一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法与流程

1.本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及一种酶促化学发光试剂盒、制备方法及检测方法。


背景技术：

2.磁微粒化学发光免疫分析方法是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新兴分析方法，该技术充分利用了磁性分离技术的快速、易自动化性，化学发光技术的高灵敏度、以及免疫分析的特异性，是一种高度敏感的微量测量技术。
3.目前，磁微粒化学发光己经应用于管式化学发光以及电化学发光免疫检测，但是申请人发现：由于磁微粒化学发光在应用于管式化学发光以及电化学发光免疫检测时需要化学发光试剂与化学发光仪器匹配组成封闭的体系，在化学发光试剂与化学发光仪器均处于开发初期，由于没有任何调试的标准，使得不确定性的因素多，开发难度极大。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可快速搭建稳定的磁微粒化学发光法研发平台，同时具有反应体系小，成本低，反应体系灵活，效率高的酶促化学发光试剂盒、制备方法和检测方法。
5.为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.本发明提供了一种酶促化学发光试剂盒，包括有：
7.磁微粒抗体工作液，由磁微粒母液和磁微粒稀释液配制而成，所述磁微粒母液是链霉亲和素磁微粒抗体母液，所述磁微粒稀释液包含第一ph缓冲液、第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第一防腐剂、氯化钠；
8.酶标抗体工作液，由酶标记抗体母液和酶标抗体稀释液配制而成，所述酶标记抗体母液是碱性磷酸酶标记单克隆抗体母液，所述酶标抗体稀释液包含第二ph缓冲液、第三蛋白质稳定剂、第四蛋白质稳定剂、第二防腐剂、第一离子、第二离子，所述第一离子和第二离子是锌离子、镁离子或钙离子；
9.清洗液，包含第三ph缓冲液、氯化钠、第一表面活性剂、第二表面活性剂、第三防腐剂和第四防腐剂；
10.其中，所述第一ph缓冲液、第二ph缓冲液和第三ph缓冲液的缓冲范围为ph 5.0～8.5，浓度为10～200mmol/l，所述第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第三蛋白质稳定剂和第四蛋白质稳定剂的质量百分浓度为0.1％～10％，所述第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂和第四防腐剂的质量百分浓度为0.01％～5％，所述第一表面活性剂和第二表面活性剂的质量百分浓度为0.001％～5％。
11.进一步地，所述链霉亲和素磁微粒抗体母液由链霉亲和素磁微粒、第一pb缓冲液、生物素标记抗体制备而成，而且所述链霉亲和素磁微粒与生物素标记抗体的质量比为。
12.进一步地，所述生物素标记抗体由待标记抗体、生物素酯、无水n,n-二甲基酰胺溶
剂和第二pb缓冲液制备而成，且所述待标记抗体与生物素酯的摩尔浓度比为1：5～20。
13.进一步地，所述生物素酯为长臂生物素酯，其结构式为：
[0014][0015]
进一步地，所述第一pb缓冲液和第二pb缓冲液的ph值为7.4，浓度为20mmol/l。
[0016]
进一步地，所述碱性磷酸酶标记单克隆抗体母液由单克隆抗体、碱性磷酸酶制备而成。
[0017]
进一步地，所述第一ph缓冲液、第二ph缓冲液和第三ph缓冲液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸、tris-盐酸或三羟甲基氨基甲烷、mopso缓冲剂(3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)中的一种，所述第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第三蛋白质稳定剂和第四蛋白质稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、醇类或糖类中的一种或多种，所述第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂和第四防腐剂为nan3防腐剂、proclin300防腐剂、bnd防腐剂中的一种，所述第一表面活性剂和第二表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、季铵化物、吐温或脂肪酸山梨坦中的一种。
[0018]
本发明又提供了一种上述试剂盒的制备方法，包括：
[0019]
s1.磁微粒抗体工作液的制备，具体为：
[0020]
s11.将链霉亲和素磁微粒包被生物素标记抗体，制得磁微粒母液；
[0021]
s12.将第一ph缓冲液、第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第一防腐剂、氯化钠混合，配制磁微粒稀释液；
[0022]
