一种口岸截获粉蚧检疫鉴定玻片的快速制作方法与流程

1.本发明属于生物玻片的制作方法技术领域，特别涉及一种口岸截获粉蚧检疫鉴定玻片的快速制作方法。


背景技术：

2.粉蚧是小型吸汁昆虫，属于粉蚧属，分布全球，是热带、亚热带经济作物的重要害虫。危害果树、花卉、多肉等植物，常群集于枝、叶、果上，吸取植物汁液为生，严重时会造成植株死亡。粉蚧体表被白色或乳黄色蜡质覆盖物，酷似白粉披身。粉蚧雌成虫卵圆形，少数长形、圆球形或不对称型。体壁柔软。前胸背板和头部无明显分界。腹部体节明显。少数雌体完全无蜡被而裸露。雄虫成体纤细，头、胸和腹分明。触角3~10节。单眼4~6个，无复眼。膜质翅1对。有的缺膜质前翅和平衡棒。足细长。腹部倒数第二节有两个管状腺，雄成虫由此分泌出两条白色细长并较坚韧的蜡丝。交尾器短，雄虫幼虫常在白色蜡质茧里发育。
3.粉蚧是进境新鲜果蔬中常见的有害生物，也是一种重要的口岸有害生物检疫对象。由于粉蚧体型较小，且体表常被白色或乳黄色蜡质覆盖，一般需要经过实验室制作整理，才能在显微镜下观察其形态结构。传统的粉蚧玻片制作周期长，其中，染色步骤需要将粉蚧放到培养皿中静置8-12h进行染色，粉蚧的鉴定一般是当天送样第二天出结果报告，这样导致进境新鲜果蔬因为海关部门的检疫鉴定结果的原因，滞留口岸，增加了通关成本。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种口岸截获粉蚧检疫鉴定玻片的快速制作方法，缩短粉蚧玻片的制作周期，提升口岸有害生物的的快速检疫鉴定，减少新鲜果蔬的通关成本，提高通关效率。
5.为实现上述目的，本发明提供了一种口岸截获粉蚧检疫鉴定玻片的快速制作方法，包括如下步骤：（1）样品固定：挑取粉蚧样品置于预装有70%乙醇溶液的容器中杀死并浸泡固定2h以上；（2）样品净化：将上述固定好的样品置于载玻片上，在体视显微镜下观察并用毛笔轻轻去除虫体表面未溶解的蜡粉和其他杂质；接着用刀具在虫体背面头胸处纵向切一个小口；然后移入预热至90-95℃的碱性溶液中水浴5-10min；当虫体柔软时，用毛笔等轻轻挤压，尽可能挤出内含物，挤压动作要轻柔，注意保持虫体的完整性；随后将虫体移至70℃的热清水中清洗去杂，直至虫体透明；（3）样品漂洗：将除杂后的样本移入装有70%乙醇溶液的凹面皿中脱水5min；轻轻挤压虫体，进一步去除碱液及其溶解的内含物；（4）样品染色：将粉蚧样品放入装有98%的酸性品红的ep管，放置到自制的恒温震荡仪中，保持55摄氏度，同时加施震荡，保持1h以上；（5）样品清洗：将染色的样本移入装有70%乙醇溶液的凹面皿去除浮色；更换乙醇
溶液清洗1-2次；（6）样品固色：将步骤（5）处理过的样本移入装有丁香油的容器中浸泡透明10min并固定颜色，再将样本移入70%乙醇溶液中清理丁香油和其他杂质；（7）样品清理：在霍氏封片液浸泡10min以上，再次清理虫体内外杂物；（8）样品封盖：取载玻片滴入适量霍氏封片液，将样本移入霍氏封片液并整姿，盖上玻片封片，即可镜检。
6.优选的，步骤（1）中，对于需长期保存的样品，在70%乙醇溶液中加入甘油，所述甘油的添加量与70%乙醇溶液的体积比为1-2:50。
7.优选的，步骤（2）中，所述刀具为解剖刀或眼科手术刀。
8.优选的，步骤（2）中，所述碱性溶液为10%氢氧化钠或10%氢氧化钾。
9.优选的，步骤（3）中，所述70%乙醇溶液中添加冰醋酸，所述冰醋酸的添加量与70%乙醇溶液的体积比为1:5-9。
10.优选的，步骤（5）中，更换清洗用的乙醇溶液浓度为80%-95%，越往后，使用的乙醇溶液的浓度越高。
11.优选的，步骤（8）中，在玻片一侧贴上采集标签和鉴定标签，玻片封片后置于室内自然晾干或在40-50℃烘箱里烘干脱水3周后放入标本盒中保存备查。
