一种复合人工胆管及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物制剂器械领域，特别是涉及一种复合人工胆管及其制备方法。


背景技术：

2.胆管是长管状结构，负责将肝脏分泌的胆汁输送到消化道，对食物消化至关重要。如果儿童患上胆道闭锁，将导致胆管无法发挥正常功能，肝脏无法分泌胆汁。在医学上，对于病变的胆总管经手术切除后遗留的问题，如胆道的修复或重建等，一直是胆道外科急需解决的主要难题之一。至今为止，人工胆管及其胆管替代物的研究越来越引起学者的重视。胆道疾病在进行各种方式的胆肠吻合手术之前，通常需要切除或切开胆管，这样会使胆管以及oddi括约肌功能丧失或出现结构缺损，不仅增加了手术难度，而且由于胆管组织损伤后的再生能力低下，处理棘手，术后容易发生各种并发症。区别于目前较传统的手术方式，应用人工胆管替代物重新构建肝外胆道是使复杂手术趋向于简单、合理的有效途径。
3.目前人工胆管的研究主要有以下几方面：(1)自体移植人工胆管(包括阑尾间置胆道重建术，胆管空肠吻合术等)；(2)同种异体胆管移植和异种胆管移植；(3)机械性胆管假体；(4)组织工程人工胆管。但自体人工胆管存在胆道原有的解剖结构发生改变，从而影响了肠道的正常消化功能，而且胆肠吻合术不能完全避免反流性胆管炎的发生；异种移植也存在诸多问题，如超急性排斥反应、急性血管性排斥反应和细胞介导的排斥反应以及异种移植受者的病毒感染等。
4.近年来，随着生物化学、干细胞、组织工程学、材料学以及纳米技术的发展，以及随着制造工业水平的提高，使得人工胆管的研究有了很大的发展。近年来，已经有组织工程皮肤、血管、气管、膀胱等应用于临床的相关报道。这些组织工程化器官的应用成果无形之中也推动了组织工程胆管的研究进程。国内外肝胆外科学者们借鉴组织工程血管的成功经验，将组织工程技术应用到组织工程胆管的研究之中，取得了丰硕的研究成果。但就目前的研究水平和临床应用价值来看，由不可降解合成高分子材料制成的人工胆管向组织工程化人工胆管的过渡是我们必然要走的道路。干细胞、组织工程学及纳米技术的发展推动了人工胆管领域的研究。无论是不可降解材料还是可降解材料，它们都在胆道修复方面取得了突破性进展。只是单一的高分子材料制备的人工胆管无法达到令人满意的程度，将两种或两种以上的材料复合制备人工胆管替代物是解决这个问题的途径。但是目前的人工胆管还面临手术后容易产生胆汁淤积和缝合处易发生胆管瘢痕狭窄等问题。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种复合人工胆管及其制备方法。由软质材料组成，便于缝合，材料内表面光滑降低胆汁淤积的风险。材料外面要用生物相容性好的材料包覆，而且要能降低缝合处易发生胆管瘢痕狭窄的风险。
6.本发明的第一方面，提供一种复合人工胆管，所述复合人工胆管包括内管和包覆于内管表面的包覆层，所述内管为聚四氟乙烯管，所述包覆层为细菌纤维素层，所述复合人
工胆管上还负载有补强材料，填充材料，生长因子、生物抗菌酶和水。。
7.本发明的第二方面，提供一种复合人工胆管的制备方法，至少包括以下步骤：
8.1)聚四氟乙烯管浸在细菌培养液中，包覆细菌纤维素，获得初品i；
9.2)将含有生长因子和生物抗菌酶的水溶液加入到所述初品i中，获得初品ii；
10.3)将含有补强材料和填充材料的水溶液加入到初品ii中，获得初品iii；
11.4)将初品iii进行原位自由基聚合反应，获得复合人工胆管。
12.本发明第三方面，提供一种复合人工胆管，所述复合人工胆管采用如前所述的复合人工胆管的制备方法制成。
13.本发明的有益效果为：本发明不仅能够提高胆管的生物相容性，而且便于缝合，不易产生胆汁淤积的问题，减少并发症胆管瘢痕狭窄的出现，有效抗植入局部的细菌感染。
附图说明
14.图1：本发明的复合人工胆管的使用效果图。
15.图2：l929细胞在加入胆管浸提液后黏附性能检测结果。
具体实施方式
16.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
17.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
18.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
19.除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规技术。
20.本发明一实施例的复合人工胆管，包括内管和包覆于内管表面的包覆层，所述内管为聚四氟乙烯管，所述包覆层为细菌纤维素层，所述复合人工胆管上还负载有补强材料，填充材料，生长因子、生物抗菌酶和水。
21.进一步的，以所述复合人工胆管的总重量为基准计，各组分重量百分比为：
[0022][0023]
