具有卟啉壳的纳米乳液的制作方法

具有卟啉壳的纳米乳液
1.相关申请
2.本技术要求于2019年5月7日提交的美国临时申请第62/844,543号的优先权，其通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及纳米乳液，并且更具体地涉及包含卟啉的纳米乳液。


背景技术：

4.典型的纳米乳液为尺寸为20nm至200nm的水包油或油包水液滴，并且通常通过表面活性剂来稳定。
1.鉴于纳米乳液的容易且可扩展的生产和有前景的亲脂性化合物负载亲和力，其有利于药物递送，
2.因此产生许多fda批准的产品，例如和
[2b]
由于多模态和治疗诊断技术在癌症纳米医学中越来越受欢迎，
[3]
因此已经通过以下研究了许多多功能和/或靶向纳米乳液
[4]
：经由包封或表面功能化方法将不同的功能组分堆叠在一起，从而产生复杂的结构，并且通常需要用于制造的复杂程序。
[4c，5]
表面活性剂在经典纳米乳液构造中起着必不可少的作用，因此占主要重量分数，这不利地限制了药物或成像剂负载容量
[6]
并在全身性递送中导致不期望的毒性或免疫原性应答。
[7]
卟啉是具有红色或近红外吸收特性、高单线态氧(1o2)量子产率和金属螯合特性的可生物降解的有机杂环分子，因此是非常适用于多模态成像和治疗的组分。
[8]


技术实现要素：

[0005]
在一个方面中，提供了一种纳米颗粒，其包括围绕内油核的外壳，所述外壳包含卟啉盐、膨胀卟啉盐或卟啉盐的类似物。
[0006]
在一个方面中，提供了包含本文所述的纳米颗粒和水的组合物。所述组合物优选不含表面活性剂。在一些实施方案中，所述纳米颗粒在pbs中。在一些实施方案中，所述组合物为纳米乳液。
[0007]
在一个方面中，提供了制备本文所述的组合物的方法，所述方法包括使包含卟啉盐、膨胀卟啉盐或卟啉异构体盐与油的混合物的膜水合。
[0008]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行荧光成像的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及对目标区域进行成像。
[0009]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行光声成像的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及对目标区域处的光声信号进行测量和/或检测。
[0010]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行光动力学治疗的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及用激发所述组合物以产生自由基和/或活性氧类的波长的光对目标区域进行照射。
[0011]
在一个方面中，提供了向对象递送诊断剂或治疗剂的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的组合物，其中纳米颗粒己共负载有所述诊断剂或治疗剂。
[0012]
在一个方面中，提供了本文所述的组合物用于进行成像的用途。
[0013]
在一个方面中，提供了本文所述的组合物用于向对象递送诊断剂或治疗剂的用途，其中纳米颗粒已共负载有所述诊断剂或治疗剂。
附图说明
[0014]
本发明的优选实施方案的这些和其他特征将在以下参照附图的详细描述中变得更加明显，在附图中：
[0015]
图1.(a)newps的示意图：pyro盐和ce6盐的分子结构以及相应的pyronewps(ai)和ce6-newps(bi)的tem图像。(b)pyronewps和ce6-newps的表征：吸收光谱(aii、bii)、cd光谱(aiii、biii)和荧光光谱(aiv、biv)。
[0016]
图2.通过物理和光学特性监测pyronewps对(a)温度变化、(b)ph变化和(c)在血清条件下的胶体稳定性，所述物理和光学特性包括：尺寸、ζ电势和pdi的变化(ai、bi、ci)；吸收光谱(aii、bii、cii)、cd光谱(aiii、biii)、pa信号(ciii)和荧光猝灭效率(aiv、biv、civ)。