12.优选的，步骤（4）中，所述恒温震荡仪包括机体，所述机体上设有调节显示装置和震荡装置，所述调节显示装置包括控制器和与所述控制器电连接的显示屏、总开关、加热开关、频率开关、温度调节按键、频率调节按键和时间调节按键；所述震荡装置上方固定有恒温装置，所述恒温装置包括加热装置和恒温金属槽，所述加热装置与所述控制器电连接，所述恒温金属槽设置在所述加热装置上方，所述恒温金属槽上方设置有样品固定架，所述样品固定架固定在所述震荡装置上，且样品固定架上设有与所述恒温金属槽对应的插孔。
13.优选的，所述加热装置包括加热板、第一加热片和第二加热片，所述加热板固定在所述震荡装置上，所述加热板上方设置有所述恒温金属槽，所述第一加热片和第二加热片设置在所述加热板下方，所述加热开关包括低温加热开关和高温加热开关，所述低温加热开关控制所述第一加热片的开关，所述高温加热开关控制所述第二加热片的开关。
14.优选的，所述震荡装置包括振荡器、震荡板和弹性片，所述振荡器设于所述机体内，所述震荡板与所述机体滑动连接、并由所述振荡器驱动来回摆动，所述加热装置设于所述震荡板上方，所述震荡板外周设有凹弧，所述弹性片设置在所述凹弧处，且弹性片的底部与所述机体固定、顶部悬空，所述振荡器启动后，所述弹性片间歇式与所述加热装置接触。
15.与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：1. 本发明采用高浓度酸性品红进行粉蚧样品的染色介质，将粉蚧样品放到装有98%的酸性品红的ep管，并放到恒温震荡仪中进行恒温震荡染色，1个小时即可完成染色，与改进前的，粉蚧样品放到凹面皿中静置8-12小时染色小臂，大大缩短了染色效率，缩短了样品的鉴定时间，缩短果蔬的通关效率，实现了粉蚧鉴定时间从原来当天送样第二天出具结果报告，变成现在的早上送样，当天下午出鉴定结果的快速检测。
16.2. 本发明将粉蚧样品置于含有甘油的乙醇溶液中浸泡固定，使粉蚧样品不易变软，有利于后续操作和保存。
17.3. 本发明将粉蚧样品置于含有冰醋酸的乙醇溶液中漂洗，可进一步去除碱液及
其溶解的内含物，更有利于观察。
18.4. 本发明根据需要改进恒温震荡仪，设置包括第一加热片和第二加热片的多级加热装置，配套恒温金属槽等结构的设置，可实现设定温度的加热及保温，振荡装置包括振荡器、震荡板和弹性片等结构，可加快染色并可提高染色的均匀性，通过恒温震荡染色，并调整染色介质浓度，可有效缩短粉蚧样品的染色时间。
附图说明
19.图1是本发明恒温震荡仪的结构示意图。
20.图2是根据本发明方法制备的粉蚧玻片。
21.图3是对比实施例1的方法染色1小时制备的粉蚧玻片。
22.图4是对比实施例1 的方法染色8小时制备的粉蚧玻片。
23.图5是对比实施例2方法制备的粉蚧玻片。
24.图6是对比实施例3方法制备的粉蚧玻片。
25.主要附图标记说明：1、机体；2、调节显示装置；201、控制器；202、显示屏；203、总开关；204、加热开关；2041、低温加热开关；2042、高温加热开关；205、频率开关；206、温度调节按键；207、频率调节按键；208、时间调节按键；3-震荡装置；301、振荡器；302、震荡板；303、弹性片；4、加热装置；401、加热板；402、第一加热片；403、第二加热片；5、恒温金属槽；6、样品固定架；601、插孔；7、ep管。
具体实施方式
26.下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