可选的，所述聚四氟乙烯管的内径2-10mm，外径2.2-15mm。
[0024]
对于制备人工胆管替代物的材料来说，硬质高分子材料不便于手术缝合，软质高分子材料存在胆汁淤积的问题。聚四氟乙烯相对硬质材料软而且生物相容性好，不易产生胆汁淤积的问题。在聚四氟乙烯管外面用软而富有弹性的细菌纤维素包裹，不仅提高了胆管的生物相容性，而且便于缝合。
[0025]
细菌纤维素(bacterial cellulose，bc)可以是由醋酸菌属(acetobacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)或八叠球菌属(sarcina)的细菌合成的纤维素。
[0026]
可选的，所述复合人工胆管中，聚四氟乙烯的含量为5％-10％，10％-20％，20％-30％，30％-40％，40％-50％。
[0027]
可选的，所述复合人工胆管中，细菌纤维素的重量百分比为40％-50％，50％-60％，60％-70％，70％-80％，80％-90％，90％-94％，40％-90％，50％-90％，60％-90％。
[0028]
进一步可选的，所述复合人工胆管中，聚四氟乙烯的重量百分比为5％-30％，细菌纤维素的含量为69％-94％。可选的，细菌纤维素的含量为69％-90％。
[0029]
可选的，所述复合人工胆管中，补强材料的重量百分比为0.01％-0.1％，0.1％-0.5％，0.5％-1％，1％-01.5％，1.5％-2％。
[0030]
可选的，所述复合人工胆管中，填充材料的重量百分比为0.01％-0.1％，0.1％-0.5％，0.5％-1％，1％-01.5％，1.5％-2％。
[0031]
可选的，所述复合人工胆管中，生长因子的重量百分比为0.000000001％-0.000001％，0.000001％-0.01％。
[0032]
可选的，所述复合人工胆管中，生物抗菌酶的重量百分比为0.01％-3.01％，0.01％-0.1％，0.1％-1％，1％-2％，2％-3％，3％-3.01％。
[0033]
可选的，所述补强材料选自n-异丙基丙烯酰胺、明胶、胶原蛋白、硫酸软骨素、海藻酸钠和壳聚糖及其衍生物中的一种或多种。所述补强材料增加了细菌纤维素的材质的强度，而且使得其与聚四氟乙烯结合更紧密。
[0034]
所述填充材料选自无机粘土。
[0035]
所述生长因子选自afgf、egf、bfgf、pdgf、hgf和csf中的一种或多种。
[0036]
生长因子的添加可以提高复合人工胆管的生物相容性，降低并发症胆管瘢痕狭窄的出现。
[0037]
可选的，所述生物抗菌酶选自溶葡萄球菌酶、溶菌酶、抗菌肽和噬菌体裂解酶中的
一种或多种。
[0038]
生物抗菌酶可以避免人工胆管发生植入部位的感染。
[0039]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，溶葡萄球菌酶重量百分比为0-0.01％。
[0040]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，溶菌酶重量百分比为0-1％；
[0041]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，抗菌肽重量百分比为0-1％；
[0042]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，噬菌体裂解酶重量百分比为0-1％。
[0043]
可选的，所述复合人工胆管中，溶葡萄球菌酶重量百分比为0-0.000001％，0.000001％-0.01％。
[0044]
可选的，所述复合人工胆管中，溶菌酶的重量百分比为0-0.0001％，0.0001％-0.1％，0.1％-1％。
[0045]
本发明一实施例的复合人工胆管的制备方法，至少包括以下步骤：
[0046]
1)聚四氟乙烯管浸在细菌培养液中，包覆细菌纤维素，获得初品i；
[0047]
2)将含有生长因子和生物抗菌酶的水溶液加入到所述初品i中，获得初品ii；
[0048]
3)将含有补强材料和填充材料的水溶液加入到初品ii中，获得初品iii；
[0049]
4)将初品iii进行原位自由基聚合反应，获得复合人工胆管。
[0050]
所述细菌可以是醋酸菌属(acetobacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)或八叠球菌属(sarcina)的细菌。
[0051]
例如可以是木醋杆菌(acetobacter xylinus)。
[0052]
可选的，步骤1)中，将聚四氟乙烯管浸在细菌培养液中进行滚动培养。滚动转速为10-30转/分钟，培养48-72小时。
[0053]
