用于癌症免疫疗法的组合物和方法与流程

1.本技术要求2019年09月03日提交的美国临时专利申请no.62/895,421和2019年04月01日提交的美国临时专利申请no.62/827,429的优先权。这些和所有其他引用的外部材料在此通过引用全部引入本技术中。如果所引用的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则以本文提供的该术语的定义为准。
2.技术领域
3.本发明属于营养补充剂技术领域，特别涉及营养补充剂在用于癌症治疗的免疫疗法中的应用。


背景技术：

4.背景说明包括可能有助于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或隐含引用的任何出版物是现有技术。
5.治疗癌症的免疫疗法利用患者自身免疫系统的元素来治疗疾病。此类免疫疗法可以涉及施用在再次施用前从患者取回并处理的抗体、细胞因子和/或细胞。
6.免疫疗法中使用的抗体通常针对肿瘤细胞表达的细胞表面标志物，以激活机体的补体系统或以其他方式识别免疫系统的细胞。或者，这种抗体可以指向细胞表面受体，并干扰癌细胞对t细胞活性的下调。用于此目的的抗体包括alemtuzumab(阿伦单抗，一种针对cd52并激活补体的单克隆抗体)、atezomlizumab(阿特珠单抗，一种针对pd-l1并干扰t细胞失活的单克隆抗体)和ilipimumab(一种针对ctla4并使t细胞平衡向细胞毒性转变的单克隆抗体)。不幸的是，这些治疗性抗体的使用会带来不必要的副作用，包括自身免疫性疾病的沉淀、感染率增加和神经系统疾病。
7.利用细胞因子的免疫疗法旨在激发对肿瘤细胞的免疫反应，肿瘤细胞本身可以产生降低免疫反应的细胞因子。用于免疫疗法的细胞因子包括ifnα(用于治疗毛细胞白血病、艾滋病相关的卡波西肉瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性粒细胞白血病和黑色素瘤)、ifnβ和白细胞介素2(用于治疗恶性黑色素瘤和肾细胞癌)。虽然已知这些细胞因子对免疫系统有多种影响，但它们攻击癌症的确切机制尚不清楚。不幸的是，这些细胞因子的施用与流感样症状的产生有关。
8.利用细胞的免疫疗法包括从患者体内取出细胞，在培养物中激活和扩增细胞，并将激活的细胞返还给患者。例如，provenge(普列威)用于治疗前列腺癌，包括通过白细胞分离从血液中去除抗原呈递树突状细胞，将它们与由gm-csf和前列腺酸性磷酸酶的成分制成的融合蛋白一起孵育，然后再输注。由此产生的针对免疫系统的癌症特异性抗原递呈的改善旨在改善免疫反应。在另一种方法中，car-t免疫疗法去除t细胞，并对其进行遗传修饰，以表达特异性识别靶向癌细胞的嵌合受体。这些经过修饰的t细胞被送回患者体内，希望它们能选择性地靶向癌细胞。不幸的是，这种方法既昂贵又耗时，且会导致类似流感的症状，并且产生了好坏参半的结果。
9.因此，当前仍然需要一种简单且耐受性良好的免疫疗法来治疗癌症。


