一种水稻芽期耐寒性评价方法与流程

1.本发明涉及农业技术领域，特别涉及水稻芽期耐寒性评价方法。


背景技术：

2.水稻是主要的粮食作物，全世界一半以上的人口以水稻为主食。冷害是导致水稻产量下降的主要因素。全球大约1500万公顷的土地容易遭受冷害，日本、韩国、中国的东北和西南地区尤为严重。水稻直播有利于机械化操作，具有省工、省力、高效等优势，随着劳动力大量涌入城市，直播越来越受到农民的青睐。芽期是水稻生长发育过程中最脆弱的时期，直播的水稻种子遭受冷害会大大降低发芽率，导致不正常幼苗的形成，甚至引起种子死亡，最终造成严重减产。因此，提高水稻芽期耐寒性是水稻育种的一个重要目标，芽期耐寒性强的水稻品种将有利于粮食生产，促进粮食安全和持续发展。
3.熊英等采用隶属函数法对36份水稻材料的耐低温淹水性进行了评价，筛选出了5份耐低温淹水能力突出的水稻种质。张晓丽等采用主成分分析法对水稻直播性状指标进行分析，筛选出桂育9号等8个耐低温低氧的优良水稻品种。国内外学者虽然在水稻芽期耐寒性鉴定方面开展了一定量的工作，但多采用主成分分析或隶属函数分析等单一的统计学方法进行鉴定评价，仅根据一种统计学方法得出的耐寒等级鉴定结果缺乏准确性和全面性，且各种方法的结果之间可能存在不一致或者具有一定相关性。目前尚未有利用多元统计方法综合评价水稻芽期耐寒性的报道。


技术实现要素：

4.本发明旨在采用多元统计分析对水稻种质资源进行芽期耐寒性综合评价，进一步筛选出合理的表型评价指标，为水稻种质资源的评价和耐寒性优异的水稻新品种选育提供参考。
5.第一方面，本发明要求保护一种鉴定水稻芽期耐寒性的方法。
6.本发明所要求保护的鉴定水稻芽期耐寒性的方法，可包括如下步骤：
7.(a1)以发芽率(germination rate,gr)、发芽势(germination potential,gp)，发芽指数(germination index,gi)、种子萌发指数(promptness index,pi)、平均发芽时间(mean germination time,mgt)、萌发系数(germination coefficient,gc)以及成苗率(seedling rate,sr)这7个指标作为芽期耐寒性的评价指标，分别对若干个供试水稻品种进行(如5-15℃)低温处理，检测所述7个指标。
8.在本发明的具体实施方式中，具体是5℃条件下统计成苗率，15℃条件下统计发芽率等其他6个指标。
9.(a2)对(a1)测得的各品种水稻的所述7个指标进行主成分分析。
10.(a3)针对(a2)所得的各主成分值，按照如下公式计算隶属函数值u(x
j,i
)和权重wj。
11.u(x
j,i
)＝(x
j,i-x
j,min
)/(x
j,max-x
j,min
)；j＝1，2，
…
，n；n为大于等于2的正整数。
12.其中，u(x
j,i
)表示第i个品种第j个主成分的隶属函数值；x
j,i
表示第i个品种第j个主成分的主成分值，x
j,max
和x
j,min
分别表示第j个主成分在所有供试水稻品种中的主成分值的最大值和最小值。
13.n为大于等于2的正整数。
14.其中，wj表示第j个主成分在所有主成分中的重要程度，即权重；pj代表经主成分分析所得第j个主成分的贡献率。
15.主成分值x
j,i
、x
j,max
和x
j,min
，以及主成分的贡献率pj通过进行所述主成分分析获得。
16.(a4)根据(a3)中求得的隶属函数值u(x
j,i
)和权重wj，按照如下公式分别计算每个品种水稻的综合耐寒指数d值，d值越大表示芽期耐寒性越强。
17.n为大于等于2的正整数。
18.进一步地，步骤(a1)中，对所述7个指标进行检测可按照如下公式进行计算：
19.发芽率(％)＝(发芽的种子数/种子总数)
×
100；
20.发芽势(％)＝(前4天发芽的种子数/种子总数)
