无机溴化物(bromide,inorganic)农药是溴甲烷、二溴乙烷、1,2-二溴-3-氯丙烷、炔丙基溴等一类卤化烷类或者熏蒸后残留物的统称，经常作为杀虫剂、杀菌剂、种植土壤熏蒸剂和谷物熏蒸剂被用于植物病虫害防治。基于这种原因，此类杀虫剂在食物、药用资源型植物产品中的残留也越来越受到重视，针对这种情况，美国药典usp 561“articles of botanical origin(关于植物来源)”中对于植物源类的药品中无机溴化物的限量规定为不得超过125mg/kg。
3.为此，美国和日本不同的学者曾开发过气相色谱质谱联用仪、x-射线衍射光谱仪、离子色谱等设备的检测方法，基本能够满足美国药典规定的无机溴化物的限量检测要求。然而，这些方法相关方法的一个共同特点是，需要对待测的样品进行高温灰化或者衍生化，前处理非常复杂且，仪器昂贵，步骤繁琐，而且由于方法专属性较差，需要单独付出额外的仪器购置成本。
4.现行中国标准中尚无与美国药典usp 561对标的检测标准，最接近的 gb2763-2021《食品国家安全标准食品中农药最大残留限量》中，仅规定了溴甲烷作为熏蒸剂在药用植物中最大残留量不得大于0.02mg/kg。由于没有对于其他溴类化合物的规定，因此，中国的无机溴残留的研究较少。
5.在出口美国的中药材的检测标准中，为了满足美国药典的相关规定，需要花费气相色谱质谱联用仪、x-射线衍射光谱仪、离子色谱等昂贵设备的成本。国内现有的食品类、药品类的国家标准或行业标准，大多利用有机溶剂或者水共浴萃取待测产品中的溴，脱水后利用气相色谱电子捕获检测器或者质谱检测器定性/定量测定溴离子；此类方法的缺点在于，前处理过程较为复杂，且需要特殊的色谱柱才能完成此类化合物检测，也并不适合无机溴化物的限量的检测。
6.随着国内目前对食品和药品中的无机溴化物残留越来越重视，相关标准有望出台，开发方法简便、重现性好、仪器成本合理的中药材溴元素含量检测方法，是业界迫切需要解决的技术问题。
7.电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)是近年来迅速发展起来的一种快速检测技术，它以独特的接口技术将电感耦合等离子体的高温电离特性与质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种高灵敏度的分析技术，由于仪器在测定时激发温度高、能量密度大、稳定性好，能使样品解离完全，基体或元素间的干扰相对较小，具有良好的精密度，样品加标回收率也较高。该检测方法多用于检测金属含量，非金属的卤族元素并不容易，例如氯的检测，需要采用高分辨率hr-icp-ms或者气相色谱串联 gc-icp-ms/ms这两种仪器进行检测，但hr-icp-ms和gc-icp-ms/ms价格非常昂贵，不是一般的科研单位或者检测机构可以承担。
8.专利cn111638265a中也公开利用icp-ms进行水和饮料中溴元素测定的方法，但是由于仪器本身的操作较复杂，其参数对测定的结果影响较大，因此，在建立一套完善的测定中药材中溴等非金属测定方法的时候还必须对方法进行针对性的开发。并且，该方法处理对象是水，难以完全转用的中药材之类的固体产品上，而且发明人利用了其基本流程对代表性中药材进行了溴成分检测，发现结果重现性非常差。
9.总之，现状是尚无能满足中药材溴含量检测的简便、高效、准确的方法。


技术实现要素：

10.本发明采用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)对中药材中的无机溴化物进行检测，针对性的开发了前处理操作，利用电感耦合等离子体质谱法对元素类物质进行检测，利用每种化合物质量数进行定性、定量，方法专属性更好；仪器操作简单，器件通用性好，无需更换配件。
11.具体而言，本发明涉及一种中药材溴元素含量检测方法，其依次包括以下步骤：
12.中药材前处理工序，将中药材样品粉碎后，利用水浸泡，超声波振荡，收集澄清溶液得到供试品溶液；
13.标准曲线绘制工序，配置精密称量的含溴0ng～500ng的一系列溶液，利用电感耦合等离子体质谱测定各溶液，测定过程中采用含锗的内标溶液中，以测量值和标准溶液浓度为二维坐标系，绘制标准曲线。
14.供试品溶液测定工序，利用与标准曲线绘制工序同样的测定条件，利用电感耦合等离子体质谱测定各溶液，测定过程中采用含锗的内标溶液，从标准曲线上计算得供试品溶液的浓度，通过换算得出中药材中的溴含量。
15.在本发明的优选实施方式中，中药材前处理工序中，将中药材样品，粉碎后过 30～200目筛，将粉末样品精密称定，加水分散，利用功率400w以上的超声装置振荡粉末样品混悬液20min以上，收集作为供试品溶液。
