一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法与流程

一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法
一、技术领域
1.本发明涉及一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法。
二、

背景技术：

2.生物膜孔广泛存在于细胞表面，与免疫系统、炎症或其它相关疾病中细胞的死亡息息相关。膜孔可由nk细胞或t细胞分泌的内毒素-穿孔素聚集产生，也可由外毒素，如胆固醇依赖的细胞溶素(cdc)家族中的细菌外毒素-链球菌溶血素(slo)连至细胞膜后聚集形成。膜孔的形成机制已被很好研究，然而由于相关技术的匮乏，难以进行细胞膜上膜孔修复过程的监测以及修复机制的研究。目前，膜孔的可视化主要通过在固定后的死细胞或者人造磷脂双分子层上借助电子显微镜和原子力显微镜实现。此外，一些基于指示流经膜孔的ca
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或者荧光标记穿孔单体来监测膜孔修复的荧光方法，由于荧光信号读出与实际修复过程不能同步，而且灵敏度也不足，不能指示活细胞上膜孔修复的真实过程。因此，在该领域迫切需要发展一种灵敏的测试方法，实现活细胞上膜孔修复过程的动态监测与修复机制研究。
3.该专利设计了一种成孔蛋白诱导的动态拉曼成像方法，通过修复过程中表面增强拉曼(sers)信号的降低，实现对活细胞膜修复过程的动态成像。
三、

技术实现要素：

4.本发明的目的是：基于金纳米星(aunss)的聚集产生sers信号，设计了由成孔蛋白-slo在细胞膜上聚集，诱导sers探针在膜孔上聚集而产生的sers信号。通过细胞膜修复过程中，slo及其偶联的sers探针不断地从细胞表面脱落，导致细胞膜上拉曼信号的降低，实现细胞膜修复过程的动态监测，并阐明修复机制，为细胞膜修复相关疾病的治疗提供新的技术支撑。
5.本发明提出的细胞膜修复的动态sers成像策略如图1所示。首先合成由二苄环辛基-磺基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(dbco-sulfo-nhs ester)修饰的slo(slo-dbco)，并用slo-dbco在细胞膜上聚集形成膜孔。同时，将拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮-聚乙二醇(peg-n3)同时修饰在aunss表面获得sers探针。sers探针与细胞膜孔上slo-dbco的点击化学反应使其在膜孔周围聚集产生sers信号，实现膜孔的拉曼成像。在细胞膜修复过程中，膜孔逐渐变小，slo及其偶联的sers探针不断地从细胞表面脱落，使sers信号逐渐降低，直至膜孔完全修复，通过sers信号的变化实现整个修复过程的动态监测。
6.本发明通过以下技术方案来实现：
7.1)将成孔蛋白slo与dbco-sulfo-nhs ester在室温下反应2小时，形成具有成孔活性的成slo-dbco偶联物。
8.2)将拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮-聚乙二醇(peg-n3)共修饰在aunss表面获得sers探针。
9.3)活细胞在含slo-dbco的培养液中温育，可使slo-dbco在细胞膜上聚集形成大的
膜孔。
10.4)如图1所示，上述组成膜孔的slo-dbco通过与sers探针的点击反应，使sers探针在膜孔上方聚集，从而产生sers信号。
11.5)如图1所示，随着细胞膜孔的修复，膜孔逐渐变小，slo及其偶联的sers探针不断地从细胞表面脱落，使sers信号逐渐降低，从而实现活细胞膜孔修复的动态拉曼成像。
12.与现有技术相比，本发明具有以下特点：
13.本发明中设计的监测方法，具有简单、无损、灵敏、原位动态追踪的特点。膜孔在活细胞上形成之后，不需对细胞进行固定后再成像，信号产生策略对细胞以及膜孔没有损伤，且基于金纳米粒子固有的信号增强效应，实现对信号放大，以满足本发明原位动态监测膜孔修复过程的需求。
四、附图说明
14.图1.细胞膜修复过程动态监测的表面增强拉曼光谱方法示意图
五、具体实施方式
15.实施例1：slo-dbco偶联物的合成与细胞穿孔实验
16.用二硫苏糖醇(dtt)将成孔蛋白slo在37℃下活化2小时后，取slo溶液(0.55μm)与dbco-sulfo-nhs ester(47μm)混合，在垂直旋转仪上反应2小时。用30kda的超滤管超滤(14000g，4℃)5次除去反应体系中多余的dbco-sulfo-nhs ester，制得具有穿孔活性的slo-dbco偶联物。
17.以mcf-7乳腺癌细胞系为细胞模型，mcf-7细胞在37℃培养箱中温育过夜，用hank’s平衡盐缓冲液(hbss，含有2mm cacl2)洗3次后，与slo-dbco(200u ml-1
)在37℃培养箱中温育20分钟，即可在细胞膜上形成slo-dbco聚集的孔。
18.实施例2：sers探针的合成
19.首先将5ml 1％柠檬酸三钠加入100ml沸腾的haucl4溶液反应20分钟制得15-nm金种，冷却至室温后滴入8.6ml pvp(25.6g l-1
，mw＝10000)过夜，再与15ml含0.12mm haucl4和10mm pvp的dmf溶液反应15分钟，制得金纳米星(aunss)。将aunss分散在500μl水中后，依次加入10μl10mm拉曼报告分子mba的乙醇溶液和490μl新制备的hs-peg-n3(2mm)溶液，在室温下摇匀过夜。在8000rpm下离心洗涤两次，得到sers探针(aunss-mba/peg-n3)，并悬浮于500μl水中备用。
20.实施例3：结合图1，sers探针在细胞膜上的聚集产生sers信号
21.将实施例1中获得的细胞与sers探针(0.2nm)在37℃培养箱中温育30分钟，通过-peg-n3与-dbco的点击反应，可将sers探针聚集在细胞膜上由slo形成的孔上，产生sers信号，实现对细胞膜孔的拉曼成像。
22.实施例4：结合图1，活细胞膜修复过程的动态拉曼成像监测
23.将实施例3中经sers探针聚集的细胞转至含10％胎牛血清的1640培养液中，在37℃培养启动细胞的修复过程。每隔10分钟，取出修复不同时间的细胞，用不含胎牛血清的1640培养液轻洗3次进行拉曼成像，直至完成整个修复行为，即可实现对活细胞修复过程的动态监测。