×
100；
21.发芽指数＝∑(gt/dt)；其中，gt为第t天的发芽数；dt为发芽实验的第t天；
22.种子萌发指数＝1.00
×
nd2 0.75
×
nd4 0.50
×
nd6 0.25
×
nd8；其中，nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2d、第4d、第6d、第8d的发芽率；
23.平均发芽时间＝(g1t1 g2t2
……
gntn)/(g1 g2
……
gn)；其中，tn为发芽日数，gn是与tn相对应的每天发芽种子数；
24.萌发系数＝发芽率/平均发芽时间；
25.成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)
×
100。
26.进一步地，步骤(a2)中，对各品种水稻的所述7个指标进行主成分分析时，可按照特征值大于1，累积贡献率≥80％的主成分提取标准进行。相应的，会得到2个主成分，对应特征向量分别为：
27.ci1＝0.429pi 0.426gc 0.418gr-0.418mgt 0.415gi 0.336gp-0.008sr；
28.ci2＝0.001pi-0.033gc 0.043gr 0.055mgt 0.076gi-0.014gp 0.994sr；
29.其中，ci1表示第一主成分值；ci2表示第二主成分值；pi表示种子萌发指数；gc表示萌发系数；gr表示发芽率；mgt表示平均发芽时间；gi表示发芽指数；gp表示发芽势；sr表示成苗率。
30.第二方面，本发明要求保护第一方面所述方法在如下任一中的应用：
31.p1、从若干水稻品种中筛选芽期耐寒性相对较强的品种；
32.p2、比较不同水稻品种芽期耐寒性强弱。
33.第三方面，本发明要求保护一种鉴定水稻芽期耐寒性的方法。
34.本发明要求保护的鉴定水稻芽期耐寒性的方法，可包括如下步骤：
35.(b1)对待测水稻进行低温(如5-15℃)处理，统计发芽指数、成苗率、平均发芽时间、种子萌发指数、发芽率和发芽势。
36.在本发明的具体实施方式中，具体是5℃条件下统计成苗率，15℃条件下统计发芽
率等其他5个指标。
37.(b2)按照如下公式计算所述待测水稻的综合耐寒指数d’值，d’值越大表示芽期耐寒性越强。
38.d’值＝0.592 0.090gi 0.123sr-0.075mgt 0.086pi 0.099gr 0.054gp；
39.其中，gi表示发芽指数；sr表示成苗率；mgt表示平均发芽时间；pi表示种子萌发指数；gr表示发芽率；gp表示发芽势。
40.进一步地，上述各指标的计算公式如下：
41.发芽指数＝∑(gt/dt)；其中，gt为第t天的发芽数；dt为发芽实验的第t天；
42.成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)
×
100；
43.平均发芽时间＝(g1t1 g2t2
……
gntn)/(g1 g2
……
gn)；其中，tn为发芽日数，gn是与tn相对应的每天发芽种子数；
44.种子萌发指数＝1.00
×
nd2 0.75
×
nd4 0.50
×
nd6 0.25
×
nd8；其中，nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2d、第4d、第6d、第8d的发芽率；
45.发芽率(％)＝(发芽的种子数/种子总数)
×
100；
46.发芽势(％)＝(前4天发芽的种子数/种子总数)
×
100。
47.第四方面，本发明要求保护第三方面所述的方法在如下任一中的应用：
48.p1、从若干水稻品种中筛选芽期耐寒性相对较强的品种；
49.p2、比较不同水稻品种芽期耐寒性强弱。
50.第五方面，本发明要求保护发芽率、发芽势，发芽指数、种子萌发指数、平均发芽时间、萌发系数和成苗率作为评价指标在鉴定水稻芽期耐寒性中的应用。
