一种金属离子响应型环状脱氧核酶探针的制作方法

1.本发明属于脱氧核酶探针技术领域，具体涉及一种通过体外筛选方法得到响应金属离子的环状脱氧核酶探针。


背景技术：

2.自从watson和crick在1953年验证了dna的双螺旋结构，人们对遗传的认知便从宏观表象转向分子科学层面。随着分子科学技术手段日益精进，关于dna分子的研究也不断深入，dna双螺旋结构己不仅是遗传信息储存和运输的载体。科研工作者依据指数富集配体系统进化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,selex)或其他方法对文库中的随机dna序列进行筛选，获得了具有特殊功能的dna序列，此类dna被称为功能核酸。
3.功能核酸根据作用机制的不同，主要分为两大类:第一类功能核酸被称为核酸适配体(aptamers)，aptamers可发挥与蛋白质抗体相似的识别功能，能特异性识别金属离子、小分子、蛋白质、细胞、组织甚至是器官，因此常作为识别单元用于功能核酸探针的构建。另一类功能核酸被称为脱氧核酶(dnazymes)，脱氧核酶可与辅酶因子结合(通常为金属离子)，行使与蛋白酶类似的催化功能。由于dna序列的多样性远低于多肽序列，目前脱氧核酶的功能较为单一，常用于单链rna或dna序列的精确剪切，脱氧核酶的催化活性与辅酶因子的种类和浓度相关，因此脱氧核酶探针可用来实现金属离子的检测。
4.此前，已有研究者通过体外筛选得到对金属离子响应的线状脱氧核酶，并在生物传感方面得到了应用，但是线状的dna链在一些特定环境中(如细胞、血清等)不能稳定存在，一定时间内就会发生降解，这样就会使脱氧核酶的应用受到影响。而环状的脱氧核酶没有游离的3’和5’末端，并且很难出现错误折叠，所以在复杂环境中可以稳定存在。因此亟需开发环状的脱氧核酶，可以在复杂的环境中发挥传感作用。


技术实现要素：

5.为了克服上述线状脱氧核酶在复杂环境中难以稳定存在的技术问题，本发明的目的是通过设计的筛选方案获得可识别金属离子的环状脱氧核酶探针。
6.本发明目的是通过以下方式实现：
7.本发明提供了一种可识别金属离子的环状脱氧核酶探针，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列如seq id no:1或seq id no:11所示。
8.进一步地，所述脱氧核酶探针通过t4连接酶成环，能够识别反应体系中的金属离子，探针的的构象发生改变，水解切割序列中最不稳定的rna位点。
9.本发明一方面提供一种可识别金属离子的环状脱氧核酶探针，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列如seq id no:9所示，是通过对seq id no:1所示的核苷酸序列进行删减优化，且仍能保持和seq id no:1所示的环状脱氧核酶探针相同的催化速率。
10.本发明另一方面提供了上述环状脱氧核酶探针的体外筛选方法，主要包括以下步
骤：
11.步骤s1，将磷酸化的底物链、文库酶链和连接链i按摩尔比1:1:(1.2-2)混合，并置于t4连接酶反应体系中，构建线状dna文库；
12.步骤s2，将步骤s1所得的线状dna文库置于含有金属离子的反应体系中，室温孵育，进行反向筛选，分离纯化未切割的dna条带；
13.步骤s3，将步骤s2所得的dna条带和连接链ii按摩尔比1:(1.1-1.5)混合，并置于t4连接酶反应体系中，构建环状dna文库；
14.步骤s4，将步骤s3所得的环状dna文库置于含有金属离子的反应体系中，室温孵育，进行正向筛选，分离纯化切割的dna条带；
15.步骤s5，以步骤s4获得的dna条带为模板进行pcr扩增，并回收正义链；
16.步骤s6，将步骤s5获得的正义链与步骤s1中所述的磷酸化的底物链、连接链i按摩尔比1:1:(1.2-2)混合，按照步骤s1-s5进行重复筛选；
17.步骤s7，计算切割百分比(clv％)，当环状脱氧核酶探针的切割百分比明显高于线状脱氧核酶探针的切割百分比时，对环状脱氧核酶探针的pcr产物进行dna测序，对重复度高的序列进行验证，得到的环状脱氧核酶探针可快速切割底物上的rna位点，且线状脱氧核酶探针很难对底物链上的rna位点进行切割，该序列即为特异性识别金属离子的环状脱氧核酶探针序列。
