一种糖化血红蛋白的时间分辨荧光免疫传感器的制作方法

1.本发明属于医学免疫类领域。特别涉及应用时间分辨荧光免疫传感器检测糖化血红蛋白的领域。


背景技术：

2.糖化血红蛋白(hba1c)可以反映2-3个月的平均血糖水平，是追踪ii型糖尿病最常用的生物标志物，也是糖尿病早期诊断的重要依据。由于其重要的临床研究意义，糖化血红蛋白的定量检测亦受到研究者的广泛关注。
3.目前，已经报道了多种hba1c的检测方法，包括离子交换色谱，硼酸酯亲和色谱，电泳法、免疫法和酶法等。其中，高效液相色谱法(hplc)是hba1c的标准方法。
4.虽然hplc方法比较成熟，但是该方法所需要的样品量相对较大，血液样品的前处理也相对比较复杂，需要具备专业操作经验的工作人员来完成，适用于大型医院和研究机构。而对于偏远地区或者仪器及人员条件不具备的场所，该检测方法的应用依然存在一定的困难。
5.基于抗原抗体特异性结合的免疫法具有灵敏度高、特异性强、样品量少、操作简单等优点，在hba1c的检测领域也有良好的应用。而时间分辨荧光免疫法又因为其独特的检测原理，是免疫法中灵敏度更高的一种方法，被认为是最具研究前景的免疫分析方法之一。
6.基于以上所述，本发明拟应用硼酸对糖化血红蛋白的糖基化部分的特异性识别的特点，合成一种能够特异性识别糖化血红蛋白的功能化eu
3
螯合物，构建一种灵敏度高、特异性强、方便、快捷的时间分辨荧光免疫传感器，为糖化血红蛋白的定量检测提供一种新的方法。