51.第六方面，本发明要求保护发芽指数、成苗率、平均发芽时间、种子萌发指数、发芽率和发芽势作为评价指标在鉴定水稻芽期耐寒性中的应用。
52.第七方面，本发明要求保护一种对水稻种质资源按照芽期耐寒性进行类群划分的方法。
53.本发明所要求保护的对水稻种质资源按照芽期耐寒性进行类群划分的方法，可包括如下步骤：
54.(c1)采用第一方面所述方法对待进行类群划分的所有水稻品种进行耐寒性鉴定，从而获得所有水稻品种的综合耐寒指数d值；或
55.采用第二方面所述方法对待进行类群划分的所有水稻品种进行耐寒性鉴定，从而获得所有水稻品种的综合耐寒指数d’值；
56.(c2)根据(c1)所得的综合耐寒指数d值或综合耐寒指数d’值，进行聚类分析，从而将所有水稻品种划分为不同类群。
57.进一步地，步骤(c2)中可采用欧氏距离和组间联接法进行聚类分析。
58.在本发明的具体实施方式中，测定发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发指数、平均发芽时间和萌发系数时，打破休眠的种子在15℃低温处理10天。测定成苗率时，发芽后的种子在5℃低温处理10天。
59.在本发明的具体实施方式中，所述水稻品种如表1所示。
60.本发明以18个水稻品种为实验材料，15℃和5℃低温处理后统计发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发指数、平均发芽时间、萌发系数和成苗率。运用主成分分析、聚类分析和
逐步回归分析等方法对水稻种质资源的芽期耐寒性进行综合评价和鉴定指标的筛选。结果显示：发芽率与发芽势、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数均呈极显著正相关，平均发芽时间与发芽率、发芽势、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数均呈极显著负相关，除成苗率外各指标间的相关性均达到极显著水平。通过主成分分析法将芽期耐寒性鉴定的7个单项指标转换为2个独立指标；通过隶属函数及权重计算，得到水稻芽期耐寒性综合评价值d值，利用d值进行聚类分析，将18个水稻品种的芽期耐寒性分为5个等级，其中耐寒性极强的有2个品种，耐寒性强的有5个，耐寒性中等的有7个，耐寒性弱的有1个，耐寒性极弱的有3个。采用逐步回归分析法得到水稻芽期耐寒性的最优回归方程：d＝0.592 0.090gi 0.123sr-0.075mgt 0.086pi 0.099gr 0.054gp，筛选出发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发指数、平均发芽时间和成苗率6个对水稻芽期耐寒性具有显著影响的指标。本发明试验结果表明，低温胁迫条件下，可通过测定发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发系数、平均发芽时间和成苗率6个指标，对水稻品种耐寒性强弱进行快速准确鉴定和评价。本发明对于水稻种质资源的评价和耐寒性优异的水稻新品种选育具有重要意义。
附图说明
61.图1为基于7个芽期耐寒指标的18份水稻种质资源聚类分析结果。
具体实施方式
62.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
63.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
64.实施例1、利用多元统计方法综合评价水稻芽期耐寒性
65.一、材料与方法
66.1、实验材料
67.本实施例共选用18份水稻种质资源，来源于日本和中国9个不同省份，种质具体信息详见表1。
68.表1 18份水稻种质资源名称及来源
