一种提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的方法。


背景技术：

2.近年来，由于工业废水和生活污水大量排放，造成水体中的氮素含量不断增加，威胁全球水生生态系统的稳定和饮用水安全。生物脱氮技术因其运行操作简单、效率高和成本低等优点，而作为废水处理普遍的脱氮技术。为了能够使得硝化和反硝化反应在同一时间和空间进行，减少了反应器的体积和缩短了水力停留时间进而降低了污水处理的成本，人们通过研究发现了具有异养硝化-好氧反硝化菌株的存在，从而开发了一种异养硝化-好氧反硝化脱氮新技术。由于好氧反硝化菌生长速度快、环境适应性强和脱氮效率高而获得越来越多人的关注。
3.目前对生物脱氮技术的研究都在于对异养硝化-好氧反硝化菌的筛选上，如中国专利cn107245463b和专利cn109880752b均公开了不同的异养硝化-好氧反硝化菌在脱氮技术中的应用，而目前没有对提高异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮能力进一步的研究。由于在不同的环境中，异氧硝化-好氧反硝化菌受到外界环境条件的影响下除氮特性和除氮能力不同，为了提高异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮能力，研究出能提高异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮能力的方法，且能在不会对微生物脱氮造成影响的情况下，进而提高脱氮效率，是目前在微生物脱氮技术中有望解决和研究的热点问题之一。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种新的提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的方法，从而提高异养硝化-好氧反硝化菌的的脱氮效果。
5.本发明的第二个目的在于提供提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力的方法应用。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
7.本发明从污水处理厂中分离出一株异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体psa6，保藏编号为gdmcc no：61881-b1，分类学命名为：假单胞菌属噬菌体pseudomonas sp.phage，已于2021年8月23日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。其宿主菌采用异养硝化-好氧反硝化菌dnf23(保藏编号为gdmcc no:60713)，所述噬菌体psa6能高效地感染宿主菌，其最佳感染复数为0.0001，在20～50℃活性保持稳定，效价在10
7 pfu/ml以上。进而研究发现在废水中存在的噬菌体会裂解异养硝化-好氧反硝化菌，影响异养硝化-好氧反硝化菌的生长的情况。因此通过对废水中噬菌体进行抑制，降低其对异养硝化-好氧反硝化菌生长的抑制，从而提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力。
8.因此，本发明提供一种提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的方法，先向含有异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体的废水中，投放能抑制异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体增殖且不会
对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质，再向废水中接种异养硝化-好氧反硝化菌的菌液或含菌液的活性成分；或向含有异养硝化-好氧反硝化菌及其噬菌体的废水中，投放能抑制异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体增殖且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质；所述抑制异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体增殖且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质为纳米铁、四氧化三铁、fe
3
或fe
2
。
9.其中，本发明对所述抑制异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体增殖且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质：纳米铁、四氧化三铁、fe
3