技术实现要素：

7.本发明基于硼酸特异性识别糖化血红蛋白这一原理构建了一种糖化血红蛋白的时间分辨荧光免疫传感器，该方法不仅灵敏、特异、准确，而且样品量少，操作简单，数据读取方便。
8.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
9.a、包被：将血红蛋白单克隆抗体稀释液加入到黑色酶标孔中，3个复孔，孵育，洗涤3次。
10.b、封闭：向上述已包被的酶标板中加入封闭液，孵育，洗涤3次。
11.c、加样：向上述已封闭完成的酶标孔中加入hba1c稀释液，孵育，洗涤3次。
12.d、加功能化的eu
3
螯合物：向上述酶标孔中加入功能化的eu
3
螯合物，孵育，洗涤3次。
13.e、加酸性增强液：向上述酶标板中加入酸性增强液，孵育，检测荧光信号。
14.所述步骤a中的血红蛋白单克隆抗体的浓度为1μg/ml，加入量为100μl。
15.所述步骤a中的血红蛋白单克隆抗体的孵育条件为37℃，2h。
16.所述步骤b中封闭液的组成为bsa的tris-hcl缓冲液。
17.所述步骤b中封闭液加入体积为200μl，孵育条件为37℃，2h。
18.所述步骤c中样品溶液的体积为100μl，孵育条件为37℃，0.5h。
19.所述步骤d中功能化eu
3
螯合物为eu-dtpa-2apba，即连有苯硼酸的eu
3
螯合物，其结构式为式(1)所示：式(1)：功能化eu
3
螯合物的结构
20.所述步骤d中功能化eu
3
螯合物的合成方法为：称取氨基苯硼酸半磺酸盐(apba)和二亚乙基三胺五乙酸二酐(dtpa)溶于无水dmso中，室温搅拌，氮气保护，反应完全后纯化得到dtpa-2apba。再将该反应产物与三氯化铕加热回流，反应完全后纯化，即得。
21.进一步，所述步骤d中功能化eu
3
螯合物的合成方法中，氨基苯硼酸半磺酸盐(apba)和二亚乙基三胺五乙酸二酐(dtpa)摩尔比为3∶1，反应时间为90min。
22.进一步，所述步骤d中功能化eu
3
螯合物的合成方法中，dtpa-2apba与三氯化铕的摩尔比1∶1.2，反应时间为90min。
23.所述步骤d中功能化eu
3
螯合物溶液的体积为100μl，浓度为10μg/ml，孵育条件为37℃，0.5h。
24.所述步骤e中酸性增强液包括β-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)、三辛基氧化磷(topo)和triton x-100。
25.进一步，所述步骤e中酸性增强液β-噻吩甲酰三氟丙酮(tta)浓度筛选方法如下：在每个ep管中加入24μl的topo浓储液，40μl的triton x-100浓储液，59μl冰乙酸，0.5ml的邻苯二甲酸氢钾浓储液后，再向其中加入不同体积的tta浓储液，组成含有不同浓度tta的增强液。然后，在eucl3溶液中，依次加入含有不同浓度梯度tta的增强剂。静置10min，用荧光分光光度计测荧光强度。每个样品平行重复3次。
26.进一步，所述步骤e中酸性增强液三辛基氧化磷(topo)浓度筛选方法如下：在每个ep管中加入100μl的tta浓储液，40μl的triton x-100浓储液，59μl冰乙酸，0.5ml
37.下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。
38.实施案例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件和方法或者制造商所建议的条件予以实施。的邻苯二甲酸氢钾浓储液后，再向其中加入不同体积的topo浓储液，组成含有不同浓度topo的增强液。然后，在eucl3溶液中，依次加入含有不同浓度梯度topo的增强剂。静置10min，用荧光分光光度计测荧光强度。每个样品平行重复3次。
27.进一步，所述步骤e中酸性增强液triton x-100浓度筛选方法如下：在每个ep管中
加入100μl的tta浓储液，12μl的topo浓储液，59μl冰乙酸，0.5ml的邻苯二甲酸氢钾浓储液后，再向其中加入不同体积的triton x-100浓储液，组成含有不同浓度triton x-100的增强液。然后，在eucl3溶液中，依次加入含有不同浓度梯度triton x-100的增强剂。静置10min，用荧光分光光度计测荧光强度。每个样品平行重复3次。
28.所述步骤e中酸性增强液的体积为200μl/孔，孵育条件为37℃，15min。
29.所述步骤e中荧光强度信号由多功能微孔检测仪615nm读出，其激发波长340nm。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
31.1)本发明提供了一种用于检测糖化血红蛋白的时间分辨免疫传感器。该传感器利用了硼酸与糖化血红蛋白糖基化部分特异性识别的特点，结合了抗原抗体免疫亲和的特性，所构建的传感器灵敏度高、特异性强。
32.2)本发明所设计的传感器所需样品量少，样品处理简单、操作方便，检测快速，具有良好的应用前景。
附图说明
33.图1为trfia传感器检测糖化血红蛋白示意图
34.图2为波长615nm处荧光强度随hba1c浓度变化的线性关系图
35.图3为trfia传感器对hba1c的选择性
36.图4为trfia传感器与市售糖化血红蛋白试剂盒检测方法对比柱状图
具体实施方式
39.本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径采购获得。
40.下面结合附图和实例，对本发明传感器及其制备方法、应用作进一步说明。
41.实施例1：hba1c标准曲线的建立，参照附图1-2。
42.本发明的目的是针对现有糖化血红蛋白检测方法的不足，提供一种基于硼酸衍生物和时间分辨免疫分析法的传感器及其制备方法，利用该传感器特异性识别糖化血红蛋白来快速、简捷地定性或定量检测糖化血红蛋白的方法。该时间分辨免疫传感器检测糖化血红蛋白的标准曲线，包括以下步骤：
43.1)将血红蛋白单抗浓储液稀释至1μg/ml，并以100μl的量加入到黑色酶标孔中，重复3个复孔，在37℃下孵育2h。取出孔内溶液，重复洗涤3次。
44.2)将1)包被好的酶标板中每孔加入200μl封闭液，37℃孵育2h，洗涤3次。
45.3)向2)封闭好的酶标板中加样：按照1∶20000、1∶25000、1∶30000、1∶35000、1∶40000、1∶45000、1∶50000、1∶60000、1∶70000、1∶80000十个梯度稀释hba1c浓储液。上述已封闭完成的酶标孔中每孔加入100μl不同浓度的hba1c稀释液，37℃孵育0.5h，洗涤3次。
46.4)向3)加好样的酶标板中加入eu-dtpa-2apba，37℃孵育0.5h，洗涤3次。
47.5)向4)加好eu
3
螯合物的酶标板中加入酸性增强液，37℃孵育15min。
48.6)将5)处理好的酶标板进行荧光检测，激发波长340nm，发射波长为615nm。
49.7)将6)测得的荧光数据对糖化血红蛋白浓度做标准曲线，检测结果如图2。
50.实施例2：trfia传感器对hba1c的选择性实验，参照附图3。
51.1)具体操作与实例1部分相似，仅将hba1c浓储液替换成0.1mm的葡萄糖(gul)、半乳糖(gal)、果糖(fru)溶液，浓度为0.01mm的多巴胺(da)、抗坏血酸(vc)溶液，以及浓度为25μm的hb溶液，浓度为1μm的bsa、hba1c溶液。加入体积相同，其他操作相同，平行样品重复3次。
52.2)将得到的615nm处的荧光信号强度值进行比较，判断该方法对糖化血红蛋白的选择特异性，检测结果如图3。
53.实施例3：溶血液的hba1c浓度测定，参照附图4。
54.1)取10μl溶血液稀释20000倍做为测试样品。
55.2)具体操作与实例1部分相似，仅将hba1c浓储液替换成溶血稀释液进行测试，加入体积相同，其他操作相同，平行样品重复3次。
56.3)将2)测定的结果带入计算公式：计算溶血液中hba1c浓度，并与市售的hba1c试剂盒的检测结果进行比较，检测结果如图4。