18.进一步地，所述底物链序列如seq id no:2所示，所述文库酶链序列如seq id no:3所示，所述连接链i序列如seq id no:4所示。
19.进一步地，所述底物链经过t4多聚核苷酸激酶磷酸化处理。
20.进一步地，所述连接链ii的序列如seq id no:5所示。
21.进一步地，步骤s2中，孵育时间为3-5h。
22.进一步地，步骤s4中孵育时间随着筛选的进行，逐渐降低，最初孵育时间为2h。
23.进一步地，步骤s5中所述pcr扩增的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如seq id no:6所示，所示下游引物如seq id no:7或seq id no:8所示。
24.进一步地，所述重复筛选的次数为10～15次。
25.进一步地，采用上述筛选方法可以得到具有高灵敏度和强特异性特点的环状脱氧核酶，且其在线状时催化效率低。
26.进一步地，在筛选过程中不断缩短孵育时间，经过12轮的筛选，逐步降低线状脱氧核酶特异性催化反应的干扰，获得了感应金属离子的环状脱氧核酶。
27.本发明还提供了筛选得到的环状脱氧核酶探针在生物传感方面的应用。
28.进一步地，所述的环状脱氧核酶探针能够识别反应体系中的金属离子，并且在含细胞裂解液和血清的体系中能够稳定保持活性。
29.进一步地，所述的金属离子包括mn
2
、pb
2
、zn
2
和cd
2
。
30.本发明相对于现有的技术效果：
31.(1)本发明获得了多条环状脱氧核酶探针，其在线状时催化效率低，在环状时，脱氧核酶探针信号随时间的延长而增加。
32.(2)本发明提供的脱氧核酶探针稳定性好，可以在生物传感应用方面发挥优势。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单介绍。
34.图1是环状脱氧核酶筛选流程示意图。
35.图2是每一轮筛选切割速率统计图。
36.图3是脱氧核酶l2-1在环状和线状时的动力学表征。
37.图4是脱氧核酶l2-2在环状和线状时的动力学表征。
38.图5是脱氧核酶l2-1(左)和l2-2(右)在环状和线状时动力学曲线拟合。
39.图6是环状脱氧核酶l2-2的金属离子选择性实验。
40.图7是环状脱氧核酶l2-2在10％的牛血清溶液中的稳定性表征。
41.图8是环状脱氧核酶l2-2在细胞裂解液中的稳定性表征。
42.图9是环状脱氧核酶l2-2的二级结构模拟和删减实验。
具体实施方式
43.下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
44.实施例包括dna文库的构建、反向筛选、正向筛选、pcr扩增等，实施例中涉及的核酸名称和序列如表1所示。
45.表1.核酸名称、序列和用途
46.[0047][0048]
实施例1dna文库的构建
[0049]
将合成的底物链(seq id no:2)与pnk酶(t4多聚核苷酸激酶)混合，37℃孵育40min，再加入等摩尔量的酶链(seq id no:3)、1.5倍的连接链(seq id no:4)和t4连接酶，混合均匀，室温反应2小时。反应结束后，加入2.5倍体积的-20℃100％乙醇、0.1倍体积的3mol/l的乙酸钠和1μg/μl的糖原，置于-20℃冰箱冷冻30min。将冷冻后的混合物低温高速离心(4℃，14000rpm，20min)，去除上清液，真空干燥5min后得到固体产物。加入20μl超纯水复溶，经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis,dpage)纯化，通过凝胶成像仪确定目标条带的位置，并切胶回收。向回收的目的条带中加入elution buffer缓冲溶液(5m nacl 1m tris(ph 7.5)0.5m edta(ph 8.0))进行dna洗脱。洗脱液经过冷乙醇沉降、真空干燥和超纯水复溶后得到筛选所需的文库。得到筛选的文库序列如seq id no:10所示。