s13.将磁微粒母液用磁微粒稀释液进行稀释，配制成磁微粒抗体工作液；
[0023]
s2.酶标抗体工作液制备，具体为：
[0024]
s21.使用蛋白连接试剂盒将单克隆抗体与碱性磷酸酶连接起来后进行超滤或脱盐，得到碱性磷酸酶标记单克隆抗体，作为酶标记抗体母液；
[0025]
s22.将第二ph缓冲液、第三蛋白质稳定剂、第四蛋白质稳定剂、第二防腐剂、第一离子、第二离子混合，配制酶标抗体稀释液；
[0026]
s23.用酶标抗体稀释液稀释酶标记抗体母液，配制成酶标抗体工作液；
[0027]
s3.反应模式建立，具体为：
[0028]
s31.检测样本体积优化，确定最优加样体积；
[0029]
s32反应模式：待检样本、磁微粒抗体工作液、酶标抗体工作液，37℃温育反应后，洗涤，加入化学发光底物液，检测光信号值。
[0030]
进一步地，步骤s11中所述的磁微粒母液采用以下方法制备：
[0031]
(1)取链霉亲和素磁微粒并使用第一pb缓冲液清洗三次，然后加入一定体积的第一pb缓冲液；其中加入第一pb缓冲液的体积与链霉亲和素磁微粒的质量有关，如：1mg链霉亲和素磁微粒适用的第一pb缓冲液体积是50μl～400μl；
[0032]
(2)加入生物素标记抗体，配成链霉亲和素磁微粒偶联生物素标记抗体的反应体系，进行包被反应，并在反应结束后在磁场下清洗三次，再用磁微粒保存液重悬，配制成链
霉亲和素磁微粒抗体母液。
[0033]
进一步地，步骤s11中所述的生物素标记抗体采用以下方法制备：
[0034]
(1)配备生物素母液：用无水n,n-二甲基酰胺溶解生物素酯，浓度为1mg/ml；
[0035]
(2)生物素标记工艺：先取待标记抗体，并用第一pb缓冲液替换抗体保存的缓冲液，然后在避光条件下，取已置换第一pb缓冲液的待标记抗体与生物素酯进行混合反应，再进行纯化后，得到生物素标记抗体。
[0036]
本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，先将样本、磁微粒抗体工作液、酶标记抗体工作液顺序加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于25分钟，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50～100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比；
[0037]
或者，先将样本、磁微粒抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后加入酶标记抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50～100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比；
[0038]
又或者，先将样本、酶标记抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后加入磁微粒抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50～100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比；
[0039]
再或者，先将样本、磁微粒抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后进行磁吸附并清洗液清洗三次后，再加入酶标记抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着磁吸附并用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50～100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比。
[0040]
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0041]
本发明通过采用上述技术方案，即可快速搭建稳定的磁微粒化学发光法研发平台，同时具有反应体系小，成本低，反应体系灵活，效率高的优点。
附图说明
[0042]
图1是本发明所述酶促化学发光试剂盒的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
[0043]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0044]
本发明所述的酶促化学发光试剂盒，包括有磁微粒抗体工作液、酶标抗体工作液和清洗液。其中，所述磁微粒抗体工作液由磁微粒母液和磁微粒稀释液配制而成；所述磁微粒母液是链霉亲和素磁微粒抗体母液，所述链霉亲和素磁微粒抗体母液由链霉亲和素磁微