可选的，步骤1)中细菌纤维素的厚度为0.5mm-5mm。可以为0.5mm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm。以保证获得的细菌纤维素的重量满足要求，同时方便复合人工胆管便于缝合。
[0054]
可选的，含有补强材料和填充材料的水溶液采用以下方法制成：将补强材料和填充材料溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
[0055]
进一步的，以所述复合人工胆管的总量为基准计，各组分重量百分比为：
[0056][0057]
在步骤2)和步骤3)中，含有生长因子和生物抗菌酶的水溶液、含有补强材料和生长因子的水溶液中的生长因子、生物抗菌酶、补强材料和生长因子的量与最终获得的复合人工胆管的中生长因子、生物抗菌酶、补强材料和生长因子的量相同。可以通过滴加的方式进行制备。
[0058]
可选的，所述聚四氟乙烯管的内径2-10mm，外径2.2-15mm。
[0059]
可选的，所述复合人工胆管中，聚四氟乙烯的含量为5％-10％，10％-20％，20％-30％，30％-40％，40％-50％。
[0060]
可选的，所述复合人工胆管中，细菌纤维素的含量为40％-50％，50％-60％，60％-70％，70％-80％，80％-90％，90％-94％，40％-90％，50％-90％，60％-90％。
[0061]
进一步可选的，所述复合人工胆管中，聚四氟乙烯的含量为5％-30％，细菌纤维素的含量为69％-94％。可选的，细菌纤维素的含量为69％-90％。
[0062]
可选的，所述复合人工胆管中，补强材料的含量为0.01％-0.1％，0.1％-0.5％，0.5％-1％，1％-01.5％，1.5％-2％。
[0063]
可选的，所述复合人工胆管中，填充材料的含量为0.01％-0.1％，0.1％-0.5％，0.5％-1％，1％-01.5％，1.5％-2％。
[0064]
可选的，所述复合人工胆管中，生长因子的含量为0.000000001％-0.000001％，0.000001％-0.01％。
[0065]
可选的，所述复合人工胆管中，生物抗菌酶的重量百分比为0.01％-3.01％，0.01％-0.1％，0.1％-1％，1％-2％，2％-3％，3％-3.01％。
[0066]
可选的，所述补强材料选自n-异丙基丙烯酰胺、明胶、胶原蛋白、硫酸软骨素、海藻酸钠和壳聚糖及其衍生物中的一种或多种。所述补强材料增加了细菌纤维素的材质的强度，而且使得其与聚四氟乙烯结合更紧密。
[0067]
所述填充材料选自无机粘土。
[0068]
所述生长因子选自afgf、egf、bfgf、pdgf、hgf和csf中的一种或多种。
[0069]
生长因子的添加可以提高复合人工胆管的生物相容性，降低并发症胆管瘢痕狭窄的出现。
[0070]
可选的，所述生物抗菌酶选自溶葡萄球菌酶、溶菌酶、抗菌肽和噬菌体裂解酶中的一种或多种。
[0071]
生物抗菌酶可以避免人工胆管发生植入部位的感染。
[0072]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，溶葡萄球菌酶含量为0-0.01％。
[0073]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，溶菌酶含量为0-1％；
[0074]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，抗菌肽含量为0-1％；
[0075]
在一种实施方式中，所述复合人工胆管中，噬菌体裂解酶含量为0-1％。
[0076]
可选的，所述复合人工胆管中，溶葡萄球菌酶含量为0-0.000001％，0.000001％-0.01％。
[0077]
可选的，所述复合人工胆管中，溶菌酶的含量为0-0.0001％，0.0001％-0.1％，0.1％-1％。
[0078]
本发明一实施例的复合人工胆管，采用前述的复合人工胆管的制备方法制成。
[0079]
实施例1复合人工胆管的制备
[0080]
1.1复合人工胆管基质材料的制备：
[0081]
取活化好的木醋杆菌1.1812菌株接入种子培养基，32℃振荡培养24h，摇床转速为150-200rpm。再取出1.5l培养好的种子接入到加了20l灭菌后发酵培养基的反应器中，反应器中接可滚动培养的聚四氟乙烯管(联系厂家确定内径和外径即可定制)，将聚四氟乙烯管
浸入在细菌培养液中，32℃滚动培养，滚动转速为10-30转/分钟，培养48-72小时，获得初步生成的复合胆管材料。
[0082]
将初步生成的复合胆管材料取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于1％的naoh溶液，煮沸6h，去除液膜中的菌体和残留培养基，然后用去离子水多次冲洗并平衡至中性，获得初品i。
