1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及免疫分析，比率分析方法及稳定同位素(metalstableisotope)传感领域。
背景技术：
：：2.磁珠（mps）通常是由γ-fe2o3或fe3o4组成的微球，其大小可以从纳米到微米级别。独特的超顺磁性避免了离心和色谱分离等费时费力的分离程序，促使磁性微球是世界上商业化应用最广泛的基底。磁珠在癌症治疗，药物输送，磁共振成像，血液净化和分子诊断等各种生物学应用中均取得了巨大的成功。例如，基于磁性微球开发了具有光热和磁热特性的近红外mps成像示踪剂被用于小鼠的肿瘤消融。以及创建了基于mps的体外血液净化设备，用于治疗血液中毒，在无需识别传染源的情况下实现对血液中的病原体和毒素的不断清除。除此之外，一些基于磁珠的特异性强、灵敏度高、无放射性污染的生物分析方法已广泛用于对生物活性物质的检测。在这些开创性的工作之后，一个重要的挑战是实现更准确可靠的定量分析。3.比率分析可以帮助校正复杂的基质问题并实现对生物样本的准确可靠分析。采用内标（is）不仅可以消除样品预处理过程中的失误，而且可以校正仪器检测中的信号波动。比率分析通过两个信号的比值进行定量分析，可显着提高方法的准确性。许多研究者们也致力于有效is的设计。尽管取得了巨大的成功，但复杂的is标记或合成程序常常阻碍了si在生物定量分析中的广泛应用。技术实现要素：4.(一)要解决的技术问题为了实现对抗原的准确定量检测，本发明提供一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法。5.本发明以癌胚抗原（cea）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。采用高分辨电感耦合等离子体质谱（icpms）同时采集磁珠内的57fe信号及报告探针中的197au信号。研究197au/57fe信号比值和cea浓度的关系，实现对cea的准确定量分析，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。6.(二)技术方案为了解决上述问题，本发明的第一目的是提供以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对cea的准确定量检测。本发明开发载体磁珠的一种新功能，提供了一种新型的免疫分析方法，并实现了对cea的定量检测。其原理见图1，本发明以癌胚抗原（cea）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。首先分别用一抗和二抗标记磁珠和金纳米颗粒。其次让其与不同浓度的cea发生免疫反应。最后磁分离洗涤后，采用高分辨电感耦合等离子体质谱（icpms）同时采集磁珠内的57fe信号及报告探针中的197au信号。197au/57fe信号比值与cea浓度在一定范围具有较好的线性关系可实现目标分子的定量检测，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。7.本发明的检测方法优选的技术方案包括如下步骤：s1：通过常用的柠檬酸钠还原法合成金纳米粒子；s2：金纳米颗粒与一定量的抗体在室温下旋转孵育40分钟形成抗体修饰的金纳米颗粒（ab2-aunps），并用bsa封闭；s3：制备cea抗体修饰的磁性微球（ab1-mmp）；s4：加入相同体积不同浓度的cea与所述ab1-mmp混合，在一定温度下反应一定时间，磁性分离洗涤；s5：加入一定倍数稀释的ab2-aunps，识别cea抗原并形成三明治结构；s6：磁性分离洗涤后，用王水消解，最后溶液被稀释至一定体积；s7：无机元素质谱采集溶液中的197au与57fe的信号强度并研究其比值与cea浓度的关系。8.本发明方法中，s2所述抗体的用量为0-20ꢀµg。9.本发明方法中，s3所述制备方法：首先，将购买的磁珠置于涡旋混合仪上涡旋30s使磁珠重悬于瓶中。随后，取洗涤2次后的100μl10mg/ml链霉亲和素包被的磁珠溶液与中加入20μl1mg/ml的生物素修饰的cea抗体（0.01mpbs，ph7.4），在25ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。10.本发明方法中，s4所述cea浓度范围为0.6-300ng/ml，反应温度为37ºc，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为pbsph7.4。11.本发明方法中，s5所述ab2-aunps的倍数稀释最优为5倍，反应温度为37ºc，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为pbsph7.4。12.本发明方法中，s6所述反应内容为：磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。13.(三)有益效果本发明的有益效果是：1.本发明中以商业化的磁性微球中fe元素作为内标，进一步提高方法的准确性，可以避免因磁珠损失造成的不准确，从而实现cea的准确定量分析。