技术特征：
1.一种用于细胞膜修复过程动态追踪的表面增强拉曼(sers)成像方法，其特征为用sers探针偶联细胞表面上的成孔蛋白slo，在细胞表面聚集产生相应的sers信号，由于细胞膜修复引起sers信号的降低，实现细胞膜修复的动态监测。2.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于成孔蛋白slo上的氨基与二苄环辛基-磺基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(dbco-sulfo-nhs ester)反应，制得有穿孔活性的slo-dbco。3.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于slo-dbco在细胞膜上成孔后，通过与sers探针上的叠氮-聚乙二醇(peg-n3)的点击反应，诱导sers探针在膜孔周围聚集产生sers信号，实现膜孔的拉曼成像。4.根据权利要求1所述的成像方法，其特征在于随着细胞膜的修复，slo及其偶联的sers探针不断地从细胞表面脱落，导致细胞膜上拉曼信号的降低，实现细胞膜修复过程的动态监测。

技术总结
本发明设计一种用于细胞膜修复过程动态监测的拉曼成像方法。该方法用成孔蛋白SLO与二苄环辛基-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-sulfo-NHS ester)的反应产物SLO-DBCO作为成孔单体，在活细胞膜上聚集成孔，再利用SLO-DBCO与拉曼信标分子(对巯基苯甲酸)和叠氮-聚乙二醇(PEG-N3)共修饰的金纳米星探针之间的点击反应，将表面增强拉曼(SERS)探针聚集到膜孔周围产生SERS信号，实现膜孔的拉曼成像。在细胞膜修复过程中，膜孔逐渐变小，SLO及其偶联的SERS探针不断地从细胞表面脱落，使SERS信号逐渐降低，直至膜孔完全修复，通过SERS信号的变化实现整个修复过程的动态监测。本发明为细胞膜修复过程的动态监测及其修复机制研究提供了一种简单、灵敏的方法，也为膜孔修复相关疾病的治疗提供了新的技术支撑。疾病的治疗提供了新的技术支撑。疾病的治疗提供了新的技术支撑。


技术研发人员：鞠熀先 杨媛娇 陈云龙
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2020.09.09
技术公布日：2022/3/25