16.在本发明的优选实施方式中，所述中药材为根茎类中药材。作为根茎类中药材，所述中药材例如可以是白芍、赤芍、甘草、黄芪、人参、苍术、白术、贝母、黄芩、半夏、柴胡中的任一种。
17.在本发明的优选实施方式中，在中药材前处理工序中，中药样品粉碎后过50～ 100目的溶液，超声装置的功率优选在500w以上，振荡频率在30hz以上，振荡粉末样品混悬液的时间为30～60min，定容为以中药材样品计0.005～0.05g/ml之后，利用离心收集上清液作为供试品溶液。
18.在本发明的优选实施方式中，所述内标溶液的浓度为含锗1μg/1ml的内标溶液。
19.在本发明的优选实施方式中，在标准曲线绘制工序中，制成每1ml含溴(br)0ng、 10ng、20ng、50ng、100ng、200ng、300ng的系列浓度溶液。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
21.本发明采用电感耦合等离子体质谱法对中药中的无机溴化物进行检测，可满足政府、检测、企业对于无机溴化物作为农药使用的监管需求。本发明还无须色谱分离设备，减少了hplc等设备的投资，并且检测速度也因此极大提高。
附图说明
22.图1为表示实施例1中测试的中药材中溴离子含量的标准曲线的图。
具体实施方式
23.以下记载本发明的具体实施方式。
24.本发明的中药材溴元素含量检测方法，依次包括以下步骤：
25.中药材前处理工序，将中药材样品粉碎后，利用水浸泡，超声波振荡，收集澄清溶液得到供试品溶液；
26.标准曲线绘制工序，配置精密称量的含溴0ng～500ng的一系列溶液，利用电感耦合等离子体质谱测定各溶液，测定过程中采用含锗的内标溶液中，以测量值和标准溶液浓度为二维坐标系，绘制标准曲线，
27.供试品溶液测定工序，利用与标准曲线绘制工序同样的测定条件，利用电感耦合等离子体质谱测定各溶液，测定过程中采用含锗的内标溶液，从标准曲线上计算得供试品溶液的浓度，通过换算得出中药材中的溴含量。
28.上述工序并无严格限定的先后顺序，中药材前处理工序和标准曲线绘制工序可以同时进行，也可以任意顺序先后进行。
29.对于电感耦合等离子体质谱(以下也简称为icp-ms)而言，其本身是使待测化合物产生气态离子，再按质荷比(m/z)将元素离子分离、检测的分析方法。由于需要将待测目标离子化，因此样品的前处理非常重要。上述的供试品溶液测定工序中包括仪器的校准，采用调谐液经过电感耦合等离子体质谱仪，同时调整仪器的灵敏度、氧化物离子产率和双电荷分辨率的指标至符合仪器测量要求指标，这些步骤为公知的。
30.对于icp-ms检测而言，常见的对于固态的对象物常见的前处理方法有酸消解法、碱消解法、高压密闭加压处理方法等方法。针对中药材的特点，发明人为了匹配目标检测物，即溴甲烷、二溴乙烷、1,2-二溴-3-氯丙烷、炔丙基溴等一类卤化烷类，进行了样品处理方法的研究和探索。考虑到溴甲烷、二溴乙烷、1,2-二溴-3-氯丙烷、炔丙基溴等的非水溶性特征，以及中药材样品的形态，尝试了其他元素常用的硝酸 微波消解法进行前处理(背景技术中的cn111638265a也使用类似方法)，用随行加入溴元素溶液的回收率作为考察前处理有效性的依据，测试结果样品的重复性和精密度，结果回收率和结果的精密度都非常差。具体参见下表1。
31.表1-1随行加入溴元素溶液的样品回收率
[0032][0033]
常用的硝酸 微波消解法检测溴元素的回收率和精密度不好的具体原因不太清楚，分析各种情况推测可能是由于加入的消解溶剂硝酸在高温下可以将br-氧化成溴单质，而溴可能由于挥发，在微波处理时产生随机的缺失。
[0034]
因此决定不采用微波处理，仅使用酸、碱浸泡提取中药材中的溴(具体试验过程，参照后面的实验例2)。
[0035]
结果碱、酸浸泡同一批样品，样品检测平行差异很大，精密度很差。该结果的原因也并不清楚，由于中药材成分的复杂性，难以确定是何种成分导致了溴成分检测结果的不稳定。虽然在现有技术中，对于固态样品并无用水进行样品前处理的方法，然而一次偶然的实验，发明人使用水进行超声提取实验，反而得到了比较好的检测精密度。
[0036]
表1-2碱、酸浸泡同一批样品的检测结果与水浸泡的对比
[0037]
提取方式样品含量平均值mg/kgrsd％药材-碱提(ph9.0氨水溶液)碱y1～y60.48363药材-酸提(10％硝酸溶液)酸y1～y60.51847药材-水提(屈臣氏蒸馏水)水y1～y60.32016
[0038]
与一般的认知不太一致的是，虽然目标检测物溴甲烷、二溴乙烷、1,2-二溴-3
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氯丙烷、炔丙基溴等一类卤化烷类等并不具备足够的水溶性，但是发明人发现，在中药材的复杂助溶机理协助下，中药材中残留的程度的浓度的溴元素，可以通过水浸的方法提取充分，且可以克服酸、碱、热导致的溴元素检测结果的不稳定。