[0069][0070]
2、实验方法
[0071]
种子置于50℃烘箱中72h打破休眠后，70％乙醇进行表面消毒，并用无菌水洗涤三次。
[0072]
每个品种选择40粒种子放置于铺有双层滤纸的9cm培养皿中，加入适量蒸馏水后，气候培养箱15℃(16h光照/8h黑暗)处理10天。种子露白记为发芽，统计每天发芽种子个数用于发芽耐寒指标的计算。每个品种重复3次。
[0073]
成苗率实验是先将水稻种子放置于28℃黑暗条件下浸种48h后，放入30℃培养箱黑暗条件下催芽24h。选择40粒芽长约5mm的水稻种子，转移到培养皿中。5℃气候培养箱(16h光照/8h黑暗)处理10天后，放于培养室(28℃，16h光照/8h黑暗)恢复生长7天。7天后，统计成苗数。每个品种重复3次。
[0074]
3、测定指标
[0075]
以发芽率(germination rate,gr)、发芽势(germination potential,gp)，发芽指数(germination index,gi)，种子萌发指数(promptness index,pi)，平均发芽时间(mean germination time,mgt)、萌发系数(germination coefficient,gc)以及成苗率(seedling rate,sr)作为芽期耐寒性的评价指标，对不同品种水稻的芽期耐寒性进行评价。各指标的计算公式为：
[0076]
发芽率(％)＝(发芽的种子数/种子总数)
×
100(1)
[0077]
发芽势(％)＝(前4天发芽的种子数/种子总数)
×
100(2)
[0078]
发芽指数＝∑(gt/dt)(3)，公式中，gt为第t天的发芽数；dt为发芽实验的第t天。
[0079]
种子萌发指数＝1.00
×
nd2 0.75
×
nd4 0.50
×
nd6 0.25
×
nd8ꢀꢀꢀ
(4)
[0080]
公式中，nd2、nd4、nd6、nd8分别为第2d、第4d、第6d、第8d的发芽率。
[0081]
平均发芽时间＝(g1t1 g2t2
……
gntn)/(g1 g2
……
gn)(5)，公式中tn为发芽日数，gn是与tn相对应的每天发芽种子数。
[0082]
萌发系数＝发芽率/平均发芽时间(6)
[0083]
成苗率(％)＝(成活苗数/出芽总粒数)
×
100
ꢀꢀꢀ
(7)
[0084]
4、数据处理与统计分析
[0085]
(1)评价指标
[0086]
①
各综合指标的隶属函数值
[0087]
u(x
j,i
)＝(x
j,i-x
j,min
)/(x
j,max-x
j,min
)(8)j＝1，2，
…
，n；n为大于等于2的正整数。
[0088]
公式中，n为大于等于2的正整数；x
j,i
表示第i个品种第j个主成分的主成分值；x
j,max
和x
j,min
分别表示第j个主成分在所有供试水稻品种中的主成分值的最大值和最小值。
[0089]
②
各综合指标的权重
[0090]
n为大于等于2的正整数。
[0091]
公式中，wj表示第j个主成分在所有主成分中的重要程度，即权重；pj代表经主成分分析所得第j个主成分的贡献率。
[0092]
③
水稻种质资源综合耐寒能力
[0093]
n为大于等于2的正整数。
[0094]
公式中，d值为第i个水稻品种在低温条件下由综合指标评价所得的耐寒综合评价。
[0095]
(2)数据统计分析
[0096]
利用excel 2016软件进行数据统计与整理，利用spss 26.0数据分析软件进行相关性分析、主成分分析、聚类分析和回归分析。
[0097]
二、结果
[0098]
1、各指标之间的相关性分析
[0099]
