基于褐菖鲉评估有对照站位石油类生物毒性效应的方法与流程

1.本发明涉及海洋石油类污染评估技术领域，具体涉及基于褐菖鲉评估有对照站位石油类生物毒性效应的方法。


背景技术：

2.石油类不仅是全球也是我国海洋环境最主要的污染物之一。其主要来源于工业排放，船舶运输、海上石油开采和溢油事故等。近年来，我国海洋污染快速蔓延的势头虽然得到了一定程度的减缓，但局部海域石油类污染仍较严重。可以预见，随着我国工农业生产的高速发展、城市化进程加快，海上运输和捕捞业持续发展，海洋石油勘探和开发突飞猛进，溢油事故时有发生，石油类仍将是我国近海海域数量大、危害严重的主要污染物之一。
3.海洋鱼类作为海洋生态系统的高级营养级，对环境污染的响应具有不可替代的作用，因此基于鱼类对环境污染物进行生物监测能更直观反应环境污染状况。褐菖鲉广泛分布于西太平洋沿岸海域，包括日本、朝鲜，我国、越南和菲律宾，在我国的的渤海、黄海、东海和南海均有分布，是一种暖温性近海底层鱼类，栖息于水质清澈的近岸岩礁附近，卵胎生，每年的2～5月份为繁殖季节。褐菖鲉抗病能力强、取材方便且在室内易于驯化，也是一种十分适合于开展野外监测的鱼类。因此，褐菖鲉是开展海洋石油类生物毒性效应评估的理想海洋鱼类。
4.erod(7-乙氧基异吩噁唑-o-脱乙基酶)和胆汁荧光芳烃组分因其特异性较强、效应快、灵敏度高已经成为海洋石油类及多环芳烃生物监测中的重要指标，得到许多国际组织的认可，开展了越来越多的研究和应用。
5.目前，对于有对照站位的海洋石油类生物毒性效应评估，大多是通过分子生物标志物的响应差异来评估毒性效应的大小。综合生物标志物响应指数法(ibr)是由beliaeff和burgeot (beliaeff b,burgeot t.integrated biomarker response：a useful tool for ecological risk assessment. environmental toxicology and chemistry,2002,21(6)：1316-1322)建立的一种基于多种生物标志物反应的生态环境健康状况综合评价的方法。该方法利用星状图表示每个站位上各种生物标志物测定结果的赋值，通过计算星状图面积得到某个站位的ibr值，具有可视化优点，能够很好地区分不同站位的污染水平。然而，这个方法还存在某些不足，比如星状图中由于标志物排序不同会造成ibr计算偏差；此外，考虑到多种生物标志物在不同污染条件下可能会出现诱导或抑制作用，这在第一代ibr的星状图中无法体现出来。基于以上的问题，sanchez 等(sanchez,w.,burgeot,t.,porcher,j.m.a novel“integrated biomarker response”calculationbased on reference deviation concept.environ.sci.pollut.res.2013,20(5),2721
–
2725)引入了“对照偏离”的概念，对第一代ibr方法进行了改进，克服了不足，因此该方法称之为第二代综合生物标志物响应指数法(ibrv2)。ibrv2应用的前提条件是需要选择清洁站位作为对照， ibrv2不仅适用于大尺度的生物监测项目，更适用于河流排污口上下游等有明确对照站位的污染程度分析比较。该方法最近已经开始用于海湾石油类污染生物效应评价，但是
仅通过比较ibrv2值的大小来定性评估石油类污染生物效应状况，尚未有基于ibrv2定量评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应的评估方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于褐菖鲉评估有对照站位石油类生物毒性效应的方法，以解决上述背景技术中提出的未有基于ibrv2定量评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于褐菖鲉评估有对照站位石油类生物毒性效应的方法，该方法包括以下步骤：
8.1)采用海区原位监测实验，设置若干个石油类污染监测站位和一个清洁的对照站位；
9.2)将体长、体重基本一致的健康褐菖鲉置于套有尼龙网的塑料筐中，用绳子悬挂于不同监测站位的标记物上，没入海平面以下至少1m；