[0039]
上述的水是指纯水，是指不含有影响本发明的溴元素检测的程度的杂质的水，一般而言，可以使用市售的蒸馏水、去离子水、超纯水、纯净水，也可使用milli-q、 ro反渗透装置、蒸馏设备等装置制备的水，但是也不限于这些。
[0040]
本发明中的优选的中药材的前处理，也就是供试品溶液的制备工序为：将中药样品粉碎后过50～100目的溶液，超声装置的功率优选在500w以上，振荡频率优选在在30hz以上，振荡粉末样品混悬液的时间为30～60min，定容为以中药材样品计0.005～0.05g/ml之后，利用离心收集上清液作为供试品溶液。进一步优选在550w 以上，进一步优选振荡频率在45hz以上。具体实验过程请参照后述实施例1的3.7 部分。
[0041]
另外，本发明的检测方法，更优选将中药材样品定容在0.007～0.02g/ml，进一步优选将中药材样品定容在0.008～0.015g/ml。
[0042]
在中药材的前处理工序中，振荡粉末样品混悬液的时间进一步优选为40～ 50min，进一步优选45～50min。
[0043]
在本发明的标准曲线绘制工序中，通过配置精密称量的含溴0ng～500ng的一系列溶液，利用电感耦合等离子体质谱测定各溶液，测定过程中采用含锗的内标溶液中，以测量值和标准溶液浓度为二维坐标系，绘制标准曲线。该工序中并无特别限制，通常可以是以测量值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，取3次读数的平均值。
[0044]
电感耦合等离子体质谱仪并无特别限制，可以使用市售的商业化产品。对于仪器参数的调节，没有特别限定，可以根据仪器情况调节。本发明后述实施例中，对于基本的仪器参数，使用了高频功率：1.20kw；采样深度：5.0mm；等离子体气：8l/min；辅助气：1.10l/min；载气：0.70l/min；池气体：6.0ml/min；池电压：-21v；能量过滤器：7.0v；积分时间mid：重复次数3次的参数标准，但是这些参数并没有限定作用，本领域人员可以根据样品，仪器进行调节，根据仪器推荐参数，适当调节能够稳定测定样品的参数均能实现本发明的效果。
[0045]
在对中药材的溴化物含量残留大致区间有所了解之后，绘制标准曲线时，绘制覆
盖0ng～300ng的含量标准曲线即可实现药材的溴化物含量残留的相关测试，为了实验的简便，进一步优选得到覆盖0ng～200ng的含量范围的标准曲线。因此，例如本发明的标准曲线的配置方法可以优选为精密用蒸馏水稀释制成每1ml含溴 (br)0ng、10ng、20ng、50ng、100ng、200ng、300ng的系列浓度溶液，进行测定。为了保证标准品溶液本身的浓度准确性，并且兼顾配置的便利性，可以配置用于配置标准品的溴储备溶液，溴储备溶液的浓度并没有特别的限定，优选浓度为50μg/ml以下，例如可以为用蒸馏水稀释制成每1ml含溴(br)为10μg的溶液。
[0046]
本发明中，测定溴样品时，选取的同位素为
79
br，选取了锗ge作为内标物，内标物溶液的浓度并无特别限制，为了便于计算，优选用水稀释制成每1ml含锗(ge)1μg 的溶液作为内标溶液。选取锗ge作为内标物是本发明的重要特征，适合本发明的检测对象。
[0047]
在后述的实施例中，已经对方法专属性进行了评估。虽然实施例仅使用了白芍作为被检测的中药材，但是从原理和操作适用性方面推测，本发明的检测方法，适用于各种中药材的检测，从前处理适应性好的观点出发，优选更适合用于根茎类中药材的溴化合物含量检测，作为根茎类的中药材，例如可以举出白芍、赤芍、甘草、黄芪、人参、苍术、白术、贝母、黄芩、半夏、柴胡，但是并不限于这些中药材。
[0048]
本发明的检出限可达到1μg/g，定量限可达到2μg/g。
[0049]
本发明准确度良好，同一浓度下6次重复的回收率在aoac(美国分析化学家协会)规定的75％～120％范围内。
[0050]
本发明的精密度，即可重复性良好(可以参考后续实施例)。不但如此，本发明的耐用性也良好，在本发明限定的范围内操作，本领域技术人员都容易获得准确的检测数值。
[0051]
实施例
[0052]
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。特别是，本发明实施例中仅选取了代表性的中药材白芍作为实验对象，然而本发明不限于白芍的溴化合物含量检测。
[0053]
实施例中所使用的试剂购自aldrich chemical company、国药试剂公司等公司。仪器采用以下仪器：
[0054]