14.2.本发明使用磁性微粒作为载体，不需要额外加入元素或者引入另一种标记物，方法简单。15.3.本发明的方法具有普遍适用性，本发明可能为基于磁珠的生物分析方法提供了新思路。附图说明16.图1为本发明的实验机理示意图。17.图2为探究本发明中用于修饰金纳米颗粒的抗体的最佳用量优化结果图。18.图3为本发明中ab1-mps与抗原反应时间优化的结果图。19.图4为本发明中ab2-aunps与抗原反应时间优化的结果图。20.图5为本发明分析方法对cea检测的分析性能示意图。具体实施方式21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。22.本发明为以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对cea的准确定量检测。进一步的，所述链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的抗体结合形成ab1-mps。23.进一步的，所述合成的ab2-aunps用bsa封闭。24.本发明用于cea检测，包括以下步骤：s1：制备ab1-mps。25.s2：制备ab2-aunps。26.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl不同浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。27.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。28.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。29.本发明实施例：1．本发明实施例所使用的实验仪器和设备实验所使用到的仪器主要有：恒温振荡仪，elementxr高分辨电感耦合等离子体质谱仪。30.2．本发明实施例所使用的实验试剂四水合氯金酸，柠檬酸三钠，硼酸，十水合四硼酸钠，磷酸二氢钠（nah2po4），磷酸氢二钠和tween20，盐酸和硝酸，牛血清白蛋白，链霉亲和素修饰的磁性微球，癌胚抗原，生物素化的小鼠单克隆cea抗体（bio-ab1），小鼠单克隆cea抗体（ab2）。31.从milli-qintegral水净化仪器获得去离子水（diw，18.2mωcm-1）。32.实施例1：s1：分别将不同量的cea抗体与1mlaunps溶液培育40分钟。33.s2：测上述混合溶液的吸光度。34.s3：将ab2-aunps通过离心纯化后，加入300μl3mnacl溶液与其混合。35.s4:观察上述溶液的颜色与状态。36.实验结果：本实验为优选本发明修饰金纳米颗粒的抗体的最佳用量。37.其中，本实验反应条件如实施例1所述。38.抗体用量分别设计为0、1、3、5、7、10、13、15、17、20μg。39.当加入抗体的量大于10μg时，ab2-aunps溶液的吸光度基本维持不变。这表明当抗体的量约10μg足够完成对aunps的修饰。且当加入cea抗体的量大于13μg时，ab2-aunps溶液与原aunps溶液的颜色和形态几乎一致，这表明在该条件下具有较好的稳定性。综合考虑到抗体的昂贵性和ab2-aunps溶液的抗离子干扰能力，我们选择标记aunps的抗体量为13μg。40.实施例2：s1：制备ab1-mps。41.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。42.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl固定浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育一定时间。43.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。44.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。45.实验结果：本实验为优选发明中ab1-mps与抗原的最佳反应时间。46.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），其他反应条件如实施例2所述。47.ab1-mps与抗原的反应时间分别设计为30min、45min、60min、75min、90min。48.如图3所示，纵坐标为s/n值，横坐标为反应时间。反应时间增加使s/n值逐渐增加并达到平台。我们选择了60min作为以下实验条件。49.实施例3：s1：制备ab1-mps。50.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。51.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl固定浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。52.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育一定时间。53.