或fe
2
都同时进行实验分析，结果表明：纳米铁和纳米四氧化三铁，这两种物质的对异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体的抑制效果没有fe离子的效果好，而fe
2
的抑制效果没有fe
3
的效果好。
10.优选地，所述方法中投放能抑制异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体增殖且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质为fe
3
。
11.优选地，所述方法中抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖的物质fe
3
的浓度为100～300mg/l。
12.优选地，所述方法中抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖的物质fe
3
的温度为15～50℃。
13.优选地，所述方法中抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖的物质fe
3
的ph 为5～11。
14.优选地，所述异养硝化-好氧反硝化菌为dnf23，保藏编号为gdmcc no：60713。
15.优选地，所述异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体为psa6，保藏编号为gdmccno：61881-b1。
16.另外，需要说明的是上述采用的异养硝化-好氧反硝化菌和噬菌体只是作为优选方案，而本研究发现在废水中存在异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体能抑制异养硝化-好氧反硝化菌的生长，且通过抑制废水中的异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体能提高异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮能力，是具有普遍性的，本发明实验还分离和验证了不同的噬菌体和不同的宿主菌，如：异养硝化-好氧反硝化菌株莱茵海默氏菌hnad-02，其保藏编号为gdmcc no：60714、戴尔福特菌dnf-02 其保藏编号为gdmcc no：60362和人苍白杆菌fx02菌株，其保藏编号为 gdmcc no：60062，等一系列的异养硝化-好氧反硝化菌，上述菌株均是本发明前期研究的菌株，均已经过保藏并公开于现有技术中。经过本发明的方法验证，采用上述一系列的异养硝化-好氧反硝化菌，能很好地抑制噬菌体，提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力。也同时在废水中分离出不同的噬菌体，进行验证，也能达到本发明技术方案采用的效果，由于分离的噬菌体过多，本发明就不一一进行保藏说明。
17.本发明提供一种提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮的方法在废水处理或生物脱氮技术中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明研究发现废水中存在的噬菌体会影响异养硝化-好氧反硝化菌的生长，通过对废水中噬菌体的抑制，可以提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力，且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响。本研究发现通过向含有噬菌体的废水中，投放一种物质来抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体的增殖，可以提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力。研究发现通过投放纳米铁、四氧化三铁、fe
3
或fe
2
这几种物质都能很好地抑制噬菌体的增
值，其中采用fe
3
来抑制噬菌体活性效果最优，在fe
3
浓度为100～300mg/l，12h内使异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体完全失效，不会对废水中的异养硝化-好氧反硝化菌产生毒害作用，还会与脱氮菌相互作用以提高脱氮效果。
20.在含有异养下硝化-好氧反硝化菌和噬菌体的系统中加入fe
3
，反应60h对 nh
4 -n和tn的去除率约提高50％左右。该方法可以解决异养硝化-好氧反硝化脱氮菌在实际工程应用中脱氮效率低的问题，可以运用到大规模废水处理中，在保证脱氮效率的同时可以降低废水成本并且减少废水处理厂的占地面积。
附图说明
21.图1为本发明噬菌体psa6生长曲线图。
22.图2为fe
3
对噬菌体psa6抑制图。
23.图3为不同温度下fe
3