粒、第一pb缓冲液(由于pb缓冲液成份简单，不含影响链霉亲和素-生物素反应的基团，并且成本低，是较为理想的缓冲体系)、生物素标记抗体制备而成，所述生物素标记抗体由待标记抗体(该待标记抗体为单克隆抗体，例如：d-二聚体单克隆抗体)、生物素酯、无水n,n-二甲基酰胺溶剂和第二pb缓冲液制备而成；所述磁微粒稀释液包含第一ph缓冲液、第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第一防腐剂、氯化钠。所述酶标抗体工作液由酶标记抗体母液和酶标抗体稀释液配制而成；所述酶标记抗体母液是碱性磷酸酶标记单克隆抗体母液，所述碱性磷酸酶标记单克隆抗体母液由单克隆抗体、碱性磷酸酶制备而成；所述酶标抗体稀释液包含第二ph缓冲液、第三蛋白质稳定剂、第四蛋白质稳定剂、第二防腐剂、第一离子、第二离子，所述第一离子和第二离子是锌离子、镁离子或钙离子。所述清洗液包含第三ph缓冲液、氯化钠、第一表面活性剂、第二表面活性剂、第三防腐剂和第四防腐剂；而且，所述第一ph缓冲液、第二ph缓冲液和第三ph缓冲液的缓冲范围为ph 5.0～8.5，浓度为10～200mmol/l，所述第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第三蛋白质稳定剂和第四蛋白质稳定剂的质量百分浓度为0.1％～10％，所述第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂和第四防腐剂的质量百分浓度为0.01％～5％，所述第一表面活性剂和第二表面活性剂的质量百分浓度为0.001％～5％。
[0045]
如图1所示，本发明所述试剂盒的制备方法，包括：
[0046]
步骤s100.磁微粒抗体工作液的制备，具体为：
[0047]
s11.将链霉亲和素磁微粒包被生物素标记抗体，制得磁微粒母液；具体采用以下方法制备：
[0048]
(1)取链霉亲和素磁微粒并使用第一pb缓冲液清洗三次，然后加入一定体积的第一pb缓冲液；
[0049]
(2)加入生物素标记抗体，配成链霉亲和素磁微粒偶联生物素标记抗体的反应体系，进行包被反应，并在反应结束后在磁场下清洗三次(采用pb缓冲液清洗)，再用磁微粒保存液重悬，配制成链霉亲和素磁微粒抗体母液；其中磁微粒在包被反应液中的浓度为1-50mg/ml，包被反应条件为避光、常温(20℃～26℃)、反应时间为1～12小时，反应过程最好使用混匀器混匀；所述生物素标记抗体采用以下方法制备：
[0050]
(1)配备生物素母液：用无水n,n-二甲基酰胺溶解生物素酯，浓度为1mg/ml；
[0051]
(2)生物素标记工艺：先取待标记抗体，并用第一pb缓冲液替换抗体保存的缓冲液，然后在避光条件下，取已置换第一pb缓冲液的待标记抗体与生物素酯进行混合反应，再进行纯化后，得到生物素标记抗体；其中在混合反应时反应体系的体积为每0.1mg抗体对应(100～1000)μl，混合反应条件为避光、常温(20℃～26℃)、反应时间为1～12小时，反应过程最好使用混匀器混匀。
[0052]
s12.将第一ph缓冲液、第一蛋白质稳定剂、第二蛋白质稳定剂、第一防腐剂、氯化钠混合，配制磁微粒稀释液；
[0053]
s13.将磁微粒母液用磁微粒稀释液进行稀释，配制成磁微粒抗体工作液；
[0054]
步骤s200.酶标抗体工作液制备，具体为：
[0055]
s21.使用蛋白连接试剂盒将单克隆抗体与碱性磷酸酶连接起来后进行超滤或脱盐，得到碱性磷酸酶标记单克隆抗体(最好加入甘油作为保护剂，并于-20
±
5℃保存)，作为酶标记抗体母液；
[0056]
s22.将第二ph缓冲液、第三蛋白质稳定剂、第四蛋白质稳定剂、第二防腐剂、第一离子、第二离子混合，配制酶标抗体稀释液；
[0057]
s23.用酶标抗体稀释液稀释酶标记抗体母液，配制成酶标抗体工作液；
[0058]
步骤s300.反应模式建立，具体为：
[0059]
s31.检测样本体积优化，确定最优加样体积；
[0060]
s32反应模式：待检样本、磁微粒抗体工作液、酶标抗体工作液，37℃温育反应后，洗涤，加入化学发光底物液，检测光信号值。
[0061]
本发明所述试剂盒的检测方法，共有以下四种。
[0062]
第1种检测方法：先将样本、磁微粒抗体工作液、酶标记抗体工作液顺序加入反应孔/反应杯(优选黑色、背景低、无干扰、低吸附性材质的96孔反应板)中，混合均匀后在37℃下温育小于等于25分钟(比如：在温度可控制为37
±
0.5℃的恒温培养箱、恒温混匀仪或鼓风干燥箱中进行温育，温育时间优选5～25分钟)，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次(少于三次，不能有效清洗干净，多于三次，则时间太久，没有必要，与三次的效果一样。)，最后在每个测试中加入50-100μl化学发光底物液(化学发光底物液优选以amppd、cdps、ecl等为基础进行发光反应的底物液)混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比。
[0063]
第2种检测方法：先将样本、磁微粒抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后加入酶标记抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50-100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比.
