一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖含量测定方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，涉及一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的含量测定方法，具体地说是一种容量法测定低分子量岩藻糖化糖胺聚糖含量测定的方法。


背景技术：

2.岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylated glycosaminoglycan,fg)是迄今仅见于棘皮动物中的一种具有特殊化学结构及药理活性的糖胺聚糖，其具有类似硫酸软骨素主链，并存在岩藻糖基(fucosyl,fuc)侧链取代的糖胺聚糖类似物(yoshida et.al,tetrahedron lett,1992,33:4959-62；et.al,j biol chem,1996,271:23973-84)。lfg(low molecular weight fucosylated glycosaminoglycan，低分子量岩藻糖化糖胺聚糖，以下简称“lfg”)是自海参体壁提取解聚所得糖胺聚糖衍生物，由岩藻糖、n-乙酰氨基半乳糖和葡萄糖醛酸聚合而成。lfg为多糖类药物，由于多糖本身复杂的结构和多分散性，所以质量控制比较困难。糖含量测定是多糖类药物研究的必要步骤，也是质量控制和产品标准拟定的重要内容，由于多糖类药物来源多样，结构类型不同，故而多糖的测定方法有很多种。多糖类药物中常见的糖基有中性的已糖、戊糖和脱氧已糖，负电型的糖醛酸、唾液酸，正电性的氨基糖等，可针对不同多糖化学结构的不同或水解为单糖建立专属性的方法进行测定。
3.鉴于lfg为大分子多糖类物质，由一系列不同分子量的寡糖链组成，较为复杂，不适合上述常规单糖的含量测定方法。曾有研究采用高效凝胶色谱法进行了定量研究，但考虑到多糖本身为聚合物，实际分析测定中，凝胶排阻色谱的影响因素较多，比如色谱柱耐用性较差，峰展较宽，基线不易平衡，重现性较差，鉴于此，需建立一种新的含量测定方法。现有报道中未有采用容量法测定岩藻糖化糖胺聚糖的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的含量测定方法，用于监控一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的质量，保障低分子量岩藻糖化糖胺聚糖产品质量的稳定性和可控性，推动低分子量岩藻糖化糖胺聚糖在医药、食品等领域的应用。
5.本发明提供一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的含量测定方法，所述岩藻糖化糖胺聚糖具有如下的结构：
[0006][0007]
式中，
[0008]
r1、r2、r3、r4、r5任选为相互独立的-h或-so3h；
[0009]
r6任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
[0010]
r7任选为-h、-so3h、c2-c5酰基；
[0011]
r8任选为式(ii)、式(iii)或式(iv)所示基团：
[0012][0013][0014]
其式(ii)、(iii)和式(iv)中，
[0015]
r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7均同上定义；
[0016]
r9和r
10
任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c
7-c
12
芳基；
[0017]r11
任选为-nhr
12
、-or
13
，其中r
12
和r
13
任选为-h、取代或未取代的c
1-c6烃基或c
7-c
12
芳基；且n是任选为0或1～8的自然数；
[0018]
测量方法为将所述低分子量岩藻糖化糖胺聚糖对照品进行去阳离子处理，加入滴定液滴定，滴定过程中记录电导值的变化，并测定对照品消耗滴定液的体积；以电导率为纵坐标，以滴定液的体积为横坐标，绘制滴定曲线；分别对滴定曲线的突然下降，稍微爬升，急剧上升的3个线性部分图形作出第一、第二、第三条最佳直线；在第二条直线和第三条直线的交点对横坐标作垂直线，该垂线与横坐标的交点即为硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液的体积。根据滴定曲线计算对照品中硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液的体积，进而计算出对照品的质量与对照品中硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液体积的比值r。同时对待测低分子量岩藻糖化糖胺聚糖供试品进行滴定，并根据r计算出其中低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的
含量，所述滴定液为碱性溶液，优选地为氢氧化钠溶液，更优选地为浓度为0.02～0.1mol/l的氢氧化钠溶液。
[0019]
在本发明的一种具体实施方式中，采用如下步骤：
[0020]
(1)取本品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，作为供试品溶液；
[0021]
(2)取2ml供试品溶液加入阳离子交换树脂柱上样，用15ml水缓慢洗入小烧杯中，置电磁搅拌器上，浸入电极，搅拌，待电导读数稳定后，记录初始读数；
[0022]