对噬菌体的抑制情况图。
24.图4为不同ph条件下fe
3
对噬菌体的抑制情况图。
25.图5为噬菌体psa6对氨氮去除的影响图。
26.图6为噬菌体psa6对总氮的去除影响图。
具体实施方式
27.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
28.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
29.实施例1废水中噬菌体的分离
30.(1)制备污水样品
31.将收集的污水进行处理，4℃12000r/min离心10min，取离心后的上清液通过0.22um滤膜过滤，滤液即为处理过的污水样品。
32.(2)制备异养硝化-好养反硝化菌悬液
33.将实验室保存的异养硝化-好养反硝化菌dnf23(于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmcc no:60713。)通过三区划线法接种于异养硝化固体培养基上，置于生化培养箱培养两天，用无菌环挑取菌株接种于异养硝化液体培养基中，放置于恒温振荡器中过夜培养。将菌株培养液于6000r/min，10min离心，收集菌体，用无菌水重悬菌体，制备dnf23菌液。
34.(3)噬菌体检测分离：
35.采用双平板法进行噬菌体的分离，取污水样品0.5ml和异养硝化-好养反硝化菌悬液0.5ml混合均匀后，放置15min后铺双平板，放于37℃培养箱培养24h 后，平板上有透明斑出现。从平板上用无菌环挑取单个透明区域明显、形态标准的噬菌斑加入到sm缓冲液中，经过对噬菌体的分离鉴定，该噬菌体为psa6，于2021年8月23日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为gdmcc no：61881-b1。次日于4℃12000r/min离心10min，取上清液用双层平板法重复上述步骤6～8次，直至出现大小均一的噬菌斑，在平板上形成的噬菌斑的直径约为2mm～3mm。在平板上挑取噬菌斑加入到sm缓冲液中，得噬菌体psa6 增值液。
36.本发明分离得到的噬菌体psa6，分类学命名为：假单胞菌属噬菌体 pseudomonas sp.phage，已于2021年8月23日于广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为gdmcc no：61881-b1，保藏地址为广东省广州市先烈中路 100号。
37.实施例2噬菌体的测定
38.(1)最佳感染复数测定
39.取实施例1中得到的噬菌体psa6增殖液与dnf23菌液以moi为0.000001、 0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10的比例接种至lb液体培养基中，置于恒温振荡器中过夜培养。次日取培养液，4℃12000r/min离心10min，取上清液通过0.22um滤膜过滤，滤液通过双层平板法测定噬菌体psa6效价。
40.最佳感染复数是指感染发生之前，噬菌体与宿主菌数量的比值，以产生最高噬菌体效价的moi为最佳感染复数测定。结果由表1可知，噬菌体psa6的最佳感染复数为0.0001。
41.表1噬菌体psa6的测定效价
[0042][0043]
(2)噬菌体生长曲线测定
[0044]
确定了噬菌体psa6对异养硝化-好氧反硝化菌dnf23的最佳感染复数，将噬菌体psa6与dnf23菌接种到lb液体培养基中，置于恒温振荡器中培养，从 0min开始每隔10min，取培养液4℃12000r/min离心10min，取上清液使用双层平板法，测定噬菌体在每个时间点的效价。
[0045]
测定结果由图1可知，噬菌体psa6的潜伏期为5min，裂解期75min，经计算得到其爆发量为2.77pfu/ml。
[0046]
本实验还研究了废水中不同的噬菌体和不同的宿主菌，进行分离和验证后，证明噬菌体能抑制异养硝化-好氧反硝化菌的生长。在废水中存在的多种噬菌体，经过分离验证后，能抑制住宿主菌的生长，如抑制宿主菌：异养硝化-好氧反硝化菌株莱茵海默氏菌hnad-02其保藏编号为gdmcc no：60714、戴尔福特菌 dnf-02其保藏编号为gdmcc no：60362和人苍白杆菌fx02菌株其保藏编号为gdmcc no：60062等，上述菌株均是本发明前期研究的菌株，均已经过保藏并公开于现有技术中。同时在废水中分离出不同的噬菌体，采用本方法进
行验证，都表明分离出不同的噬菌体都能抑制异养硝化-好氧反硝化菌的生长，由于分离的噬菌体过多，本发明就不一一进行保藏说明。
[0047]
由此可知，本研究发现废水中存在异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体，通过废水中检测分离出的噬菌体会裂解异养硝化-好氧反硝化菌，影响异养硝化-好氧反硝化菌的生长。
[0048]
实施例3fe
3
抑制噬菌体增殖的测定
[0049]
采用氯化铁，配制含有不同浓度fe
3