[0064]
第3种检测方法：先将样本、酶标记抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后加入磁微粒抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着进行磁吸附后，用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50-100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比。
[0065]
第4种检测方法：先将样本、磁微粒抗体工作液加入反应孔/反应杯中，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，然后进行磁吸附并清洗液清洗三次后，再加入酶标记抗体工作液，混合均匀后在37℃下温育小于等于15分钟，接着磁吸附并用清洗液清洗三次，最后在每个测试中加入50-100μl化学发光底物液混合均匀后，采用化学发光读数仪检测光子值，样本中被测物的含量与光子数成正比。
[0066]
本发明所述试剂盒通过采用磁微粒化学发光免疫分析方法，同时运用双抗体夹心法原理，将样本、单克隆抗体包被的磁微粒、碱性磷酸酶标记的单克隆抗体混合，经过温育反应，使样本中的抗原与双抗体结合，形成“磁微粒-包被抗体-待测样本-标记抗体-酶”夹心复合物，之后引入磁场、洗涤去除未结合的组分、加入化学发光底物液后，底物液被酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，激发态中间体回到基态时释放出光子，发光仪捕获光子信号，由光子信号的强弱对待测物定性或定量检测。
[0067]
综上可见，通过本发明所述试剂盒、制备法和检测方法即可快速搭建稳定的磁微粒化学发光法研发平台，同时具有反应体系小，成本低，反应体系灵活，效率高的优点。
[0068]
下面通过实施例，对本发明所述酶促化学发光试剂盒、制备方法和检测方法做进一步说明。
[0069]
实施例1
[0070]
目的：优化加样体积，反应体系可满足反应性高、测试结果稳定。
[0071]
方法：配制一定浓度的d-二聚体磁微粒抗体工作液与一定浓度的d-二聚体酶标抗体工作液(具体地，该d-二聚体磁微粒抗体工作液用稀释液1稀释d-二聚体磁微粒抗体配制而成，其中稀释液1含缓冲液、离子、蛋白质稳定剂、防腐剂等，制备方法参考步骤s100；该d-二聚体酶标抗体工作液用稀释液2稀释d-二聚体酶标抗体配制而成，其中稀释液2含缓冲液、离子、蛋白质稳定剂、防腐剂等，制备方法参考步骤s200。)，设置4个实验组，加样体积(检测样本的体积)分别为5μl、10μl、20μl、40μl，并行实验；按“样本-50μl磁微粒抗体工作液-50μl酶标抗体工作液”的顺序加入反应孔(管)；混匀后，37℃孵育20min；洗涤3次后，每反应孔(管)加入100μl化学发光底物液，混匀后，检测发光值信号，即采用化学发光读数仪检测光子值，结果见表1，样品1-8是含d-二聚体的待测样本。
[0072]
表1：为不同样本加样体积的反应性数据结果。
[0073][0074][0075]
从表1的实施例1-1至实施例1-4提供的各3次检测结果均值和变异系数可知：当实施例1-2加样体积10μl时，反应性比实施例1-1高，变异系数小，信噪比比实施例1-3高，因此，优选实施例1-2的加样体积。
[0076]
实施例2
[0077]
目的：在实施例1得出的实例例1-2的最优的加样体积、一定的反应体系下，探索较优的反应模式。
[0078]
方法：基于“双抗体夹心法”原理，探讨四种反应模式(即本发明上述的四种检测方法)：