[0017]
图3.pyronewps的关于(a)光声成像和荧光成像、(b)光热能力和(c)单线态氧产生的多模态。静脉内注射pyronewps之后的小鼠模型上的kb肿瘤的体内光声成像(pai)(d)和荧光成像(e)。治疗之后对荷有kb肿瘤的小鼠的体内pdt效力：肿瘤生长曲线(g)和存活曲线(f)(***表示p＜0.001，其通过单因素anova检验)。
[0018]
图4.幻影ct/pa成像(a)示出了正线性浓度依赖性(b)ct信号相关性和(c)pa信号相关性。在注射pyronewps(碘油)之后2小时时小鼠的体内全身ct成像(d)和肿瘤pa成像(f)。(e至g)比较了注射之前和之后肿瘤区域周围的ct成像和pa成像的信号值量化(***表示p＜0.001，其通过双尾t检验)。(h)pyronewps&ptx的tem图像以及(i)pyronewps@ptx相对于taxol对包括a549细胞、h460细胞和kb细胞的多种癌细胞的ic50。
[0019]
图5.制备newps的示意图概要。将卟啉盐和油溶解在chcl3和meoh(9∶1＝chcl3∶meoh)中(a)，在n2流下干燥＞3小时(b)。添加pbs(3ml)并在50℃下对膜进行浴式声处理30分钟直至溶液澄清(c)。在30000psi下使溶液通过微流化器10次(d)。
[0020]
图6.(a)pyronewps的dls谱；(b)pyronewps与其纳米结构破碎的样品在1％(体积/体积％)triton x-100中的照片。
[0021]
图7.为了优化pyronewps制剂，将pyro含量与油体积的多种比率(mol/l的比率，表示为p/o)应用于制剂制备。(a)具有不同p/o的多种pyronewps的尺寸、形态、ζ电势；(b)具有相应p/o的这些pyronewps的tem图像和动态光散射(dynamic light scattering，dls)谱，比例尺＝200nm。结果表明，随着pyro含量的增加(p/o为1∶20至2∶20)，newps的尺寸从190nm显著减小至139nm，同时尺寸分布从0.39调整变窄至0.18。使p/o比率自2∶20进一步增加未显著改变颗粒的尺寸和pdi(约100nm的尺寸和约0.1的pdi)。此外，对于p/o比率为1∶20的pyronewps，观察到明显的颗粒聚集体和多分散性，但是对于那些显示出单分散且窄的尺寸分布的p/o比率≥2∶20的newps，没有观察到明显的颗粒聚集体和多分散性。这些数据一起表明，需要足够量的pyro盐(p/o＞2∶20)来形成稳定的newps卟啉壳。
[0022]
图8.通过pyronewps在8周内的尺寸和的pdi变化(a)以及储存8周之后的tem图像和dls谱(b)分析p/o比率为2∶20至5∶20的pyronewps的4℃下储存能力。比例尺＝200nm。对于p/o比率为3∶20至5∶20的pyronewps，证明了良好的稳定性，这通过其两个月储存内的流体动力学直径和pdi的微小波动得到支持。
[0023]
图9.通过uv-vis光谱(ai)、j聚集体带(715nm)/单体带(670nm)的吸收比率(bi)、cd光谱(aii和bii)和荧光猝灭效率(aiii和biii)进一步检查多种新鲜制备的pyronewps(p/o比率为3∶20至5∶20)的光学特性(a)及其在4℃下储存8周的光学稳定性(b)。还测量了1％(体积％)triton x-100中的pyronewps(作为破碎的newps样品)的光学特性作为对照并用于确定荧光猝灭效率(％)：完整的newps从600nm至800nm的完全荧光信号除以破碎的newps从600nm至800nm的完全荧光信号。结果表明，在newps中形成pyro盐的有序聚集(j聚集)，并且p/o比率为3∶20至5∶20的那些pyronewps在储存期间非常稳定。
[0024]
图10.使用uplc方法对重力分离(30000rpm，持续3小时)之后的最终pyronewps制剂中的pyro盐/甘油基油的量化。通过uplc方法的pyro盐(a)和油(b)的标准曲线；将检测到的p/o比率(c)与初始进料p/o比率进行比较，表明优化的pyronewps的p/o为4∶20。
[0025]