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。54.实验结果：本实验为优选发明中ab2-aunps与抗原的最佳反应时间。55.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），ab1-mps与抗原的反应时间为60min（如实施例2所述），其他反应条件如实施例3所述。56.ab2-aunps与抗原的反应时间分别设计为30min、45min、60min、75min、90min。57.如图4所示，纵坐标为s/n值，横坐标为反应时间。反应时间增加使s/n值逐渐增加，进一步增加反应时间s/n值反而略有降低。我们选择了60min作为以下实验条件。58.实施例4：s1：制备ab1-mps。59.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。60.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl不同浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。61.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。62.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。63.实验结果：本实验为研究该方法用于定量检测cea的性能。64.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），ab1-mps与抗原的反应时间为60min（如实施例2所述），ab2-aunps与抗原的反应时间为60min（如实施例3所述），其他条件如实施例4所述。65.目标cea的浓度分别设计为0.6ng/ml、6ng/ml、30ng/ml、60ng/ml、150ng/ml、300ng/ml。66.待反应完成后，利用高分辨icpms检测197au和57fe元素的强度并计算其比值，根据计算得到的比值与目标cea的浓度来绘制标准曲线，如图5所示，其中，横坐标为cea的浓度，纵坐标为为197au和57fe强度的比值；所述的标准曲线表示为iau/ife=5.874*10-3c 0.023，相关系数r=0.997；其中i表示icpms的强度值，c表示cea的浓度。线性范围为0.6至300ng/ml，检测限（lod）计算为约0.09ng/ml（采用3倍sd值除以斜率的方法计算而得，sd是10个空白样品的标准偏差值）。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，具体涉及免疫分析，比率分析方法及稳定同位素(metalstableisotope)传感领域。
背景技术：
：：2.磁珠（mps）通常是由γ-fe2o3或fe3o4组成的微球，其大小可以从纳米到微米级别。独特的超顺磁性避免了离心和色谱分离等费时费力的分离程序，促使磁性微球是世界上商业化应用最广泛的基底。磁珠在癌症治疗，药物输送，磁共振成像，血液净化和分子诊断等各种生物学应用中均取得了巨大的成功。例如，基于磁性微球开发了具有光热和磁热特性的近红外mps成像示踪剂被用于小鼠的肿瘤消融。以及创建了基于mps的体外血液净化设备，用于治疗血液中毒，在无需识别传染源的情况下实现对血液中的病原体和毒素的不断清除。除此之外，一些基于磁珠的特异性强、灵敏度高、无放射性污染的生物分析方法已广泛用于对生物活性物质的检测。在这些开创性的工作之后，一个重要的挑战是实现更准确可靠的定量分析。3.比率分析可以帮助校正复杂的基质问题并实现对生物样本的准确可靠分析。采用内标（is）不仅可以消除样品预处理过程中的失误，而且可以校正仪器检测中的信号波动。比率分析通过两个信号的比值进行定量分析，可显着提高方法的准确性。许多研究者们也致力于有效is的设计。尽管取得了巨大的成功，但复杂的is标记或合成程序常常阻碍了si在生物定量分析中的广泛应用。技术实现要素：4.(一)要解决的技术问题为了实现对抗原的准确定量检测，本发明提供一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法。5.本发明以癌胚抗原（cea）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。采用高分辨电感耦合等离子体质谱（icpms）同时采集磁珠内的57fe信号及报告探针中的197au信号。研究197au/57fe信号比值和cea浓度的关系，实现对cea的准确定量分析，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。6.(二)技术方案为了解决上述问题，本发明的第一目的是提供以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对cea的准确定量检测。本发明开发载体磁珠的一种新功能，提供了一种新型的免疫分析方法，并实现了对cea的定量检测。其原理见图1，本发明以癌胚抗原（cea）为研究模型，磁珠为载体，金纳米颗粒为报告探针。