10.3)监测实验持续14天，并在最后一天观察褐菖鲉存活情况，取存活褐菖鲉的肝、胆、性腺组织进行生理生化检测；
11.4)根据个体、组织指标和分子生物标志物响应情况，将海洋石油类生物毒性效应分为五级；若某一监测站位出现褐菖鲉非外伤死亡且存活褐菖鲉中出现组织或分子水平的指标响应的，评为五级；若某一监测站位出现褐菖鲉组织水平的指标响应但未有死亡的，评为四级；若某一监测站位褐菖鲉未有个体或组织水平的指标响应而仅有分子生物标志物响应的，评级区间为一至三级，其中一至三级基于各分子生物标志物的分级系数和ibrv2进行划分；所述ibrv2值的算法为：(1)首先将各站位分子生物标志物平均值x，对照站位的生物标志物值x0按式(1)进行标准化处理：y＝log(x/x0)(1)，式(1)中y为各站位该分子生物标志物的标准化值；(2)计算y在所有站位的平均值m和标准差s。该分子生物标志物在各站位的均一化值为z＝(y-m)/s；(3)定义分子生物标志物偏离指数a，即用某站位分子生物标志物均一化值(z)减去对照站位均一化值(z0)，a＝z-z0。(4)分别将各站位a的绝对值|a|加和得到该站位的ibrv2值。
14.作为优选方案，所述的海区原位监测实验，应设置若干个有针对性的石油类污染监测站位，污染监测站位数应不少于3个；同时设置一个已知的相对无污染的清洁站位作为对照站位。
15.作为优选方案，所述健康的褐菖鲉为发育正常，体态良好，未处于繁殖期并在室内养殖池暂养10天以上的褐菖鲉。作为优选方案，每个站点的褐菖鲉为8-15尾。
16.作为优选方案，所述生理生化检测包括肝体比(hepatosomatic index，hsi)、性体比 (gonadosomatic index，gsi)、肝7-乙氧基异吩恶唑-o-脱乙基酶 (7-ethoxyresorufin-o-deethylase,erod)活性、胆汁萘类代谢物含量、胆汁菲类代谢物含量、胆汁芘类代谢物含量、胆汁苯并[a]芘类代谢物含量。
[0017]
作为优选方案，所述生物毒性效应分为五级具体包括：第一级，为无风险等级，意味着生物体未受到石油类的污染；第二级，为低风险等级，意味着生物体在分子水平对石油
类污染的响应程度轻微；第三级，为中风险等级，意味着生物体在分子水平对石油类污染的响应程度加剧，但尚未引起生物体组织水平的响应；第四级，为高风险等级，意味着生物体在组织水平出现了对石油类污染的响应，但尚未引起生物死亡；第五级，为极高风险等级，意味着生物体在个体水平出现了对石油类污染的响应，开始死亡。
[0018]
组织水平的响应的指标包括肝体比和性体比，与对照组相比没有显著性差异，则判定为没有发生组织水平上的响应。
[0019]
作为优选方案，所述一至三级的分级阈值的算法为：(1)定义各分子生物标志物的分级系数：所述5种分子生物标志物(肝erod活性、胆汁萘类代谢物含量、胆汁菲类代谢物含量、胆汁芘类代谢物含量、胆汁苯并[a]芘类代谢物含量)的一级分级系数均为1.2，二级分级系数均为2.0；(2)根据上述的ibrv2值的算法将各分子生物标志物的分级系数进行标准化、均一化和绝对值加和计算后，得到一级分级阈值为2.54，二级分级阈值为9.65。
[0020]
作为优选方案，综合各监测站位褐菖鲉的个体和组织水平指标响应情况、基于分子生物标志物值计算的ibrv2，评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应风险等级的方法为：若某一监测站位出现褐菖鲉非外伤死亡且存活褐菖鲉中出现组织或分子水平的指标响应的，评为五级；若某一监测站位出现褐菖鲉组织水平的指标响应但未有死亡的，评为四级；若某一监测站位褐菖鲉未有个体或组织水平的指标响应而仅有分子生物标志物响应的，评级区间为一至三级，通过比较各监测站位ibrv2值与分级阈值的大小进行划分，具体为：当监测站位ibrv2值小于一级分级阈值2.54时，该监测站位海洋石油类生物毒性效应风险等级为一级；当监测站位ibrv2值大于等于一级分级阈值2.54且小于二级分级阈值9.65时，该监测站位海洋石油类生物毒性效应风险等级为二级；当监测站位ibrv2值大于等于二级分级阈值9.65 时，该监测站位海洋石油类生物毒性效应风险等级为三级。