图11.重力纯化之后(30000rpm，持续3小时)的pyronewps表征：dls谱(a)、tem图像(b)及与其纳米结构破碎的样品相比的其吸收光谱(c)、cd光谱(d)和荧光光谱(e)；经纯化的pyronewps显示出高的储存稳定性，这通过其在4℃下储存8周之后的dls谱(f)和tem图像(g)得到证明。
[0026]
图12.p/o比率为4∶20的ce6newps的dls谱(a)和tem图像(b)：新鲜制备的ce6newps(ai，bi)；重力纯化(30000rpm，持续3小时)之后的ce6newps(aii，bii)；在4℃下储存8周之后的经纯化的ce6newps(aiii，biii)。比例尺：100nm。
[0027]
图13.pyro浓度为200μm的pyronewps在用pbs中的50％fbs孵育24小时之后的tem图像。
[0028]
图14.pyronewps的细胞内摄取：kb细胞在用pyronewps分别孵育1小时、3小时、6小时和24小时之后的荧光显微镜成像(a)。不同时间点下kb细胞中的pyronewps的细胞内摄取通过流式细胞术分析(b)来测量并通过pyro的中位荧光信号(c)来量化。
[0029]
图15.对用不同浓度的pyronewps孵育并经受671nm激光处理之后的kb细胞评估pyronewps的光动力学能力。利用mtt测定来量化细胞生存力并相对于未处理的细胞对照物归一化。平均值
±
s.d.(n＝4)(a)。kb细胞在用不同浓度的pyronewps孵育并暴露于以2.5j/cm2的功率密度的671nm激光之后的活/死细胞图像。活细胞用钙黄绿素-am染成绿色，以及死细胞用ethd-1染成红色(b)。比例尺＝100μm。
[0030]
图16.pyronewps的血液清除率曲线。
[0031]
图17.肿瘤在静脉内施用pyronewps之前和之后的不同时间点的pa值。
[0032]
图18.p/o比率为4/20的pyronewps(碘油)的表征。通过dls(a)和tem图像(b)测量其尺寸和形态。通过uv-vis光谱(c)、cd光谱(d)和荧光分光光度法(e)的完整的pyronewps(碘油)(在pbs中)和破碎的pyronewps(碘油)(在1体积/体积％triton x-100中)的光学特性。
[0033]
图19.pyronewps(碘油)在4℃下8周内的尺寸储存稳定性(a)。pyronewps(碘油)在储存8周之后的tem图像(b)。
[0034]
图20.用pbs中的50％fbs孵育的pyro浓度为200μm的pyronewps(碘油)的血清稳定性。通过dls监测尺寸和pdi随时间的变化(a)；在血清孵育之后24小时的tem图像(b)；通过uv吸收光谱(c)和荧光猝灭效率(d)确定光学特性随时间的变化。
[0035]
图21.制备经ptx负载的pyronewps的示意图概要。将卟啉盐、油和ptx溶解在chcl3和meoh(9∶1＝chcl3∶meoh)中(a)，在n2流下干燥＞3小时(b)。添加pbs(3ml)并在50℃下对膜进行浴式声处理30分钟直至溶液澄清(c)。在30000psi下使溶液通过微流化器10次(d)。通过离心法(30000rpm，3小时)将pyronewps@ptx纯化(e)。
[0036]
图22.示出负载紫杉醇的pyronewps的颗粒尺寸、药物包封效率和药物负载容量的表。包封效率(ee)(％)＝纳米乳液中ptx的重量/制剂中初始进给的ptx的重量
×
100％；
[0037]
药物负载容量(dl)(％)＝纳米乳液中ptx的重量/最终纳米乳液的重量
×
100％。
[0038]
图23.新鲜制备的pyronewps@ptx的光学特性(a)。(ai)吸收光谱；(aii)荧光猝灭效率(qe)；(aiii)圆二色性光谱。pyronewps@ptx在8周储存期间的稳定性测量(b)。(bi)j峰吸收/单体峰吸收的比率变化；(bii)储存期间的荧光猝灭效率变化；(biii)储存期间的圆二色性光谱变化。
[0039]
