检测广金钱草提取物中黄酮类化合物含量的方法与流程

1.本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及检测广金钱草提取物中黄酮类化合物含量的方法，更具体地，本发明涉及检测广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法。


背景技术：

2.广金钱草为豆科植物，广金钱草desmodium styracifolium(osb.)merr.的干燥地上部分，为《中国药典》2020年版一部收载的传统中药，具有利湿退黄，利尿通淋的功效。同时收载的成方制剂石淋通片，其主要成分即为广金钱草，用于膀胱湿热，石淋涩痛，尿路结石，泌尿系感染属肝胆膀胱湿热者。广金钱草的提取物中富含黄酮类化合物，黄酮类化合物具有抗氧化、抗过敏、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保护心脑血管系统和抗病毒等广泛的生理活性。中药的多成分、多功效的作用特点，决定着单一成分难以表达中药的内在质量。对于广金钱草提取物，其中黄酮类成分的主要活性成分为夏佛塔苷、新夏佛塔苷vicenin-2、vicenin-1、vicenin-3和异牡荆苷。夏佛塔苷可有效地产生抗炎作用；vicenin-2、vicenin-1和vicenin-3具有良好的抗氧化活性，而这些药理作用与其含有的成分有着很大的关系。因此，目前针对广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法仍有待研究。