[0021]
本发明与现有技术相比，有益效果是：
[0022]
本发明以褐菖鲉为监测生物进行有对照站位的海区石油类污染生物效应原位监测，与现有的以褐菖鲉为监测生物进行海区石油类污染生物效应评估方法相比，现有的方法仅在分子水平比较ibrv2值的大小来定性而不是定量来评估石油类污染生物效应状况，而本发明不仅在分子水平，还在组织水平以及个体水平进行了综合分析，通过个体、组织指标和分子生物标志物的响应情况并定量，能够更准确、科学地定量评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应，能够作为监测、评价和预警石油类污染对海洋生物和生态系统安全问题的一个重要工具。
附图说明
[0023]
图1是本发明实施例的不同站位褐菖鲉肝erod活性响应示意图；
[0024]
图2是本发明实施例的不同站位褐菖鲉胆汁荧光芳烃组分响应示意图；
[0025]
图3是本发明实施例的不同监测站位褐菖鲉ibrv2结果示意图。
具体实施方式
[0026]
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
[0027]
本发明实施例的基于褐菖鲉评估有对照站位石油类生物毒性效应的方法，2017年4月在广西茅尾海进行，茅尾海位于广西钦州湾顶部，是个半封闭的内湾，海域面积大约
135km2，平均水深小于10m。近年来，随着石油炼化等重工业在钦州沿海地区的聚集，茅尾海日益受到石油类污染的威胁，多环芳烃、多氯联苯等污染物近年来多有检出。方法包括以下步骤：
[0028]
步骤1：采用海区原位监测实验，设置若干个石油类污染监测站位和一个清洁的对照站位；本实施例中，在港口区设置了4个监测站位，在大蚝养殖区靠近航道的一侧设置了5 个监测站位，在大蚝养殖区远离港口区和航道的边缘地带设置了1个对照站位。
[0029]
步骤2：将体长、体重基本一致的健康褐菖鲉置于套有尼龙网的塑料筐中，用绳子悬挂于不同监测站位的标记物上，没入海平面以下1m；
[0030]
步骤3：监测实验持续14天，并在最后一天观察褐菖鲉存活情况，取存活褐菖鲉的肝、胆、性腺组织进行生理生化检测；
[0031]
步骤4：根据个体、组织指标和分子生物标志物响应情况，将海洋石油类生物毒性效应分为五级；
[0032]
步骤5：基于各分子生物标志物的分级系数和ibrv2，得出一至三级的分级阈值；
[0033]
步骤6：综合各监测站位褐菖鲉的个体和组织水平指标响应情况、基于分子生物标志物值计算的ibrv2，评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应风险等级。
[0035]
步骤2具体包括：从养殖场挑选发育正常，体态良好，未处于繁殖期的体长、体重基本一致的健康褐菖鲉，在室内养殖池暂养10天后开展海区原位监测实验；
[0036]
室内养殖池为深1.5m，蓄水量3t的椭圆形水泥养殖池。褐菖鲉在养殖池清洁砂滤海水中暂养，用充气机连续充气，每天投喂鱼体重1％的人工饵料，每天更换一半新鲜海水。暂养期间水温20
±
1℃，盐度30
±
1，ph8.0
±
0.1，自然光照周期。
[0037]
暂养10天后挑选体长、体重基本一致的健康褐菖鲉进行海区原位监测实验。挑选的褐菖鲉体长12.09
±
0.10cm，体重24.59
±
0.65g。
[0038]
在每个监测站位，随机将10尾褐菖鲉置于套有尼龙网的塑料筐中，用绳子悬挂于不同监测站位的标记物上，并没入海平面以下1m，记录其经纬度。
[0039]
步骤3具体包括：海区原位监测实验持续14天，在最后一天观察并记录各站位褐菖鲉的存活情况，取存活褐菖鲉的肝、胆、性腺组织进行hsi、gsi、肝erod活性、胆汁萘类代谢物含量、胆汁菲类代谢物含量、胆汁芘类代谢物含量和胆汁苯并[a]芘类代谢物含量检测；
[0040]
褐菖鲉用110mg/ml ms-222麻醉后，吸水纸吸干体表水分，解剖，分别称量体重、肝重和性腺重，将肝脏和胆置于-80℃冰箱保存。
[0041]
hsi测定方法：hsi＝肝重/体重
×
100。
[0042]
gsi测定方法：gsi＝性腺重/体重
×
100。
[0043]
肝erod活性测定方法：将鱼肝置于玻璃匀浆器中，加5倍体积预冷的匀浆缓冲液 (0.1mol/l na2hpo