图24.使用pyronewps@ptx或taxol对a546细胞、h460细胞和kb细胞的体外细胞毒性评估。使用在实验浓度下对所有细胞均不引起显著细胞毒性的相同pyro浓度的pyronewps作为空载体对照。将ic50值计算为导致50％细胞生长的致死的ptx浓度。获得的所有ic50值均为来自三个独立mtt测定的平均值。示出的每个mtt测定数据均为平均值
±
sd(n＝4)。
具体实施方式
[0040]
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的透彻理解。然而，应理解，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实施。
[0041]
通过卟啉盐围绕油核的自组装产生具有卟啉壳的纳米乳液(newps)。newps具有约100nm球形结构，以及对温度、机械搅拌、ph的急剧变化以及在血清中的优异的胶体稳定性。newps体系适用于不同的卟啉盐(单钠盐或三钠盐)和油(低密度或高密度)，并且能够共负载化学治疗剂(紫杉醇)。卟啉盐壳对于纳米结构构建是必不可少的，并且提供了卟啉依赖性的光学可调性。在由焦脱镁叶绿酸a单盐制成的newps(pyronewps)中，形成卟啉壳的有序j聚集以产生具有增加的吸光度的窄红移(671nm至715nm)q带。这使得光谱不同的光声成像(在715nm下由完整的newps)和荧光增加(在671nm下由解离的newps)能够追踪kb肿瘤小鼠模型中的newps积累和破碎，并指导有效的pdt。用模型中的newps积累和破碎，并指导有效的pdt。用()交换油核提供了另外的ct对比度，而将紫杉醇负载到newps中提供了药物递送能力。这种简单的双组分newps为多模态癌症成像、光疗和成像引导的药物递送提供了新的纳米平台。
[0042]
在一个方面中，提供了一种纳米颗粒，其包括围绕内油核的外壳，所述外壳包含卟啉盐、膨胀卟啉盐或卟啉盐的类似物。
[0043]
在一些实施方案中，外壳为卟啉盐。优选地，卟啉盐为以下的盐：血卟啉(例如氯高铁血红素)、原卟啉(原卟啉ix)、焦脱镁叶绿酸a、细菌叶绿素衍生物(例如细菌脱镁叶绿酸)、叶绿素a、四苯基卟啉衍生物、苯并卟啉衍生物、维替泊芬、二氢卟酚、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、绿卟啉(rhodin)、酮基二氢卟酚(keto chlorin)、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟
啉、甲苯卟啉、苯并细菌二氢卟酚、次卟啉、2，7，12，18-四甲基-8-乙烯基-21h，23h-卟啉-13，17-二丙酸(pemptoporphyrin)、叶赤素、卟吩或红紫素18。进一步优选地，卟啉盐为羧酸盐或磺酸盐。
[0044]
在一些实施方案中，外壳为膨胀卟啉盐。优选地，膨胀卟啉盐为德克萨卟啉(texaphyrin)、噻呋啉(sapphyrin)或扩展卟啉(hexaphyrin)的盐。
[0045]
在一些实施方案中，外壳为卟啉盐的类似物。优选地，卟啉盐的类似物为以下的盐：类卟吩(porphycene)、转化的卟啉(inverted porphyrin)、酞菁、萘酞菁、bodipy染料或花青染料。在一些实施方案中，卟啉盐的类似物为锌(ii)酞菁单钠盐、氮杂-bodipy单钠盐或icg花青盐。
[0046]
在一些实施方案中，卟啉盐为焦脱镁叶绿酸a单钠盐。
[0047]
在一些实施方案中，卟啉盐为二氢卟酚e6三钠盐。
[0048]
在一些实施方案中，卟啉盐为细菌脱镁叶绿酸a单钠盐。
[0049]
在一些实施方案中，油为改性或水解的植物油、天然甘油二酯或甘油三酯；中链甘油三酯；包含半合成中链甘油三酯的化合物(例如gelucire)、可消化或不可消化的油或脂肪。
[0050]
在一些实施方案中，油为橄榄油、玉米油、大豆油、棕榈油、动物脂肪、脂醇(lipidol)油或矿物油。或者，在单独的实施方案中，油为甘油三辛酸酯油或脂醇(lipidol)。
[0051]
在一些实施方案中，所述纳米颗粒的直径为50nm至200nm。在另一些实施方案中，所述纳米颗粒的直径为80nm至150nm或者直径为约100nm。
[0052]
核内可以包封有广泛多种的疏水性生物活性剂或治疗剂、药用物质或药物。
[0053]
在一些实施方案中，所述纳米颗粒共负载有治疗剂或诊断剂。