技术实现要素：

3.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了检测广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法和广金钱草提取物或含有广金钱草提取物的药物的质控方法，利用该方法可以准确地确定广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好等优点。该方法可用于广金钱草提取物或含有其的药物的质量控制，促进对广金钱草药用价值的开发和研究。
4.在本发明的一个方面，本发明提出了一种检测广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将广金钱草提取物进行液相色谱检测，基于检测结果确定vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量；其中，所述液相色谱检测中采用的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a选自三氟乙酸水溶液和甲醇；所述流动相b选自甲醇。
5.研究发现，广金钱草提取物(尤其是富含黄酮类化合物的提取物)的组成成分多达几十种，较为复杂，各物质之间的特性存在差异，如何从众多组分中有效地分离出vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3并获知其含量是很困难的。为此，本发明的发明人经过大量实验发现，采用液相色谱进行检测时，流动相的种类会显著影
响vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3的分离效果，不当的流动相容易出现不出峰、出峰时间不当、与其他组分的分离度低等问题，进而导致这6个组分的含量测定不准确。进而，发明人经过大量实验筛选出最佳的流动相—三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相a，甲醇作为流动相b，由此，可以准确地确定广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量，具有专属性强、准确度高、重现性好、灵敏度高、耐用性好等优点，检测限可低至0.5μg/ml～1.5μg/ml。该方法可用于广金钱草提取物或含有其的药物的质量控制，促进对广金钱草药用价值的开发和研究。
6.根据本发明的实施例，上述检测广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法还可以具有下列附加技术特征：
7.根据本发明的实施例，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸浓度为0.3～0.7体积％；所述流动相a中，所述三氟乙酸水溶液和甲醇的体积比为(70～95)：10。由此，可以提高各组分之间的分离度，各组分的峰型好，出峰时间适宜，从而进一步提高检测结果的准确性。
8.根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用下表的洗脱方式进行：
9.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～20100
→
950
→
520～3095
→
895
→
1130～35891135～3689
→
10011
→
036～451000
10.。
11.相比于等度洗脱，采用上述梯度洗脱方式可以获得较佳的分离效果，分离度、保留时间、准确度、峰型等指标均较理想。例如，20min内采用100％～95％(即此范围内的任意值)流动相a和0％～5％流动相b线性洗脱；20min～30min内采用95％～89％流动相a和5％～11％流动相b线性洗脱；30min～35min内采用89％流动相a和11％流动相b等度洗脱；35min～36min内89％～100％流动相a和11％～0％流动相b线性洗脱；36min～45min内采用100％流动相a和0％流动相b等度洗脱。
12.根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的流速为0.1～0.3ml/min。由此，有利于化合物的分离，且分离度好，分离效果佳，该流速范围可以优于其他流速范围发挥作用。
13.根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的检测波长为300～350nm。发明人发现，采用该波长进行检测，吸收强度较大，检测灵敏度较高，效果较佳。
14.根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的柱温为50～70℃。由此，在该温度范围内，分离度、峰型如半峰宽、峰高等均较佳，温度过高或过低效果均不理想。
15.根据本发明的实施例，所述液相色谱检测中采用的色谱柱选自waters acquity beh c18色谱柱。发明人经过大量实验得到上述色谱柱，由此，可以进一步提高检测结果的准确性和分离度，各组分的峰型好，出峰时间适宜。
16.根据本发明的实施例，获得所述广金钱草提取物的方法包括：利用乙醇对广金钱草药材进行加热回流，以便获得广金钱草的醇提取液；将所述醇提取液进行浓缩处理，以便
获得浓缩液；以及将所述浓缩液进行大孔吸附树脂柱处理，以便获得所述广金钱草提取物。由此，可以获得富含黄酮类化合物的提取物，提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量较高，且杂质含量较小，进而有助于这6种组分的色谱分离，提高检测准确性。
17.根据本发明的实施例，所述大孔吸附树脂选自ab-8大孔吸附树脂。由此，可以获得大量的黄酮类化合物，尤其是vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3，且杂质含量较小，进而有助于这6种组分的色谱分离，提高检测准确性。
18.根据本发明的实施例，获得所述广金钱草提取物的方法包括：称取广金钱草药材，加入8～14倍药材量的50％～95％乙醇，50-60℃加热回流，提取1～3次，每次1～3小时，以便获得广金钱草的醇提取液，然后合并醇提液；将所述醇提液浓缩至体积为2～8倍药材量，静置过滤后，得到滤液；将所述滤液以每小时1～3倍柱床体积的流速通过ab-8大孔吸附树脂柱，吸附完毕后，先用8～12倍树脂量的水洗脱除杂，再用6～10倍柱床体积的40％～95％的乙醇，以每小时2～4倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液浓缩至相对密度为1.10～1.30的浓缩液，所述浓缩液经干燥、粉碎，得到所述广金钱草提取物。由此，可以获得大量的黄酮类化合物，尤其是vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3，且杂质含量较小，进而有助于这6种组分的色谱分离，提高检测准确性。
19.根据本发明的实施例，进行所述液相色谱检测之前，将乙醇溶液与所述广金钱草提取物进行混合、滤膜过滤。
20.在本发明的另一方面，本发明提出了一种广金钱草提取物或含有广金钱草提取物的药物的质控方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述检测广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法对广金钱草提取物进行检测，得到vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量；分别将所述vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量与各自相应的阈值进行比对分析，确定所述广金钱草提取物或药物的质量是否达标。
21.如前所述，利用根据本发明实施例的方法可以准确地确定广金钱草提取物或含有其的药物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量，将测定结果与各自对应的阈值进行比对分析，从而可以实现广金钱草提取物或含有其的药物的质控。
22.需要说明的是，本发明所描述的“阈值”也即“质控线”，即达到要求所需要满足的条件值，例如vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3的总含量均不低于60％、70％、80％、90％等，具体参数可以根据实际生产需要灵活选择，本发明不做严格限定。
23.还需要说明的是，对于含有广金钱草提取物的药物中，除广金钱草提取物以外的其他辅料成分不做严格限定，可以根据实际需要灵活选择，例如，可以为乳糖、微晶纤维素。
24.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
25.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
26.图1显示了根据本发明实施例1的供试品溶液色谱图；
27.图2显示了根据本发明实施例1的对照品溶液色谱图；