[0050]
dna建库体系：
[0051]
1)连接底物磷酸化
[0052]
表2.底物磷酸化反应成分表
[0053]
试剂体积(μl)荧光底物(100μm)5atp(100mm)210*pnk buffer5pnk(10u/μl)2水补齐至50
[0054]
2)文库连接底物
[0055]
表3.连接反应成分表
[0056]
试剂体积(μl)dna文库(100μm)5连接链t1(100μm)7.5磷酸化的连接底物50t4连接酶(10u/μl)310*t4连接酶buffer10水补齐至100
[0057]
实施例2体外筛选
[0058]
体外筛选分为反向筛选、连接成环、正向筛选、pcr扩增和连接成库等步骤进行。在12轮筛选后进行克隆测序。具体筛选步骤包括：
[0059]
1、反向筛选
[0060]
将实施例1纯化好的线性文库，加入40μl超纯水溶解。在含有mn
2
离子的反应缓冲溶液中进行反应。
[0061]
表4.反筛反应成分表
[0062]
试剂体积(μl)线状文库402
×
反应缓冲溶液50mn
2
(100mm)10
[0063]
反应前将溶解好的文库在90℃加热2min，冷却至室温。然后加入反应缓冲溶液和mn
2
，反应时长4h。
[0064]
其中2
×
反应缓冲溶液成分：hepes：100mm(ph7.5)nacl：300mm mgcl2：30mm tween20：0.02％(体积分数)kcl：100mm。
[0065]
反应过后的产物进行经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，经过冷乙醇沉淀法得到没有切割的线状文库。
[0066]
2、连接成环
[0067]
将反筛得到的全长序列的线状文库与pnk酶(t4多聚核苷酸激酶)混合，37℃孵育40min，1.2倍的连接链(seq id no:5)和t4连接酶，混合均匀，室温反应2小时。反应结束后，加入2.5倍体积的-20℃100％乙醇、0.1倍体积的3mol/l的乙酸钠和1μg/μl的糖原，置于-20℃冰箱冷冻30min。将冷冻后的混合物低温高速离心(4℃，14000rpm，20min)，去除上清液，真空干燥5min后得到固体产物。加入20μl超纯水复溶，经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
纯化，通过凝胶成像仪确定目标条带的位置，并切胶回收。向回收的目的条带中加入elution buffer缓冲溶液进行dna洗脱。洗脱液经过冷乙醇沉降、真空干燥和超纯水复溶后得到环状文库。
[0068]
dna线状成环体系：
[0069]
1)dna线状文库磷酸化
[0070]
表5.dna线性文库磷酸化反应成分表
[0071]
试剂体积(μl)线性文库(100μm)5atp(100mm)210*pnk buffer5pnk(10u/μl)5水补齐至50
[0072]
2)文库连接底物
[0073]
表6.连接成环反应成分表
[0074]
试剂体积(μl)磷酸化的dna文库50连接链s1(100μm)6t4连接酶(10u/μl)310*t4连接酶buffer10水补齐至100
[0075]
3、正向筛选
[0076]
将环状且纯化好的文库，加入40μl超纯水溶解。在含有mn
2
离子的反应缓冲溶液中进行反应。
[0077]
表7.正筛反应成分表
[0078]
试剂体积(μl)环状文库402
×
反应缓冲溶液50mn
2
(100mm)10
[0079]
反应前将溶解好的环状文库在90℃加热2min，冷却至室温。然后加入反应缓冲溶液和mn
2
，反应时长2h。
[0080]
其中2
×
反应缓冲溶液成分：hepes：100mm(ph7.5)nacl：300mm mgcl2：30mm tween20：0.02％(体积分数)kcl：100mm。
[0081]
反应过后的产物进行经10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化，经过冷乙醇沉淀法得到能够发生切割的dna文库。
[0082]