[0054]
术语“治疗剂”是本领域公认的，并且是指作为生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。治疗剂(也被称为“药物”)的实例在公知的参考文献例如merck index、physicians
′
desk reference和the pharmacological basis of therapeutics中进行了描述，并且它们包括而不限于以下：药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病症的物质；影响身体的结构或功能的物质；或前药，前药在置于生理环境中之后变得具有生物活性或更具活性。可以使用在施用至对象时能够从对象组成释放到相邻组织或流体中的多种形式的治疗剂。
[0055]“诊断剂”或“诊断剂”是可以用于诊断的任何化学部分。例如，诊断剂包括：成像剂，例如包含诸如铟或锝的放射性同位素的那些；包含碘或钆的造影剂；酶，例如辣根过氧化物酶、gfp、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶；荧光物质，例如铕衍生物；发光物质，例如n-甲基吖啶(n-methylacrydium)衍生物；等等。
[0056]
在一个实施方案中，治疗剂为化学治疗剂，优选为紫杉烷类，更优选为紫杉醇。在另一些实施方案中，试剂为多西他赛或1，1
’‑
双十八烷基-3，3，3’，3
’‑
四甲基吲哚三羰花青碘化物双油酸酯(dir-boa)。
[0057]
在一些实施方案中，负载容量为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％。
[0058]
在一个方面中，提供了包含本文所述的纳米颗粒和水的组合物。所述组合物优选
不含表面活性剂。在一些实施方案中，所述纳米颗粒在pbs中。在一些实施方案中，所述组合物为纳米乳液。
[0059]
在一些实施方案中，卟啉(p)与油(o)体积(mol/l)比率大于2∶20。优选地，p/o比率为2∶20至5∶20，并且更优选为约4∶20。
[0060]
在一个方面中，提供了制备本文所述的组合物的方法，所述方法包括使包含卟啉盐、膨胀卟啉盐或卟啉异构体盐与油的混合物的膜水合。
[0061]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行荧光成像的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及对目标区域进行成像。
[0062]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行光声成像的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及对目标区域处的光声信号进行测量和/或检测。
[0063]
在一个方面中，提供了对对象中的目标区域进行光动力学治疗的方法，所述方法包括：提供本文所述的组合物；将所述组合物施用至对象；以及用激发所述组合物以产生自由基和/或活性氧类的波长的光对目标区域进行照射。
[0064]
在一个方面中，提供了向对象递送诊断剂或治疗剂的方法，所述方法包括向对象施用本文所述的组合物，其中所述纳米颗粒已共负载有所述诊断剂或治疗剂。
[0065]
在一个方面中，提供了本文所述的组合物用于进行成像的用途。
[0066]
在一些实施方案中，成像用于乳房成像、肿瘤成像、颈动脉新血管形成成像或内窥镜成像。
[0067]
在一个方面中，提供了本文所述的组合物用于向对象递送诊断剂或治疗剂的用途，其中所述纳米颗粒已共负载有所述诊断剂或治疗剂。
[0068]
通过以下实施例进一步举例说明本发明的优点。本文中阐述的实施例及其特定细节仅出于举例说明的目的而呈现，并不应被解释为对本发明权利要求书的限制。
[0069]
实施例
[0070]
方法和材料
[0071]