28.图3显示了根据本发明实施例2的定位溶液色谱图；
29.图4显示了根据本发明实施例2的供试品溶液色谱图；
30.图5显示了根据本发明对比例1的供试品溶液色谱图；
31.图6显示了根据本发明对比例2的供试品溶液色谱图。
具体实施方式
32.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
33.实施例1
34.本发明提出了一种广金钱草提取物中vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、异牡荆苷和vicenin-3含量的方法，包括：
35.1、对照品溶液的制备：
36.分别取vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、vicenin-3、异牡荆苷对照品适量，精密称定，加25％甲醇溶解，制成含vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷、vicenin-3、异牡荆苷的质量浓度分别为10μg/ml、10μg/ml、10μg/ml、10μg/ml、10μg/ml、10μg/ml的混合对照品溶液，备用。
37.2、供试品溶液的制备：
38.取广金钱草药材200克，第一次加入14倍药材量的95％乙醇，60℃加热回流提取3小时，第二次加入12倍药材量的95％乙醇，50℃加热回流提取2小时，第三次加入8倍药材量的80％乙醇，50℃加热回流提取1小时，合并醇提液；将醇提液浓缩至一定体积，使药液体积为8倍药材量，静置过滤，得到滤液(为上样药液)，备用。将400克药用级ab-8型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法装柱，处理后备用。
39.将上述滤液(上样药液)以每小时3倍柱床体积的流速通过ab-8大孔吸附树脂柱，吸附完毕后，先用12倍树脂量的水洗脱除杂，再用10倍柱床体积的95％乙醇，以每小时3倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；将洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10的浓缩液，经75℃减压干燥，粉碎，得到广金钱草提取物。
40.取广金钱草提取物约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加25％乙醇约40ml，超声处理20min，放冷，再用25％乙醇稀释至刻度，摇匀，用聚四氟乙烯有机系0.22μm滤膜滤过，至少弃去3ml初滤液后，取续滤液即得。
41.3、超高效液相色谱测定
42.分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，得到超高效液相色谱图；
43.其中，色谱条件如下：
44.色谱柱：waters acquity beh c18，2.1mm
×
100mm,1.7μm。
45.流动相：0.5体积％三氟乙酸水溶液-甲醇(90：10)为流动相a，以甲醇为流动相b。
46.洗脱方式：采用如下梯度洗脱条件：
47.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～20100
→
950
→
520～3095
→
895
→
1130～35891135～3689
→
10011
→
036～451000
48.。
49.流速：0.2ml/min；柱温为60℃；检测波长：330nm；运行时间：45min。
50.理论塔板数按夏佛塔苷计算应不低于20000。
51.4、目标化合物的含量计算
52.利用步骤3中得到超高效液相色谱图，并以夏佛塔苷为内参物，根据相对校正因子计算ci为待测成分浓度，计算公式如下
[0053][0054]
式中
[0055]ai
为供试品中待测成分i的峰面积；
[0056]ci
为供试品中待测成分i的浓度；
[0057]as
为供试品中内参物s的峰面积；
[0058]cs
为供试品中内参物s的浓度；
[0059]fsi
为内参物s对待测成分i的校正因子。
[0060]
公式分别计算vicenin-2、vicenin-1、新夏佛塔苷、vicenin-3、异牡荆苷的含量。
[0061]
结果如图1、图2、表1和表2所示，可以看出vicenin-2、vicenin-1、新夏佛塔苷、vicenin-3、异牡荆苷和夏佛塔苷的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度(大于1.5)，峰形对称，灵敏度高，拖尾小，均能满足定量检测要求。
[0062]
表1相对保留时间和相对校正因子(rcf)
[0063]
[0064][0065]
表2色谱图分析
[0066][0067]
实施例2
[0068]
按照实施例1的方法进行检测，区别在于，超高效液相色谱条件如下：
[0069]
色谱柱：waters acquity beh c18，2.1mm
×
100mm,1.7μm。
[0070]
流动相：0.5体积％三氟乙酸水溶液-甲醇(90：10)为流动相a，以甲醇为流动相b。
[0071]
洗脱方式：等度洗脱，流动相a和流动相b的比例为90:10。
[0072]
流速：0.2ml/min；柱温为60℃；检测波长：330nm；运行时间：45min。
[0073]
理论塔板数按夏佛塔苷计算应不低于20000。
[0074]
结果如图3(定位溶液)、图4(供试品溶液)、表3和表4所示，可以看出vicenin-1、新夏佛塔苷、vicenin-3和夏佛塔苷的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度(大于1.5)峰形对称，灵敏度高，拖尾小，均能满足定量检测要求，vicenin-2、异牡荆苷分离度低于1.5高于1.2，表明其可以实现检测6种组分的目的，但是分离效果不及实施例1。
[0075]
表3相对保留时间和相对校正因子(rcf)
[0076][0077]
[0078]
表4色谱图分析
[0079][0080]
对比例1
[0081]
按照实施例1的方法进行检测，区别在于，超高效液相色谱条件如下：
[0082]
色谱柱：waters acquity beh c18，2.1mm
×
100mm,1.7μm。
[0083]
流动相：0.5体积％三氟乙酸水溶液-乙腈(90：10)为流动相a，以甲醇为流动相b。
[0084]
洗脱方式：采用如下梯度洗脱条件：
[0085]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～20100
→
950
→
520～3095
→
895
→
1130～35891135～3689
→
10011
→
036～451000
[0086]
。
[0087]
流速：0.2ml/min；柱温为60℃；检测波长：330nm；运行时间：45min。
[0088]
理论塔板数按夏佛塔苷计算应不低于20000。
[0089]
由图5可以看出，vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷的色谱峰达到完全分离，且具有较大的分离度，理论塔板数和灵敏度也较高；但vicenin-2、vicenin-3、异牡荆苷的峰形处基线不平，峰形不是完全对称，拖尾因子较大，重现性较差，本方法用甲醇作为流动相a的溶剂，vicenin-1、异牡荆苷的峰形处基线平整，峰形完全对称，拖尾因子符合要求，重现性好，即本方法更佳。
[0090]
对比例2
[0091]
按照实施例1的方法进行检测，区别在于，超高效液相色谱条件如下：
[0092]
色谱柱：waters acquity beh c18，2.1mm
×
100mm,1.7μm。
[0093]
流动相：0.1体积％甲酸为流动相a，以甲醇为流动相b。
[0094]
洗脱方式：采用如下梯度洗脱条件：
[0095]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0～20100
→
950
→
520～3095
→
895
→
1130～35891135～3689
→
10011
→
036～451000
[0096]
。
[0097]
流速：0.2ml/min；柱温为60℃；检测波长：330nm；运行时间：45min。
[0098]
理论塔板数按夏佛塔苷计算应不低于20000。
[0099]
由图6可以看出，vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷的色谱峰均未达到完全分离，峰形处基线不平，峰形不是完全对称，拖尾因子较大，重现性较差，本方法用0.5体积三氟乙酸作为流动相a的溶剂，vicenin-2、vicenin-1、夏佛塔苷、新夏佛塔苷的峰形处基线平整，峰形完全对称，拖尾因子符合要求，重现性好，即本方法更佳。
[0100]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0101]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。