仪器名称生产厂家仪器型号微波消解仪上海屹尧仪器科技发展有限公司coolpex离心机湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司l550电感耦合等离子体质谱岛津企业管理(中国)有限公司icpms-2030超声仪宁波新芝生物科技股份有限公司sb-500dty
[0055]
实验例1中药材溴化物含量的检测
[0056]
1.中药材前处理工序和标准曲线绘制工序)
[0057]
1.1标准品贮备溶液的制备
[0058]
精密量取溴(br)元素标准溶液适量，用蒸馏水稀释制成每1ml含溴(br)为10μg的溶液，即得标准品贮备液。
[0059]
1.2标准品溶液的制备
[0060]
精密量取标准品贮备溶液，用蒸馏水稀释制成每1ml含溴(br)0ng、10ng、20ng、 50ng、100ng、200ng的系列浓度溶液。
[0061]
1.3内标溶液的制备
[0062]
精密量取锗(ge)单元素标准溶液适量，用水稀释制成每1ml含锗(ge)1μg的溶液，即得。
[0063]
1.4供试品溶液的制备
[0064]
取市售白芍饮片适量，粉碎后过三号筛，粉末样品量0.5g，精密称定，置50ml 量瓶中。加蒸馏水30ml左右，超声提取45min(功率500w，频率40khz)，放冷至室温后用蒸馏水定容至刻度，摇匀。再转移至离心管里，以4000r/min离心5min，收集上清液作为供试品溶液。
[0065]
1.5标准溶液测定
[0066]
测定时选取的同位素为
79
br，以
72
ge作为内标，并根据不同校正方程对测定的元素进行校正。
[0067]
1.6icp-ms参数
[0068]
icpms：岛津企业管理(中国)有限公司，型号：2030；高频功率：1.20kw；采样深度：5.0mm；等离子体气：8l/min；辅助气：1.10l/min；载气：0.70l/min；池气体：6.0ml/min；池电压：-21v；能量过滤器：7.0v；积分时间mid；重复次数3次。
[0069]
1.7标准曲线的获得
[0070]
仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样品管插入各个浓度的标准品溶液中进行测定(浓度依次递增)，以测量值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0071]
表2标准溶液统计表
[0072]
元素br强度线性浓度1(ng/ml)00.19469线性浓度2(ng/ml)100.701971线性浓度3(ng/ml)201.177407线性浓度4(ng/ml)502.686931线性浓度5(ng/ml)1005.097657线性浓度6(ng/ml)20010.12878
[0073]
参见图1。
[0074]
2.供试品溶液的测定
[0075]
采用和1.5、1.6中同样的条件，准备好icp-ms设备，将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，取3次读数的平均值。从标准曲线上计算得相应的浓度。
[0076]
3.方法验证
[0077]
3.1系统适用性
[0078]
系统适用性测试是为了考察测试系统适用于预期用途。
[0079]
按照美国药典《233》“elemental impurities-procedures”中对icp-ms系统适用性的建议，考察了仪器在测试样品前后的漂移；结果表明，待测元素的漂移均符合可接受标准：不大于20％。见以下表3。
[0080]
表3系统适用性测试结果
[0081]
元素br(ng/ml)测试前23.1测试后24.1漂移量(％)4.2
[0082]
3.2专属性
[0083]
专属性系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。
[0084]
通过符合要确定的准确度要求来证明专属性；结果表明，空白溶液、空白样品无干扰，该方法能够明确评估白芍饮片中的溴(br)含量。
[0085]
3.3线性和范围
[0086]
线性系指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度；范围系指分析方法能达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度或量的区间。
[0087]
按照分析方法对标准品溶液进行测定，进行回归分析以确定该方法中元素的线性。绘制标准浓度与信号强度的曲线，计算相关系数r2；结果表明，该方法在覆盖样品制备的溶液中溴(br)浓度的范围内具有良好的线性。见以下表4。
[0088]