[0079]
实施例2-1，按“10μl样本-50μl磁微粒抗体工作液-50μl酶标抗体工作液”顺序加入反应孔(管)，混匀，37℃温育20min；洗涤3次；
[0080]
实施例2-2，先加入“10μl样本-50μl酶标抗体工作液”于反应孔(管)，混匀，37℃温育10min，再加入“50μl磁微粒抗体工作液”，混匀，37℃温育10min；洗涤3次；
[0081]
实施例2-3，先加入“10μl样本-50μl磁微粒抗体工作液”于反应孔(管)，混匀，37℃温育10min，再加入“50μl酶标抗体工作液”，混匀，37℃温育10min；洗涤3次；
[0082]
实施例2-4，先加入“10μl样本-50μl磁微粒抗体工作液”于反应孔(管)，混匀，37℃温育10min，洗涤3次；再加入“50μl酶标抗体工作液”，混匀，37℃温育10min；洗涤3次；
[0083]
实施例2-1至实施例2-4完成后，在每反应孔(管)加入100μl化学发光底物液，混匀后，检测发光值信号，结果见表2。
[0084]
表2：为四种反应模式检测结果。
[0085][0086]
从表2实施例2-1至实施例2-4提供的各3次检测结果的均值和变异系数可知：实施例2-1和实施例2-2反应性相对高，变异系数小；实施例2-1信噪比比实施例2-2高，因此，优选实施例2-1的反应模式。
[0087]
实施例3
[0088]
目的：验证上述实施例1-2最优体积和实施例2-1最优反应模式的稳定性。
[0089]
方法：以样本9和样本10与磁微粒抗体工作液和酶标抗体工作液用实施例2-1的反应模式实施，重复3次，比较3次实验数据的差异，结果见表3，样本9和样本10是含d-二聚体的待测样本。
[0090]
表3：为重复实验结果
[0091]
[0092][0093]
从表3的实施例3-1至实施例3-3实验结果可知：单次实验的变异系数(cv)≤10％，与实施例3-1的结果差异≤10％。说明手工将“10μl样本-50μl磁微粒抗体工作液-50μl酶标抗体工作液”加于反应孔(管)，混匀后，37℃温育反应20min，磁吸附，洗涤后，加化学发光底物液，检测发光值信号，手工法操作此反应模式数据可靠，化学发光平台稳定，可以实现手工法快速开发。
[0094]
实施例4
[0095]
目的：基于上述稳定性的快速开发方法，筛选出d-二聚体检测试剂盒中包含的实施例1中d-二聚体磁粒抗体工作液和d-二聚体酶标抗体工作液的最适合浓度此过程运用实施例1的最适样本量、实施例2的最优反应模式。
[0096]
方法：固定磁微粒抗体工作液和酶标记抗体工作液的体积，均为50μl，优化两种工作液的浓度，使反应性最优，并且变异系数小。设置梯度浓度的工作液和检测样本的结果如表4和表5。
[0097]
表4为实施例4-1至4-3的磁微粒抗体工作液和酶标记抗体工作液的浓度和检测结果。
[0098][0099][0100]
表5为实施例4-4至4-6的磁微粒抗体工作液和酶标记抗体工作液的浓度和检测结果。
[0101][0102]
从表4和表5可知：实施例4-1至实施例4-3的磁微粒抗体工作液的浓度低，反应不充分；实施例4-4至实施例4-6的磁微粒抗体工作液的，反应性高，3次检测结果的变异系数小；因此，最合适的磁微粒抗体工作液浓度为0.2mg/ml，最合适酶标记抗体工作液浓度为0.5μg/ml。
[0103]
综上，本发明所述的一种酶促化学发光试剂盒及其检测方法，该方法的每个测试使用的磁微粒质量少(10μg)、标记酶的质量少(25μg)，反应体系小，方便快捷，可手工检测，并且重复性好、稳定。
[0104]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。