4-nah2po4，0.15mol/l kcl，ph7.4)，冰浴下匀浆。4℃下10 000g离心 15min，弃去上层脂肪和下层沉淀，取中间层液体于4℃下10 000g离心15min，取上清液进行erod活性测定。在10ml玻璃试管中加入1790μl磷酸盐缓冲液(0.1mol/l na2hpo
4-nah2po4，ph7.6)，100μl 7-乙氧基异吩恶唑溶液(10μm)，100μl样品酶液；对照管加入1890μl磷酸盐缓冲液(0.1mol/l na2hpo
4-nah2po4，ph7.6)，100μl7-乙氧基异吩恶唑溶液(10μm)，不加样品酶液；振荡混匀后加入10μl还原型辅酶ⅱ溶液(60nmol/ml)，立即混匀，准确反应3分钟后加1ml无水甲醇终止反应；3 000g离心6min；取上清液，以535nm为激发波长，585nm为发射波
长，测定荧光强度值。在10ml玻璃试管中加入5ml 考马斯亮蓝显色液；加入100μl样品酶液，混匀后测定595nm处的吸光值。各站位的结果见图1。
[0044]
胆汁萘类代谢物含量测定方法：吸取2μl鱼类胆汁样品，用50％乙醇溶液稀释至2ml，混匀，以290nm为激发波长，335nm为发射波长，测定荧光强度值。
[0045]
胆汁菲类代谢物含量测定方法：吸取2μl鱼类胆汁样品，用50％乙醇溶液稀释至2ml，混匀，以256nm为激发波长，380nm为发射波长，测定荧光强度值。
[0046]
胆汁芘类代谢物含量测定方法：吸取2μl鱼类胆汁样品，用50％乙醇溶液稀释至2ml，混匀，以341nm为激发波长，383nm为发射波长，测定荧光强度值。
[0047]
胆汁苯并[a]芘类代谢物含量测定方法：吸取2μl鱼类胆汁样品，用50％乙醇溶液稀释至2ml，混匀，以380nm为激发波长，430nm为发射波长，测定荧光强度值。各站位的结果见图2。
[0048]
步骤4具体包括：根据个体、组织指标和分子生物标志物响应情况，将海洋石油类生物毒性效应分为五级：第一级，为无风险等级，意味着生物体未受到石油类的污染；第二级，为低风险等级，意味着生物体在分子水平对石油类污染的响应程度轻微；第三级，为中风险等级，意味着生物体在分子水平对石油类污染的响应程度加剧，但尚未引起生物体组织水平的响应；第四级，为高风险等级，意味着生物体在组织水平出现了对石油类污染的响应，但尚未引起生物死亡；第五级，为极高风险等级，意味着生物体在个体水平出现了对石油类污染的响应，开始死亡。
[0049]
ibrv2值的算法为：(1)首先将各站位分子生物标志物平均值x，对照站位的生物标志物值x0按式(1)进行标准化处理：y＝log(x/x0)(1)，式(1)中y为各站位该分子生物标志物的标准化值。(2)计算y在所有站位的平均值m和标准差s。该分子生物标志物在各站位的均一化值为z＝(y-m)/s。(3)定义分子生物标志物偏离指数a，即用某站位分子生物标志物均一化值(z)减去对照站位均一化值(z0)，a＝z-z0。(4)分别将各站位a的绝对值|a|加和得到该站位的ibrv2值。
[0050]
一至三级的分级阈值的算法为：(1)定义各分子生物标志物的分级系数：所述5种分子生物标志物(肝erod活性、胆汁萘类代谢物含量、胆汁菲类代谢物含量、胆汁芘类代谢物含量、胆汁苯并[a]芘类代谢物含量)的一级分级系数均为1.2，二级分级系数均为2.0；(2) 根据上述的ibrv2值的算法将各分子生物标志物的分级系数进行标准化、均一化和绝对值加和计算后，得到一级分级阈值为2.54，二级分级阈值为9.65。
[0051]
步骤6具体包括：综合各监测站位褐菖鲉的个体和组织水平指标响应情况、基于分子生物标志物值计算的ibrv2，评估有对照站位的海洋石油类生物毒性效应风险等级：在各监测站位中，均未出现褐菖鲉死亡的情况，hsi和gsi均与对照组无显著性差异，而仅有分子生物标志物的响应，因此评级区间为一至三级。通过比较各监测站位ibrv2值与分级阈值的大小，评估出各监测站位海洋石油类生物毒性效应风险等级为：站位s1，三级；站位s2-s9，二级。具体见图3。
[0052]
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。