表4白芍饮片中农残-溴离子方法验证线性结果
[0089][0090]
3.4准确度
[0091]
准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率 (％)表示。
[0092]
本次验证选用同一加标浓度的供试品，用至少测定6份平行的结果进行评价；结果表明准确度均符合验收标准：同一浓度下6次重复的回收率在aoac(美国分析化学家协会)规定的75％～120％范围内。
[0093]
3.5精密度
[0094]
精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，精密度用相对标准偏差(rsd)表示。
[0095]
重复性：本次验证选用同一浓度的供试品，用至少测定6份平行的结果进行评价；元素的相对标准偏差，结果表明精密度符合验收标准：同一浓度下6次重复的相对标准偏差(rsd)在aoac(美国分析化学家协会)规定的≤8％范围内。参见表5。
[0096]
中间精密度：本次验证考察不同日期、不同分析人员对精密度的影响，结果表明中间精密度符合验收标准：两个检测人员同一浓度下12次重复的相对标准偏差(rsd) 在aoac(美国分析化学家协会)规定的≤16％范围内。参见表6。
[0097]
表5白芍饮片中农残-溴离子重复性结果
[0098][0099]
表6白芍饮片中重金属元素方法验证准确度和精密度结果
[0100][0101][0102]
3.6检出限和定量限
[0103]
检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量；定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量。
[0104]
在上述分析条件下，测定不少于7份的空白样品溶液，以连续测定空白样品溶液响应值的3倍标准偏差(3sd)所对应的待测元素浓度作为检测限；以连续测定空白溶液响应值的10倍标准偏差(10sd)所对应的待测元素浓度作为定量限。
[0105]
溴元素的检出限和定量限，结果表明符合验收标准：检出限和定量限不超过美国药典《561》规定限值，125mg/kg。参见表7。
[0106]
表7白芍饮片中农残-溴离子方法验证检测限和定量限结果
[0107]
元素检出限(μg/g)定量限(μg/g)美国药典限值(μg/g)br12125
[0108]
表8白芍饮片中农残-溴离子定量限处准确度及精密度结果
[0109][0110]
3.7耐用性
[0111]
耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据。
[0112]
3.7.1改变处理方式
[0113]
改变超声时间为30分钟、改变超声时间为60分钟、改变超声功率频率为 565w,37khz。
[0114]
表9白芍饮片中农残-溴离子方法验证前处理条件改变的考察结果
[0115][0116]
注：结果分析值为“改变条件后结果”/“改变条件前结果”。
[0117]
经实验证明改变前处理超声时间为30分钟或者60分钟、改变前处理超声功率频率为565w,37khz对于结果无较大偏差(均未检出)，对于溴元素较为耐用。
[0118]
3.8溶液稳定性
[0119]
考察标准品溶液、供试品溶液在48h的稳定性，在不同的时间段按照条件5检测标准品溶液、供试品溶液，检测结果与0h进行比较，结果见表10。
[0120]
表10
[0121]
检测结果(ng/ml)br0h22.524h21.824h/0h0.9748h21.748h/0h0.96
[0122]
供试品溶液在24小时后已成粘稠的絮状，不能进样。
[0123]
经实验证明：
[0124]
溴(br)对照品溶液在48小时左右依然稳定，可正常使用；供试品溶液在24小时左
右状态已经发生改变，不能正常进样，建议供试品溶液制样后尽快完成实验。
[0125]
实验例2前处理方法比较实验
[0126]
采用新批次的白芍饮片样品，与实施例1同样的实验方法，仅仅是将实施例1中的供试品溶液制备工序中的水，替换成下表中的酸、碱和谁，来浸泡提取白芍药材中的溴，结果表明，碱、酸、水浸泡同一批样品，样品检测平行差异很大，精密度很差；反而用水进行浸泡，提取的精密度较好。
[0127]
表11
[0128][0129][0130]
此外，实验室还对赤芍、甘草、黄芪、人参、苍术、白术、贝母、黄芩、半夏、柴胡等饮片进行了同样的试验，结果都能提供很好的检测准确度、精密度、稳定性和合适的检出限(检出限可达到1μg/g)，证明了本发明方法的通用性良好。
[0131]
上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。