(3)用移液枪加入滴定液50μl，当电导读数稳定后，记录并继续滴定，直至电导值变化变缓，加入10μl滴定液，当电导值又剧烈变化时，加入50μl滴定液，直至电导值有规律的升高，至终点(电导值恢复到开始滴定时)，记录下滴定液消耗的体积。
[0023]
然后按照如下方法计算供试品中岩藻糖化糖胺聚糖含量：
[0024][0025]
其中，v为供试品中硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液的体积；
[0026]
r为岩藻糖化糖胺聚糖对照品中硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液体积与对照品质量的比值；
[0027]
m为岩藻糖化糖胺聚糖供试品称样量，以干燥品计。
[0028]
本发明提供的快速测量一种低分子量岩藻糖化糖胺聚糖的方法，操作简单，准确度好，经济高效。非常适合工业规模化生产中对产品批次检验，质量控制的推广和应用。
附图说明
[0029]
图1低分子量岩藻糖化糖胺聚糖滴定曲线。
具体实施方式
[0030]
实施例1lfg含量测定方法验证
[0031]
1、设备、试剂、对照品和样品
[0032]
1.1主要设备信息
[0033]
表1主要设备信息表
[0034][0035]
1.2主要试剂信息
[0036]
表2主要试剂信息表
[0037][0038][0039]
1.3对照品信息
[0040]
表3对照品信息表
[0041][0042]
注：对照品含量以hplc纯度(示差检测器，面积归一化)表示，以干燥品计，经过标定后得到滴定系数。
[0043]
实施例所使用低分子量岩藻糖化糖胺聚糖供试品根据中国专利201410007855公开的方法，从海参中提取得到。
[0044]
2.测定方法
[0045]
2.1树脂处理
[0046]
取一定量732强酸性阳离子交换树脂，用蒸馏水(新沸放冷)漂洗干净，浸泡1h使其充分膨胀，用4倍树脂体积的1mol/l hcl溶液搅拌浸泡1h，蒸馏水洗至中性；用4倍树脂体积的1mol/l naoh溶液搅拌浸泡1h，蒸馏水洗至中性；最后用4倍量1mol/l hcl溶液搅拌浸泡1h，蒸馏水洗至中性，备用。
[0047]
2.2样品溶液配制
[0048]
对照品溶液：称取lfg对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，摇匀，平行配制2份，待用。
[0049]
供试品溶液：称取lfg供试品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，摇匀，平行配制6份，待用。
[0050]
2.3试验方法
[0051]
制备新鲜煮沸的纯水2000ml，迅速冷却(当天使用)；将处理好的树脂缓缓倒入层析柱，填充时打开下口阀开关，避免产生气泡，留一部分水在树脂上面，树脂应填充得均匀、无间隙、无气泡，层析柱用装有碎冰的冰袋包裹，填充体积约10cm
×
1cm。取对照品溶液2ml，沿壁缓缓加入遇冷层析柱中，当对照品加入柱子后，关闭层析柱开关，静置约20min，以使离子交换更加充分。然后打开层析柱开关，用15ml水缓缓洗入50ml小烧杯中(保存在冰浴中)，洗脱液应用氢氧化钠滴定液(0.l mol/l)立即滴定。将电导电极、温度探头、磁子放入小烧杯中，小烧杯置于冰浴中，调节磁力搅拌器，使磁子正常搅拌，待电导读数稳定后，记录读数。用移液枪加入0.1mol/l氢氧化钠滴定液50μl，当电导读数稳定后，记录数值并继续滴定，直至电导值变化变缓，加入10μl滴定液，当电导值又剧烈变化时，加入50μl滴定液，直至
电导值有规律的升高，至终点(电导值恢复到开始滴定时)，记录下氢氧化钠滴定液消耗的体积。
[0052]
按照上述同法滴定lfg供试品溶液，记录下氢氧化钠滴定液消耗的体积。
[0053]
2.4试验结果
[0054]
表4容量法重复性实验结果表
[0055][0056]
注：表4中所述系数为根据lfg对照品消耗氢氧化钠滴定液的体积v1，计算出每消耗单位体积氢氧化钠滴定液的量，相当于一定质量的lfg(以干燥品计)。
[0057]
2.5实验结论
[0058]
根据实验结果，本方法含量测定结果平均值为104.16％，重复性rsd值为2.90％。本方法作为岩藻糖化糖胺聚糖类多组分样品的测定方法，测定结果准确度良好。滴定曲线实例见图1所示。
[0059]
实施例2供试品的测定
[0060]
分别称取四个批次lfg供试品(20170531、20170612、20170616、20170623)适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，摇匀，待用。
[0061]
分别取各供试品溶液2ml加入阳离子交换树脂柱上样，用15ml水缓慢洗入小烧杯中，置电磁搅拌器上，浸入电极，搅拌，待电导读数稳定后，记录读数。用移液枪加入0.1mol/l氢氧化钠滴定液50μl，当电导读数稳定后，记录并继续滴定，直至电导值变化变缓，加入10μl滴定液，当电导值又剧烈变化时，加入50μl滴定液，直至电导值有规律的升高，至终点(电导值恢复到开始滴定时)，记录下氢氧化钠滴定液消耗的体积，以电导率为纵坐标，以滴定液的体积为横坐标，绘制曲线；分别对突然下降，稍微爬升，急剧上升的3个线性部分图形作出第一、第二、第三最佳直线；在第二条直线和第三条直线的交点对横坐标作垂直线，该垂线与横坐标的交点即为硫酸根和羧酸根共同消耗滴定液的体积v。
[0062]
根据用lfg对照品计算出的每消耗lml氢氧化钠滴定液(0.lmol/l)相当于31.16mg的lfg，计算出lfg样品的含量。计算结果如下：
[0063]
表5四批lfg容量法测定含量结果表
[0064][0065]
且本方法所需要的试剂、耗材与仪器均为实验室常规设备，测定成本与现有技术hplc测定法相比，成本更加低廉，操作更加简便。