newps通过以下形成：使卟啉盐和油的膜水合，通过高能微流控方法使其经受均质化。运行nanosizer zs90(malvem instruments)和用2％乙酸双氧铀阴性染色的透射电子显微镜来测量newps的尺寸、ζ和形态。使用fluoromax荧光计(horiba jobin yvon)在410nm下激发的情况下来表征荧光光谱和自猝灭并收集600nm至800nm的发射。通过完整的newps的600nm至800nm的总荧光信号与破碎的newps的600nm至800nm的总荧光信号的比率来确定荧光猝灭效率(％)。使用j-815圆二色性光谱仪(jasco)来收集newps的cd光谱。用671nm激光照射(dpss laserglow technologies，toronto，加拿大)来进行通过单线态氧荧光探针(singlet oxygen sensor green，sosg)方法测量的pdt和单线态氧产生。分别在vevo 2100 lazr光声成像系统(fujifilm visualsonics，toronto，on)和maestro成像系统(cri maestro，美国)上进行荧光成像和光声成像。在ge explore locus ultra microct上进行ct成像，并通过siemens inveon research workplace 4.0来分析数据。
[0072]
结果和讨论
[0073]
在本文中，我们创造了作为新的不含表面活性剂的水包油纳米平台的具有卟啉壳的纳米乳液(newps)(图1ai和图bi)。newps为卟啉盐分子围绕油核的自组装，从而产生具有
用于成像和光疗的多功能性的简单双组分结构。我们已经证明，两亲卟啉盐壳使油核稳定以提供具有优异的胶体稳定性的单分散球形纳米乳液，而油核还提供了用于有效包封疏水性分子(例如，紫杉醇)的温和基质，因此能够实现用于多模态癌症成像、光疗和成像引导的药物递送的多功能纳米平台。
[0074]
newps的第一个原型是通过使用焦脱镁叶绿酸a(pyro)单钠盐(pyro盐)使甘油三辛酸酯油核稳定而配制的。选择pyro盐是由于其具有疏水性卟啉环和亲水性羧酸盐头的两亲性(图1ai)以及其对脂质纳米颗粒的水-油界面的亲和力。
[9]
选择具有与食品级乳液中使用的食品脂肪一样的分子结构的甘油三辛酸酯
[10]
作为模型油相。newps通过以下来生产：在声处理下使卟啉盐和油混合物的膜简单水合以产生水包油微乳液，然后通过微流化器将尺寸减小至纳米级(图5)。透射电子显微术(tem)成像(图1ai)和动态光散射(dls)测量(图6a)揭示了pyronewps具有拥有直径为约100nm的主要尺寸的单分散球形壳-核结构。令人感兴趣的是，pbs中完整的pyronewps的颜色在视觉上与清洁剂中的其纳米结构破碎的样品的颜色不同(图6b)。进一步的吸收光谱测量揭示了在与破碎的pyronewps样品相比时，pyronewps产生了窄的红移(671nm至715nm)和增加的q带吸光度(图1aii)，表明pyro盐在pyronewps中形成了有序的j聚集。这种显著的红移(44nm)吸收可能归因于经扩展的π相互作用体系。
[9]
一致地，在圆二色性(cd)光谱中在相应的红移吸光度处检测到明显的cotton裂分，从而证实了pyro盐在完整的newps中的有序聚集(图1aiii)。
[11]
此外，pyro盐的荧光在完整的pyronewps中被高度猝灭(猝灭效率超过96％)(图1aiv)，并且当纳米结构被迫破碎时可以有效地恢复，这加强了生物医学应用中的低背景荧光成像。通过在1∶20至5∶20的范围内调节卟啉含量(p)与油体积(o)的各种比率(mol/l)来优化pyronewps制剂。使形成的pyronewps经受形态、尺寸分布和光学特性测量(图7)，并且结果表明形成稳定的pyronewps需要足够量的pyro盐(p/o＞2∶20)。此外，p/o比率为3∶20至5∶20的pyronewps在4℃下2个月内显示出高的储存稳定性，这通过其形态、尺寸和尺寸分布(图8)以及光学特性(图9)的微小变化得到支持。由于pyronewps具有低密度的甘油三辛酸酯油核(d＝0.956g/ml)，因此应用机械离心法(30000rpm，3小时)浓缩来自pbs连续相的纳米颗粒来进行pyronewps纯化。当初始p/o比率超过4∶20时，在离心之后，过量的pyro盐与pyronewps分离(图10)，因此选择p/o比率为4∶20的pyronewps作为用于以下研究的最佳制剂。重要的是，高速离心未引起优化的pyronewps的尺寸、pdi、形态(图11a至图11b)和光学特性(图11c至图11e)的明显变化，表明其在重力纯化下具有良好的稳定性。如所预期的，经纯化的pyronewps具有在4℃下持续至少2个月的储存稳定性(图11f至图11g)。