27.实施例1如图1所示，一种恒温震荡仪包括机体1和可拆卸的保温罩，所述机体1上设有调节显示装置2和震荡装置，所述调节显示装置2包括控制器201和与所述控制器201电连接的显示屏201、总开关203、加热开关204弹性片、频率开关205第二加热片、温度调节按键206恒温金属槽、频率调节按键207和时间调节按键208；所述震荡装置上方固定有恒温装置，所述恒温装置包括加热装置和恒温金属槽，所述加热装置与所述控制器201电连接，所述恒温金属槽设置在所述加热装置上方，所述恒温金属槽上方设置有样品固定架，所述样品固定架固定在所述震荡装置上，且样品固定架上设有与所述恒温金属槽对应的插孔。
28.进一步地，所述加热装置包括加热板、第一加热片和第二加热片，所述加热板固定在所述震荡装置上，所述加热板上方设置有所述恒温金属槽，所述第一加热片和第二加热片设置在所述加热板下方，所述加热开关204弹性片包括低温加热开关204弹性片1204弹性片和高温加热开关204弹性片2204弹性片，所述低温加热开关204弹性片1204弹性片控制所述第一加热片的开关，所述高温加热开关204弹性片2204弹性片控制所述第二加热片的开关。
29.进一步地，所述震荡装置包括振荡器、震荡板和弹性片，所述振荡器设于所述机体1内，所述震荡板与所述机体1滑动连接、并由所述振荡器驱动来回摆动，所述加热装置设于
所述震荡板上方，所述震荡板外周设有凹弧，所述弹性片设置在所述凹弧处，且弹性片的底部与所述机体1固定、顶部悬空，所述振荡器启动后，所述弹性片间歇式与所述加热装置接触。
30.使用时，将粉蚧样品放进装有98%酸性品红的ep管中，将ep管盖好后插入恒温震荡仪的插孔，启动总开关203，并设置加热温度、加热时间和震荡频率，如5第二加热片5第二加热片摄氏度恒温震荡1时间。时间到后，恒温震荡仪自动停止，并有结束提示音，即可将样品取出，操作简单方便。
31.实施例2一种口岸截获粉蚧检疫鉴定玻片的快速制作方法，包括如下步骤：（1）样品固定：挑取粉蚧样品置于预装有70%乙醇溶液的容器中杀死并浸泡固定2h以上。对于需长期保存的样品，在70%乙醇溶液中加入甘油，所述甘油的添加量与70%乙醇溶液的体积比为1-2:50。
32.（2）样品净化：将上述固定好的样品置于载玻片上，在体视显微镜下观察并用毛笔轻轻去除虫体表面未溶解的蜡粉和其他杂质；接着用解剖刀在虫体背面头胸处纵向切一个小口；然后移入预热至90-95℃的碱性溶液中水浴5-10min；所述碱性溶液为10%氢氧化钠或10%氢氧化钾。当虫体柔软时，用毛笔等轻轻挤压，尽可能挤出内含物，挤压动作要轻柔，注意保持虫体的完整性；随后将虫体移至70℃的热清水中清洗去杂，直至虫体透明。
33.（3）样品漂洗：将除杂后的样本移入装有70%乙醇溶液的凹面皿中脱水5min；轻轻挤压虫体，进一步去除碱液及其溶解的内含物。所述70%乙醇溶液中添加冰醋酸，所述冰醋酸的添加量与70%乙醇溶液的体积比为1:5-9。
34.（4）样品染色：将粉蚧样品放入装有98%的酸性品红的ep管，放置到实施例1的恒温震荡仪中，保持55摄氏度，同时加施震荡，保持1h以上。
35.（5）样品清洗：将染色的样本移入装有70%乙醇溶液的凹面皿去除浮色；更换乙醇溶液清洗1-2次。更换清洗用的乙醇溶液浓度为80%-95%，越往后，使用的乙醇溶液的浓度越高。
36.（6）样品固色：将步骤（5）处理过的样本移入装有丁香油的容器中浸泡透明10min并固定颜色，再将样本移入70%乙醇溶液中清理丁香油和其他杂质。
37.（7）样品清理：在霍氏封片液浸泡10min以上，再次清理虫体内外杂物。
38.（8）样品封盖：取载玻片滴入适量霍氏封片液，将样本移入霍氏封片液并整姿，盖上玻片封片，即可镜检。在玻片一侧贴上采集标签和鉴定标签，玻片封片后置于室内自然晾干或在40-50℃烘箱里烘干脱水3周后放入标本盒中保存备查。