首先分别用一抗和二抗标记磁珠和金纳米颗粒。其次让其与不同浓度的cea发生免疫反应。最后磁分离洗涤后，采用高分辨电感耦合等离子体质谱（icpms）同时采集磁珠内的57fe信号及报告探针中的197au信号。197au/57fe信号比值与cea浓度在一定范围具有较好的线性关系可实现目标分子的定量检测，并提高该免疫分析方法的准确性和可靠性。7.本发明的检测方法优选的技术方案包括如下步骤：s1：通过常用的柠檬酸钠还原法合成金纳米粒子；s2：金纳米颗粒与一定量的抗体在室温下旋转孵育40分钟形成抗体修饰的金纳米颗粒（ab2-aunps），并用bsa封闭；s3：制备cea抗体修饰的磁性微球（ab1-mmp）；s4：加入相同体积不同浓度的cea与所述ab1-mmp混合，在一定温度下反应一定时间，磁性分离洗涤；s5：加入一定倍数稀释的ab2-aunps，识别cea抗原并形成三明治结构；s6：磁性分离洗涤后，用王水消解，最后溶液被稀释至一定体积；s7：无机元素质谱采集溶液中的197au与57fe的信号强度并研究其比值与cea浓度的关系。8.本发明方法中，s2所述抗体的用量为0-20ꢀµg。9.本发明方法中，s3所述制备方法：首先，将购买的磁珠置于涡旋混合仪上涡旋30s使磁珠重悬于瓶中。随后，取洗涤2次后的100μl10mg/ml链霉亲和素包被的磁珠溶液与中加入20μl1mg/ml的生物素修饰的cea抗体（0.01mpbs，ph7.4），在25ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。10.本发明方法中，s4所述cea浓度范围为0.6-300ng/ml，反应温度为37ºc，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为pbsph7.4。11.本发明方法中，s5所述ab2-aunps的倍数稀释最优为5倍，反应温度为37ºc，反应时间为30-90分钟，反应的缓冲为pbsph7.4。12.本发明方法中，s6所述反应内容为：磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。13.(三)有益效果本发明的有益效果是：1.本发明中以商业化的磁性微球中fe元素作为内标，进一步提高方法的准确性，可以避免因磁珠损失造成的不准确，从而实现cea的准确定量分析。14.2.本发明使用磁性微粒作为载体，不需要额外加入元素或者引入另一种标记物，方法简单。15.3.本发明的方法具有普遍适用性，本发明可能为基于磁珠的生物分析方法提供了新思路。附图说明16.图1为本发明的实验机理示意图。17.图2为探究本发明中用于修饰金纳米颗粒的抗体的最佳用量优化结果图。18.图3为本发明中ab1-mps与抗原反应时间优化的结果图。19.图4为本发明中ab2-aunps与抗原反应时间优化的结果图。20.图5为本发明分析方法对cea检测的分析性能示意图。具体实施方式21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。22.本发明为以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法实现对cea的准确定量检测。进一步的，所述链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的抗体结合形成ab1-mps。23.进一步的，所述合成的ab2-aunps用bsa封闭。24.本发明用于cea检测，包括以下步骤：s1：制备ab1-mps。25.s2：制备ab2-aunps。26.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl不同浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。27.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。28.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。29.本发明实施例：1．本发明实施例所使用的实验仪器和设备实验所使用到的仪器主要有：恒温振荡仪，elementxr高分辨电感耦合等离子体质谱仪。30.2．本发明实施例所使用的实验试剂四水合氯金酸，柠檬酸三钠，硼酸，十水合四硼酸钠，磷酸二氢钠（nah2po4），磷酸氢二钠和tween20，盐酸和硝酸，牛血清白蛋白，链霉亲和素修饰的磁性微球，癌胚抗原，生物素化的小鼠单克隆cea抗体（bio-ab1），小鼠单克隆cea抗体（ab2）。31.从milli-qintegral水净化仪器获得去离子水（diw，18.2mωcm-1）。32.实施例1：s1：分别将不同量的cea抗体与1mlaunps溶液培育40分钟。33.s2：测上述混合溶液的吸光度。34.s3：将ab2-aunps通过离心纯化后，加入300μl3mnacl溶液与其混合。35.s4:观察上述溶液的颜色与状态。36.实验结果：本实验为优选本发明修饰金纳米颗粒的抗体的最佳用量。37.其中，本实验反应条件如实施例1所述。