[0075]
为了研究newps平台是否可以推广到其他卟啉盐，使用具有三个亲水性头的二氢卟酚e6(ce6)三钠盐使甘油三辛酸酯稳定以用于newps形成(图1b)。如所预期的，以4∶20的相同p/o比率形成稳定的ce6newps(图1bi、图12ai)。有趣的是，ce6盐未形成出现在pyronewps中的j聚集组装，这通过缺乏红移吸光度和其cd光谱中明显的cotton裂分得到证明(图1bii、图1biii)。荧光猝灭效率也降低(图1biv)。ce6newps在重力分离中并且在储存期间保持形态稳定(图12aii、图12bii、图12aiii、图12biii)，从而支持其作为稳定的纳米乳液。其尺寸在储存期间略微增加(在陈化8周时为150nm至160nm，图12aiii、图12biii)，这可能是由于ce6的多个亲水性头参与newps稳定化。这导致在newps的壳上经历构象变化的非j聚集体缔合组装的形成。引人注目的是，用ce6盐替代pyro盐保持了newps纳米结构稳定
性，同时消除了j聚集体形成，从而表明卟啉依赖性的光学可调性。
[0076]
接下来，评估了pyronewps对温度和ph变化的胶体稳定性。
[12]
如图2a至2b所示，加热至100℃并将ph从4变为12，导致pyronewps的物理和光学特性的微小变化。这些数据连同其在重力纯化下的高稳定性表明pyronewps具有高的胶体稳定性。在包含50％fbs的pbs中进一步评估血清稳定性。如图2ci所示，在24小时孵育期间未观察到尺寸和荧光猝灭效率上的显著变化，并且其球形结构得以保持(图13)，表明pyronewps在24小时内保持其在血清中的胶体稳定性。然而，在孵育之后6小时和24小时时，j聚集带的强度分别随时间逐渐降低至82％和59％(图2cii)。尽管如此，这样的光学稳定性足以使孵育之后24小时时的j带特异性光声信号(剩余超过60％)(图2ciii)能够用于体内成像应用。
[0077]
我们接下来研究了用于多模态光学成像的pyronewps。如所预期的，完整的pyronewps显示出可忽略不计的荧光(图3a，顶部)，同时以强的浓度依赖性正相关在715nm处表现出强的光声信号(图3a，底部)。此外，在690nm下的激光照射时检测到显著的温度升高(图3b)。这些数据表明pyronewps吸收了激光能量并有效地转化为热，从而在红移波长处产生光声(pa)成像和光热效力。
[13]
当newps被破碎时，715nm光声信号减弱，同时显著的单体卟啉的荧光(675nm)得以恢复(图3a)，并且在671nm激光照射下检测到有效的单线态氧产生(图3c)，由此加强了低背景荧光成像和可激活的pdt。pyronewps的细胞内摄取通过pyro荧光在显微镜下监测，并通过流式细胞术来定量，并且在671nm激光照射时进一步检查其pdt效力。结果(图14)表明pyro-newps被癌细胞有效吸收并最终被破碎以恢复pyro荧光和光反应性，从而引起有效的pdt应答(图15)。由于其有效的细胞摄取、可接受的血清稳定性(图2c)和实际循环半衰期(图16)，在荷有kb细胞异种移植物的小鼠上进一步研究了pyronewps的体内荧光成像和pa成像。如图3d所示，当在715nm处达到最大pa信号(图3e、图17)时，在静脉内施用之后2小时时在肿瘤中检测到低的荧光信号，表明pyronewps在肿瘤中迅速积累并且在注射之后2小时内主要保持完整形式以发出显著的pa信号。在注射24小时之后，由于pyronewps的解离导致单体pyro的光活性恢复，因此观察到高的肿瘤荧光信号和低的肿瘤pa信号。因此，荧光肿瘤随后接受了局部pdt激光治疗(671nm，100mw/cm2，135j/cm2，n＝5)。研究中还包括两个对照组：pyronewps/无激光和pbs/激光。通过纵向监测治疗之后的肿瘤生长而产生的肿瘤生长曲线(图3g)揭示了pyronewps-pdt显著抑制了肿瘤生长。