对芽期各个单项指标进行相关性分析。由表2可以看出，7个性状间存在不同程度的相关性。发芽率与发芽势、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数均呈极显著正相关，其中发芽率与萌发系数的相关系数最大，为0.985；平均发芽时间与发芽率、发芽势、种子萌发指数、发芽指数和萌发系数均呈极显著负相关，其中平均发芽时间与萌发系数的相关系数最大，为-0.953；成苗率与其他指标间的相关性均未达到显著水平。相关性分析结果表明大部分单项指标间都呈极显著相关性。
[0100]
表2水稻芽期各单项指标的相关系数矩阵
[0101][0102]
注：**表示极显著相关(p≤0.01)。
[0103]
2、主成分分析
[0104]
利用spss26.0软件对18份水稻品种的7个指标进行主成分分析，参数设定默认值。按照特征值大于1，累积贡献率≥80％的主成分提取标准，如表3，共提取到两个主成分，两个主成分的特征值分别为5.303和1.010，均大于1。两个主成分贡献率分别为75.752％和14.428％，累积贡献率90.179％，能够对大多数指标进行足够的概括，因此，将原来的7个指标转化为2个新的独立的综合指标，分别定义为第1主成分、第2主成分，用于水稻种质资源的表型指标评价。第1主成分解释了7个性状75.752％的变化，特征向量绝对值最大的是种子萌发系数(0.429)；第2主成分解释了7个性状14.428％的变化，特征向量绝对值最大的是成苗率(0.994)。由表3可知其各综合指标的对应特征向量为：
[0105]
ci1＝0.429pi 0.426gc 0.418gr-0.418mgt 0.415gi 0.336gp-0.008sr。
[0106]
ci2＝0.001pi-0.033gc 0.043gr 0.055mgt 0.076gi-0.014gp 0.994sr。
[0107]
其中，ci1为第1主成分值；ci2为第2主成分值。
[0108]
表3主成分贡献率及特征向量
[0109][0110]
3、品种综合评价
[0111]
(1)隶属函数
[0112]
根据公式(8)计算每个品种水稻各综合指标的隶属函数值(表4)。对于同一综合指标如主成分1而言，低温胁迫处理下，特籼占13的隶属值最大，其值为1.00，表明此种质在主成分1方面表现为耐寒性最强，而珍珠矮的隶属值最小，其值为0.00，表明该种质在这一综合指标上表现为耐寒性最差。
[0113]
(2)权重确定
[0114]
根据芽期各综合指标贡献率的大小，利用公式(9)求出芽期2个综合指标的权重(表3)，分别为0.84和0.16。
[0115]
(3)综合评价
[0116]
根据各综合指标的隶属值和权重，得出18种水稻在低温条件下的耐寒性综合评价值d值(表4)，并依此进行芽期耐寒性的排名。综合评价值d值的大小反应了各水稻品种芽期
耐寒能力的大小，数值越大说明耐寒能力越强。由表4可见，特籼占13和爱国的综合评价值(d值)较高(0.88、0.83)，评价为耐寒能力极强。扬稻3号和珍珠矮综合评价值(d值)较低(0.05，0.04)，评价为综合耐寒能力极弱。
[0117]
表4各品种的主成分值、隶属函数值、综合评价值(d值)、预测值
[0118][0119][0120]
(4)回归分析
[0121]
为分析指标与品种耐寒性间的关系，筛选可靠的耐寒性鉴定指标，建立可用于水稻芽期耐寒性评价的线性关系，把耐寒性综合评价值(d值)作为因变量，把各单项指标作为自变量进行逐步回归分析，建立最优回归方程：d值＝0.592 0.090gi 0.123sr-0.075mgt 0.086pi 0.099gr 0.054gp。方程决定系数r2＝1.0000，p＝0.0000，表明6个自变量几乎可决定d值的全部变异。由方程可知，7个单项指标中有6个指标对水稻耐寒性有显著影响，分别为发芽指数、成苗率、平均发芽时间、种子萌发指数、发芽率和发芽势。用该回归方程对18个品种水稻的耐寒性进行预测，其预测值(表4)与综合评价值d值的排序完全一致。说明该回归方程能够很好地量化各品种的综合耐寒能力与各指标值间的关系，可用于对水稻耐寒性进行科学准确的预测。