(0、100mg/l和300mg/l)的lb液体培养基，将噬菌体psa6与dnf23菌以最佳感染复数接种至液体培养基中。培养液置于恒温振荡器中，在25℃120r/min条件下培养48h。同时设置空白组和平行实验。从0h开始每隔12h分别取培养液，12000r/min离心10min，过滤后，测定上清液中噬菌体的效价。
[0050]
结果由图2可知，用浓度为100mg/l和300mg/l的fe
3
作用噬菌体psa6，在12h内其效价降至0，表明fe
3
对噬菌体具有去除作用。
[0051]
实施例4不同温度条件fe
3
抑制噬菌体增殖的测定
[0052]
采用氯化铁，配制fe
3
浓度为100mg/l的lb液体培养基，将噬菌体psa6 与dnf23菌以最佳感染复数接种至液体培养基中。培养液置于恒温振荡器中，在温度分别为15℃和50℃，转速为120r/min条件下培养48h。同时设置空白组和平行实验。从0h开始每隔12h取各培养液，12000r/min离心10min，过滤后，测定上清液中噬菌体的效价。
[0053]
结果由图3可知，当温度为15℃和50℃条件下，fe
3
作用噬菌体psa6，12 h内其效价均降至0，说明用fe
3
对抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖在较广的温度范围内均适用且具有较好的效果。
[0054]
实施例5不同ph条件fe
3
抑制噬菌体增殖的测定
[0055]
采用氯化铁，配制fe
3
浓度为100mg/l，ph分别为5和11的lb液体培养基，将噬菌体psa6与dnf23菌以最佳感染复数分别接种至上述液体培养基中。培养液置于恒温振荡器中，在温度分别为25℃，转速为120r/min条件下培养48 h。同时设置空白组和平行实验。从0h开始每隔12h取各培养液，12000r/min 离心10min，过滤后，测定上清液中噬菌体的效价。
[0056]
结果由图4可知，当ph为5和11条件下，fe
3
作用噬菌体psa6，12h内其效价均降至0，说明用fe
3
对抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖适用于在较广的ph范围的废水处理且具有较好的效果。
[0057]
实施例6fe
3
胁迫下噬菌体对异养硝化-好氧反硝化的脱氮能力的影响
[0058]
采用氯化铁，配制fe
3
浓度为100mg/l硝化培养基和不含fe
3
的硝化培养基，将噬菌体psa6与dnf23菌以最佳感染复数分别接种至上述液体培养基中。培养液置于恒温振荡器中，在温度为25℃，转速为120r/min条件下培养72h。同时设置空白组和平行实验。从0h开始每隔12h取培养液，12000r/min离心10min，过滤后，测定上清液中噬菌体的nh
4 -n和tn的浓度。
[0059]
结果如图5和图6所示，同时存在异养硝化-好氧反硝化菌和噬菌体中的 nh
4 -n和tn在60h的去除率分别为42.75％和46.71％，在加入fe
3
后，系统对 nh
4 -n和tn的去除率提高约50％，能达到95％以上。结果表明添加fe
3
不仅可以抑制废水中噬菌体，还能提高异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力，且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响。
[0060]
同时，本发明还采用实施例2中不同的噬菌体和宿主菌，通过本发明的方法进行验证，结果显示采用本发明的方法能很好地抑制噬菌体的增值，提高异养硝化-好氧反硝化菌
脱氮能力。另外，本发明还对纳米铁、四氧化三铁和fe
2
也进行实验验证，结果表明这几种物质都能很好地抑制噬菌体的增值，提高异养硝化
ꢀ‑
好氧反硝化菌脱氮能力。
[0061]
本研究发现通过向废水中投放fe
3
对噬菌体psa6有抑制作用，且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响，在含有异养下硝化-好氧反硝化菌和噬菌体中加入fe
3
，在反应60h对nh
4 -n和tn的去除率约提高50％左右；进一步研究fe
3
与噬菌体作用的条件，筛选出在fe
3
浓度为100～300mg/l，15～50℃， ph为5～11的条件下能抑制噬菌体psa6的活性，从而提高异养硝化-好氧反硝化菌的生长，提高脱氮技术的效果。
[0062]
综上所述，本发明发现在废水中存在异养硝化-好氧反硝化菌噬菌体能抑制异养硝化-好氧反硝化菌的生长，从废水中筛选出噬菌体能够高效感染异养硝化
‑ꢀ
好氧反硝化菌；向含有噬菌体的废水中，投放能抑制异养硝化-好氧反硝化噬菌体增殖的物质且不会对异养硝化-好氧反硝化菌脱氮造成影响的物质，能提高异养硝化-好氧反硝化菌的脱氮能力。
[0063]
以上所述仅为本发明的优选实施例，上述实施例并不能限制本发明的实施范围。熟悉本领域的相关技术人员对以上实施例做出的修改或替换都属于本发明的保护范围之内。