(***表示p＜0.001，其通过单因素anova检验)并且在治疗之后20天时甚至导致完全抑制，并且存活率为100％(图3f)。相比之下，接受pbs/激光或pyronewps/无激光(n＝5)的对照组显示出指数肿瘤生长(图3g)，表明它们均未引起显著的治疗效果，并且在16天之前或16天时所有动物都达到终点(肿瘤体积＞400mm3)(图3f)。因此，pyronewps表现出完整pyronewps(715nm下的光声和ptt)和破碎pyronewps(671nm下的可激活荧光和pdt)的独特的结构依赖性生物光子功能的切换，以对其体内行为进行实时多模态成像并指导有效pdt。
[0078]
我们还证明了油核在newps平台中是可调的。当在pyronewps构建中用高密度碘油(d＞1.2g/ml)替代甘油三辛酸酯(d＝0.956g/ml)作为油核基质时，形成稳定的pyronewps(碘油)。如所预期的，该制剂在形态(例如窄的尺寸分布、球形结构，图18a至图18b)、pyro j聚集体光学特性(图18c至图18e)、稳定性(图19a至图19b)和血清稳定性(图20a至图20d)方面显示出与标准pyronewps类似的特性。此外，pyronewps(碘油)提供了另外的ct对比度。幻影成像研究显示出ct信号值(hu)与newps浓度之间的正线性相关性(图4a顶部、图4b)，与pa
值相对于newps浓度的线性相关性(图4a底部，图4c)相对应，从而导致pyronewps(碘油)用于双模态ct/pa成像的潜力。
[0079]
接下来在荷有异种移植的kb肿瘤的裸小鼠上研究pyro-newps(碘油)的体内ct/pa成像能力。在注射pyro剂量为57.9mg/kg且碘剂量为250mg/kg的pyronewps(碘油)之后进行时间依赖性的肿瘤ct和pa成像。在注射之后2小时时检测到显著的ct和pa信号增强二者(图4d和图4f)。肿瘤区域中的ct和pa值量化进一步验证了pyronewps(碘油)的双模态功能(图4e和图4g)。
[0080]
由于newps具有高重量分数的油基质(＞80重量％)，我们研究了其用于递送药物的能力。研究了标准pyronewps用于递送代表药物紫杉醇(ptx)。经ptx负载的pyronewps(pyronewps@ptx)的合成示于图21中。随着ptx负载量的增加，newps的流体动力学直径逐渐增加，同时ptx包封效率非线性下降(图22)。药物负载容量和包封效率通过uplc测定来分析。当在总共22mg制剂中初始添加ptx≤0.8mg时，药物负载容量可以达到85％，从而产生130nm尺寸以及球形且均匀的壳-核结构(图4h)以及与标准pyronewps类似的光学特性(图23ai至图23aiii)。形成的pyronewps@ptx在8周的储存期间是稳定的，并且尺寸、尺寸分布和形态的变化微小。如图23bi至图23biii中所示，在pyronewps中并入ptx对光学特性没有影响。化学治疗效力通过测量其对不同癌细胞的ic50来评估。当与临床ptx制剂toxal进行比较时，pyronewps@ptx对kb细胞、a549细胞和h460细胞的ic50分别降低了约94倍、85倍和24倍(图4i、图24)。因此，newps可以用作用于癌症治疗的有效药物递送载体。
[0081]
总之，创造了作为迄今为止已知的最简单的多功能纳米乳液体系的具有卟啉壳的新型纳米乳液(newps)。卟啉盐壳允许油核的包封和稳定以提供具有优异的胶体稳定性的单分散球形纳米结构。卟啉和纳米结构的固有多模态推动了用于成像和光疗的newps多功能性。此外，油核能够实现用于有效的疏水性分子包封的基质，从而为许多疏水性化学治疗药物的递送铺平了道路。newps的多模态可以通过简单地切换卟啉盐壳或油基质以及各种药物负载来设计。
[0082]
虽然已经在本文中描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求书的范围的情况下对其作出改变。本文公开的所有文献，包括以下参考文献列表中的那些，均通过引用并入。
[0083]
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