[0083]
1.2复合人工胆管成品的制备：
[0084]
(1)将上述步骤得到的初品i机械除水，使其厚度为原来的1/2-3，然后在将初品i管上滴加含有一定量溶葡萄球菌酶、溶菌酶和生长因子等的水溶液，具体生长因子、溶葡萄球菌酶、溶菌酶的滴加量见表1(滴加量与最终成品中的含量相同)。4℃冷藏放置12h，使其达到吸附平衡，获得初品ii。
[0085]
(2)在50ml去离子水中通氮气3小时以上以除去其中溶解的氧气，将0.3g n-异丙基丙烯胺与0.3g蒙脱土溶解于除氧去离子水中，在冰水浴中搅拌至溶液澄清。
[0086]
(3)将步骤(2)得到的澄清溶液滴加到步骤(1)中得到的初品ii中，并于4℃冰箱中放置24h，使其达到吸附平衡，获得初品iii；
[0087]
(4)将步骤(3)得到的初品iii取出并用蒸馏水反复冲洗，以去除表面吸附的物质，再将胆管放入40℃的培养箱中反应6h，进行原位自由基聚合反应。聚合完成后，即得到复合人工胆管。
[0088]
(5)将复合人工胆管进行包装，即得到最终成品。
[0089]
表1制备的不同配方复合人工胆管中各物质的重量百分比
[0090][0091][0092]
实施例2复合人工胆管生长因子体外释放实验
[0093]
将实施例1得到的不同产品各1 0g，分别浸于15mlpbs(ph 7.4)介质中，摇床(90rpm)，37℃。定时从介质中取出1ml样品，并补充同量的新鲜pbs，测定生长因子的含量，并计算累积释放量。
[0094][0095]
对复合人工胆管体外生长因子释放的研究发现，生长因子可以很好的从复合人工胆管中缓慢释放，随着其浓度的增加，酶的释放量随之增加。
[0096]
实施例3复合人工胆管杀菌实验
[0097]
3.1体外杀菌实验：
[0098]
将浸有菌液的滤纸片与实施例1中制备的复合人工胆管的浸提液孵育不同时间后，将滤纸片用无菌生理盐水洗脱，将洗下的菌液稀释后，计数并计算杀菌率。
[0099]
配方10min20min30min60min120min10％0％0％0％0％235.4％43.1％52.3％67.2％63.5％398.5％99.2％99.9％100％100％480.2％88.5％95.8％99.0％99.5％572.6％86.5％98.3％99.6％99.9％
[0100]
从表中数据看出，随着浸提液与金黄色葡萄球菌接触时间延长，其杀菌率也增大，特别是配方3，引起含有的溶葡萄球菌酶和溶菌酶的浓度较高，作用30分钟后基本可以完全杀灭制片上的细菌。
[0101]
3.2动物实验：
[0102]
实施例1中制备的复合人工胆管(外层的缝合部分(细菌纤维素层)长为20mm，内层的聚四氟乙烯管长30mm，内径4mm)，动物实验选用上海白猪6只(体重40-50kg)，胆管直径3.5-5mm，与人胆管直径相接近。
[0103]
手术方法：给予气管插管全麻。上腹正中切口长20cm，逐层进入腹腔，切除胆总管约20mm，将复合人工胆管内层两端插入胆总管远近断端内各5mm，胆管断端与复合人工胆管外层用4-0prolene线连续缝合，逐层关腹。
[0104]
术后体征观察；随访肝功；生存90天后麻醉下解剖，观察有无腹腔感染、胆漏，人工胆管通畅性；进行光镜、透射电镜下组织学检测；扫描电镜进行人工胆管抗衰性观测。
[0105]
实验猪在术后短期内均可恢复站立行走，尿色正常，大便颜色正常，巩膜无黄染，
切口无感染，饮食正常，生活习性与术前无改变，并且术后实验猪的各项指标均正常，90天后体重明显增加。实验猪在术后90天均行麻醉下解剖，将人工胆管取出。如图1所示，人工胆管已完全被纤维组织均匀包裹，吻合口周围组织无明显炎性改变，腹腔无粘连，无胆漏，近端胆管无扩张，肝脏表面光滑，色泽质地正常。表明取出后的人工胆管除了颜色变黄外，表面密封性良好，并且管内壁光滑，无沉淀物附着。证明了复合人工胆管可以很好的用于病变胆管的替换。
[0106]
实施例4细胞相容性分析
[0107]
参照实施例1，使用以下材料，制备三组胆管：
[0108]
bc组：聚四氟乙烯管加细菌纤维素、
[0109]
bc/csf组：聚四氟乙烯加细菌纤维素和csf、
[0110]
bc/c-ly组：聚四氟乙烯加细菌纤维素和csf和溶葡萄球菌酶，
[0111]
以上三组中的材料加入量同实施例1中的配方4，水补足余量。
[0112]
制备好后，置于pbs(ph 7.4)介质中浸提4-6小时后，将浸提液加入到小鼠l929细胞培养平板中，观察三组浸提液与l929细胞孵育不同时间，对其黏附率的影响。结果如图2所示，实验数据证明三种浸提液对正常细胞的粘附能力都没有影响。证明该复合人工胆管的生物相容性好。
[0113]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。