[0122]
(5)聚类分析
[0123]
利用d值，采用欧氏距离和组间联接法进行聚类分析，将18份品种分为5个类群(图1)，对应水稻耐寒性划分的极强、强、中、弱、极弱5个等级。
[0124]
第i类群包括镇稻1号、冀粳1号、广场矮、楚粳5号、云粳9号、旱丰8号、莲塘早等7个品种，耐寒性中等；第ⅱ类群包括特籼占13、爱国等2个品种，耐寒性极强；第ⅲ类群包括红410、特青、宁粳6号、开粳2号、辽粳五号等5个品种，耐寒性强；第ⅳ类群包括四梅2号、扬稻3号、珍珠矮等3个品种，耐寒性极弱；第
ⅴ
类群包括先锋1号1个品种，耐寒性弱(表5)。
[0125]
表5 18份水稻种质资源的耐寒分级结果
[0126][0127]
三、讨论
[0128]
1、水稻种质资源芽期耐寒性鉴定指标的选择
[0129]
芽期耐寒种质资源的筛选和鉴定是水稻芽期耐寒育种的核心任务之一。本发明通过逐步回归分析，得到能显著影响d值6个单项指标，即发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发系数、平均发芽时间和成苗率，符合大量种质资源芽期耐寒性鉴定对评价指标简单易行、准确有效的要求，可对水稻芽期耐寒性进行比较全面的评价。利用该评价模型来评价水稻种质芽期耐寒性的强弱，可以有效地快速鉴定水稻种质资源的芽期耐寒性，使鉴定工作简单、快速、有效。
[0130]
2、水稻种质资源芽期耐寒性的多元统计学分析
[0131]
水稻芽期耐寒性是受到多个因子共同影响的复杂性状，单独使用某些单项指标很难准确全面地反映水稻的芽期耐寒性。利用多元统计学分析方法可将多项芽期耐寒相关指标数量化，与芽期耐寒性强弱建立数量关系，高效鉴定水稻芽期耐寒性。本发明选用7个较为简易、直观、便捷的指标，运用多元分析方法对水稻芽期耐寒性进行综合评价。
[0132]
主成分分析是多元统计分析中的常用的降维方法，可以将多个关联的复杂指标转换为几个相互独立的综合指标。本发明通过主成分分析，将水稻芽期7个单项指标转换成2个彼此独立的综合指标，其解释了原始指标所携带的绝大部分信息。隶属函数分析是利用模糊集合理论，对多种因素影响下的事物做出全面评价的多因素决策方法。本发明运用隶属函数法将2个综合指标的特征向量归一化处理，结合主成分分析所得到的权重，得到水稻种质芽期耐寒性综合评价值d值。依据d值可以对18个水稻种质的耐寒性进行排序级分级。结果表明，特籼占13和爱国的耐寒性为本发明选用水稻种质中最强，可以在今后的水稻芽期耐寒品种选育和改良中加以利用。
[0133]
聚类分析可将不同的种质进行分类，能直观地分析不同种质间的类群关系。本发明中，利用d值进行聚类分析，将18个水稻种质划分为5个类别，正好对应极强、强、中、弱、极弱5个水稻耐寒等级划分。结果验证了利用d值评价水稻芽期耐寒性的结果可靠，为水稻种质芽期耐寒性的快速鉴定提供有力的参考。本发明利用逐步回归构建了1个较为可靠的水稻芽期耐寒性评价模型，利用该模型在相同的胁迫条件下，可预测目标种质芽期耐寒性的强弱，为水稻芽期耐寒育种及资源的鉴定提供一定的依据。
[0134]
四、结论
[0135]
本发明对18份水稻种质资源芽期耐寒性进行鉴定评价。利用逐步回归和主成分分析等统计学方法，从测定的7个单项指标中筛选出发芽率、发芽势、发芽指数、种子萌发系数、平均发芽时间和成苗率6个关键指标，建立了最优回归方程，可用于水稻种质资源芽期耐寒性的快速鉴定与预测。利用综合评价值d值获得了2份芽期极耐寒种质，为水稻种质资源筛选与鉴定，耐寒品种的选育、推广提供了材料和依据。
[0136]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。