4、pcr扩增
[0083]
以正向筛选回收的能够发生切割的dna序列为模板，使用正向引物fp和反向引物rp1和rp2通过两步pcr来大量扩增目的序列。pcr产物用10％dpage分离纯化。由于反向引物rp2带有空间子修饰，因此pcr扩增后会得到长度不同的正义链(83nt)和反义链(104nt)，切
胶回收正义链，并测定含量。其中，正向引物fp序列如seq id no:6所示，反向引物rp1和rp2序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。
[0084]
pcr扩增条件
[0085]
表8.pcr扩增条件
[0086]
名称温度(℃)时间(s)hold9560变性9460退火5245延伸7230
[0087]
pcr反应体系：
[0088]
1)pcr1
[0089]
表9.pcr1反应条件
[0090]
试剂体积(μl)文库1前引物l2-fp(100μm)0.5后引物l2-rp1(100μm)0.510*pcr缓冲液5dntps(2.5mm)1taq酶(5u/μl)1水补齐至50
[0091]
2)pcr2
[0092]
表10.pcr2反应条件
[0093]
试剂体积(μl)文库1前引物l2-fp(100μm)0.5后引物l2-rp2(100μm)0.510*pcr缓冲液5dntps(2.5mm)1taq酶(5u/μl)1水补齐至50
[0094]
5、连接成库
[0095]
将合成的底物链(seq id no:2)与pnk酶(t4多聚核苷酸激酶)混合，37℃孵育40min，再加入等摩尔量的pcr扩增后的正义链(酶链)、1.5倍的连接链(seq id no:4)和t4连接酶，混合均匀，室温反应2小时，分离纯化后即得到下一轮筛选的dna文库。
[0096]
用如下公示计算切割百分比(clv％)，用于表征每一轮筛选后dna文库的富集程度，如图2所示。经过多轮筛选，当孵育时间缩短至15min，第12轮环状文库的切割率约为8.53％，线状文库的切割率约为4.35％。dna文库富集完成。
[0097][0098]
其中clv％为切割百分比，clv为dpage胶图中切割条带的量，unclv为dpage胶图中未切割的量。
[0099]
经克隆测序，选取排名前五条序列进行实验验证。找到两条符合目标要求的序列1#(seq id no:12)和2#(seq id no:13)，其对应的脱氧核酶序列分别是l2-2和l2-1。
[0100]
实施例3脱氧核酶性能表征
[0101]
1、切割速率表征
[0102]
测序得到的1#和2#序列与荧光底物rs28连接成环后，在含有锰离子的反应缓冲溶液中孵育。将不同反应时间的样品通过10％dpage胶分离，并计算切割率，如图3、图4和图5所示。通过凝胶电泳图可以发现，1#和2#序列对应的脱氧核酶在线状时切割速率明显低于在环状时的切割速率。
[0103]
2、选择性表征
[0104]
以环状脱氧核酶l2-2为例，其在含有不同二价金属离子的缓冲溶液中孵育30min后，通过10％dpage胶分离，如图6所示。通过凝胶电泳图可以发现，该脱氧核酶对锰离子有强烈响应，对铅离子有部分响应，对其他二价金属离子响应很低。
[0105]
3、稳定性表征
[0106]
以脱氧核酶l2-2为例，其环状和线状结构分别在含有10％牛血清的培养基和人乳腺癌细胞(mcf7)细胞裂解液中(≈106个细胞)孵育不同时间，通过10％dpage胶分离，观察其稳定性，如图7和图8所示。通过凝胶电泳图可以发现，环状脱氧核酶比线状脱氧核酶更稳定。
[0107]
4、序列删减实验
[0108]
将得到的序列l2-2通过软件进行序列模拟，得到其二级结构，并进行序列删减实验，分别对其中的一些loop进行删除，得到不同的序列(l2-n1～n4)，分别在含有锰离子的反应缓冲溶液中孵育30min后，通过10％的dpage胶分离，如图9所示。计算切割率，发现l2-n4(seq id no:9)的切割率与原序列几乎一致。
[0109]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。