38.抗体用量分别设计为0、1、3、5、7、10、13、15、17、20μg。39.当加入抗体的量大于10μg时，ab2-aunps溶液的吸光度基本维持不变。这表明当抗体的量约10μg足够完成对aunps的修饰。且当加入cea抗体的量大于13μg时，ab2-aunps溶液与原aunps溶液的颜色和形态几乎一致，这表明在该条件下具有较好的稳定性。综合考虑到抗体的昂贵性和ab2-aunps溶液的抗离子干扰能力，我们选择标记aunps的抗体量为13μg。40.实施例2：s1：制备ab1-mps。41.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。42.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl固定浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育一定时间。43.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。44.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。45.实验结果：本实验为优选发明中ab1-mps与抗原的最佳反应时间。46.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），其他反应条件如实施例2所述。47.ab1-mps与抗原的反应时间分别设计为30min、45min、60min、75min、90min。48.如图3所示，纵坐标为s/n值，横坐标为反应时间。反应时间增加使s/n值逐渐增加并达到平台。我们选择了60min作为以下实验条件。49.实施例3：s1：制备ab1-mps。50.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。51.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl固定浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。52.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育一定时间。53.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。54.实验结果：本实验为优选发明中ab2-aunps与抗原的最佳反应时间。55.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），ab1-mps与抗原的反应时间为60min（如实施例2所述），其他反应条件如实施例3所述。56.ab2-aunps与抗原的反应时间分别设计为30min、45min、60min、75min、90min。57.如图4所示，纵坐标为s/n值，横坐标为反应时间。反应时间增加使s/n值逐渐增加，进一步增加反应时间s/n值反而略有降低。我们选择了60min作为以下实验条件。58.实施例4：s1：制备ab1-mps。59.s2：金纳米颗粒与13μg抗体在室温下旋转孵育40分钟制备ab2-aunps，并用bsa封闭。60.s3：取40μl稀释后的ab1-mmp和100μl不同浓度的cea混合均匀，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。61.s4:用50μlpbst溶液洗涤磁珠复合物2次。然后，向样品中加入50μl稀释后的ab2-aunps，在37ꢀºc、1500rpm条件下震荡孵育1h。62.s5:最后，洗涤后磁珠复合物与50μl王水反应20min后，用超纯水稀释溶液至8ml。最终由高分辨电感耦合等离子体质谱采集溶液中197au和57fe的信号并计算两者的比值。63.实验结果：本实验为研究该方法用于定量检测cea的性能。64.其中，本实验中修饰金纳米抗体的量为13μg（如实施例1所述），ab1-mps与抗原的反应时间为60min（如实施例2所述），ab2-aunps与抗原的反应时间为60min（如实施例3所述），其他条件如实施例4所述。65.目标cea的浓度分别设计为0.6ng/ml、6ng/ml、30ng/ml、60ng/ml、150ng/ml、300ng/ml。66.待反应完成后，利用高分辨icpms检测197au和57fe元素的强度并计算其比值，根据计算得到的比值与目标cea的浓度来绘制标准曲线，如图5所示，其中，横坐标为cea的浓度，纵坐标为为197au和57fe强度的比值；所述的标准曲线表示为iau/ife=5.874*10-3c 0.023，相关系数r=0.997；其中i表示icpms的强度值，c表示cea的浓度。线性范围为0.6至300ng/ml，检测限（lod）计算为约0.09ng/ml（采用3倍sd值除以斜率的方法计算而得，sd是10个空白样品的标准偏差值）。当前第1页12当前第1页12
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