39.采用本方法制备新菠萝灰粉蚧玻片，并放置显微镜中进行观察，结果如图2所示，其染色效果与传统方法（染色8小时）获得的玻片的染色效果接近，而染色时间由8小时缩短至1小时，大大缩短了玻片制作的时间，有效提高果蔬的通关效率。
40.对比实施例1本实施例采用传统的粉蚧玻片的制作方法(染色时间需8小时),步骤如下:（1）样品固定：挑取样品上的粉蚧置入70%乙醇中杀死固定2h,以备制作玻片标本。
41.（2）样品净化：通常把已经在70%乙醇中固定的虫体用解剖针在虫体背面刺小洞,或用解剖刀在虫体中腹背交界处划开一条开口。然后将标本移入加有10%氢氧化钾或10%氢
氧化钠溶液的小烧杯或其他小型容器中,置于水浴锅中加热,以不沸腾为度,定时观察,直至体外蜡质和虫体内含物全部融化,彻底清除内含物,虫体变为清洁透明,以便看清虫体表面的细微结构,净化时间以标本透明为准。
42.（3）样品漂洗：经氢氧化钾或氢氧化钠处理过的标本,应用清水漂洗。将经碱液净化处理的标本转移到酸性乙醇中,漂洗中和10min。
43.（4）样品染色：染色时以浅的器皿如表面皿或凹玻片等为好,可看得清楚,便于操作。将标本转移到酸性品红中染色,染色时间视标本着色情况而定,一般在8h以上。
44.（5）样品清洗：用70%乙醇洗掉多余染色剂,再依次经过95%乙醇、100%乙醇脱水各5min。
45.（6）样品固色：移入二甲苯酚(二甲苯∶苯酚为3∶1)内5min~10min,进一步透明;移入二甲苯中1min~3min使颜色固定;移入丁香油中10min~30min或更长时间。
46.（8）样品封盖：将标本转移到载玻片上,丁香油未干时立刻整理姿式,然后加一滴中性树胶,整姿后用盖玻片封片。
47.采用本方法制作新菠萝灰粉蚧玻片，且分为两小组，1组染色时间1小时，另一组染色时间为8小时。将玻片放到显微镜观察。由图3可见，染色1小时的玻片并不能清晰地观察到粉蚧的形态特征，从而无法做进一步鉴定，染色8小时才能清晰的观察到粉蚧的形态特征。
48.对比实施例2本实施例与实施例2的方法相似，其区别在于：步骤（4）中，粉蚧样品放入装有90%的酸性品红的进行常温震荡染色1小时。
49.将玻片放到显微镜观察。由图5可见，粉蚧的内部结构虽然比传统方法染色1小时的玻片清晰，但是远达不到玻片鉴定的要求。说明酸性品红的浓度、染色温度等都玻片的染色和鉴定有重要影响。
50.对比实施例3本实施例与实施例2的方法相似，其区别在于：步骤（4）中，粉蚧样品放入装有95%的酸性品红的进行50摄氏度恒温水浴染色5小时。
51.将玻片放到显微镜观察。由图6可见，采用95%的酸性品红恒温染色后的粉蚧的形态特性明显比传统方法染色1小时的玻片清晰，但是还达不到玻片鉴定的要求。
52.结合图2可见，采用本发明方法制备的粉蚧玻片标本图案清晰，颜色鲜明，虫体完整；与对比实施例1常规方法制作的效果类似。而对比实施例2和对比实施例3使用较低浓度的酸性品红或者温度调整或者不进行恒温震荡加热染色的相比，在相同时间内，本实施例2的玻片标本图案更清晰，更能满足检测需求。
53.综上所述，本发明采用高浓度酸性品红进行粉蚧样品的染色介质，将粉蚧样品放到装有98%的酸性品红的ep管，并放到恒温震荡仪中进行恒温震荡染色，1个小时即可完成染色，与改进前的，粉蚧样品放到凹面皿中静置8-12小时染色小臂，大大缩短了染色效率，缩短了样品的鉴定时间，缩短果蔬的通关效率，实现了粉蚧鉴定时间从原来当天送样第二天出具结果报告，变成现在的早上送样，当天下午出鉴定结果的快速检测，减少的了进境果蔬的通关成本，提高果蔬的通关效率。
54.前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非像将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。