技术实现要素：

10.本发明的主题提供的是组合物和方法，在其中提供了调节免疫检查点蛋白、免疫治疗靶点、与血管生成相关的蛋白和/或与癌细胞转移相关的蛋白的表达的营养补充剂，所述癌细胞对化学治疗具有抗性。这种癌细胞可以存在于组织培养物中或作为肿瘤存在。这种营养补充剂可以与化学治疗药物和/或放射治疗联合使用。
11.本发明构思的一个实施方案是一种通过施用营养补充剂向患有癌症(其可能是耐药性的)的个体提供免疫治疗的方法，所述营养补充剂包含硒和鱼油(例如，如表1所示)，其量足以改变与抗肿瘤免疫功能相关的生物标志物的表达。营养补充剂在没有化学治疗和/或没有放射治疗的情况下提供。在一些实施方案中，营养补充剂与放射治疗联合提供，从而在改变生物标志物的表达方面提供协同效应。合适的生物标志物包括axl、hsp90、p-mtor、pdl-1、egfr、hdac1、p-h2x、p-akt、psmad、mtor、p-pten、p-stat3、cxcr4和stat3。在一些实施方案中，pd-1、ctla4、foxp3、cd8、pten和/或p-p53的表达量增加。在一些实施方案中，cd4的表达与cd8的表达的比率降低。在一些实施方案中，个体脾脏中cd
3
t细胞、cd
3
cd
4
t细胞或cd
4
cd
8
t细胞的百分比增加。在本发明构思的一些实施方案中，由营养补充剂提供的免疫疗法降低了肿瘤细胞中与干细胞特征或转移潜能相关的生物标志物的表达，例如cd24、cd29、cd31、血管内皮生长因子(vegf)和基质金属蛋白酶-9(mmp-9)。
12.本发明构思的另一个实施方案是激活免疫细胞以增强抗肿瘤活性的方法，该方法通过从待接受癌症治疗的个体中分离免疫细胞，将分离的免疫细胞与激活制剂接触，该激活制剂包含有效量的硒和鱼油以调节与免疫细胞激活相关的蛋白质的表达，从而产生激活的免疫细胞，并将激活的免疫细胞返回给个体。合适的配方和/或其元素如表1所示。在本发明构思的一些实施方案中，活化的免疫细胞进行克隆性扩增以产生活化的免疫细胞群体，该群体返回给个体。在一些实施方案中，免疫细胞在与活化制剂接触之前进行克隆性扩增。在一些实施方案中，免疫细胞和/或活化的免疫细胞在返回个体之前被遗传修饰。在一些实施方案中，在分离免疫细胞之前对个体进行辐照。
13.本发明构思的另一个实施方案是一种通过施用包含硒和鱼油的补充剂(如表1所示的补充剂)来调节细胞中免疫检查点或免疫治疗相关蛋白表达的方法。该补充剂可以提供至少200ng/ml的硒浓度。该补充剂可以提供至少75μm的鱼油浓度。合适的鱼油包括含有重量比约为2:3的dha和epa。该细胞可以是癌细胞，其可以具有干细胞特征和/或对化学治疗药物有抗性。在一些实施方案中，该方法包括给细胞施用化学治疗药物和/或施用放射治疗。在这样的实施方案中，补充剂可以在放射治疗开始之前给药。
14.所述调节可以是表达的降低，例如当免疫检查点或免疫治疗相关蛋白是pd-l1、p-hsp27、波形蛋白、p-mtor、p-p38、β-连环蛋白、abcg2、cd133、n-钙粘蛋白、p-met、cox-2、grp78、cd24、cd29、egfr、hdac1、p-h2x、p-akt、mmp-9、ctla4、cd28、cd86、c31和/或stat3时。调节可以是表达的增加，其中免疫检查点或免疫治疗相关蛋白选自pd-1、p-ampkα、e-钙粘蛋白、chop、foxp3、nkp46、cd8、il2和/或pten。
15.本发明构思的另一个实施方案是通过给动物施用包含硒和鱼油的营养补充剂(如表1所示的补充剂)和给动物施用化学治疗来减少患癌动物中循环肿瘤细胞的方法。该补充剂可以提供至少200ng/ml的硒浓度。该补充剂的施用可以提供至少75μm的鱼油浓度，其优选具有重量比约为2:3的dha和epa。
16.本发明构思的另一个实施方案是使用包含硒和鱼油的补充剂来调节细胞中免疫检查点或免疫治疗相关蛋白的表达。该补充剂可以在给药后为细胞提供至少200ng/ml的硒浓度。该补充剂可以在给药后为细胞提供至少μm的鱼油浓度。鱼油优选包含重量比约为2:3的dha和epa。该细胞可以是癌细胞，例如具有干细胞特征的癌细胞和/或对化学治疗药物有抗性的癌细胞。在一些实施方案中，所述补充剂可与化学治疗药物联合使用和/或与放射治疗联合使用。在这样的实施例中，补充剂可以在放射治疗开始之前使用。
17.所述调节可以是表达的减少，例如当免疫检查点或免疫治疗相关蛋白是pd-l1、p-hsp27、波形蛋白、p-mtor、p-p38、β-连环蛋白、abcg2、cd133、n-钙粘蛋白、p-met、cox-2、grp78、cd24、cd29、egfr、hdac1、p-h2x、p-akt、mmp-9、ctla4、cd28、cd86、c31和/或stat3时。调节可以是表达的增加，例如当免疫检查点或免疫治疗相关蛋白是pd-1、p-ampkα、e-钙粘蛋白、chop、foxp3、nkp46、cd8和/或pten时。
18.本发明构思的另一个实施方案是包含硒和鱼油的营养补充剂与化学疗法组合用于减少患有癌症的动物中的循环肿瘤细胞的用途。营养补充剂在给药后提供至少200ng/ml的硒浓度。该营养补充剂在给药后可以提供至少75m的鱼油浓度。在优选的实施方案中，鱼油包含重量比约为2:3的dha和epa。
19.根据下面对优选实施方式的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，在附图中，相同的数字代表相同的组件。
附图说明
20.图1：易瑞沙(iressa)抗性(耐药)的机制和标志物。
21.图2：使用包含硒和鱼油的营养补充剂治疗24小时后，在对耐易瑞沙的肺癌细胞中axl表达的降低。
22.图3：axl表达和处理的调节。
23.图4：axl和hsp90在易瑞沙敏感性和耐易瑞沙肺癌细胞系中的表达。
24.图5a～5e：图5a：用包含硒和鱼油的营养补充剂治疗72小时后，耐易瑞沙肺癌细胞中axl和hsp90表达的降低。虽然单独的易瑞沙没有明显的效果，但共同治疗的协同作用是明显的。图5b：通过硒和鱼油的组合使用对a549人肺癌球形细胞中诱导的热休克蛋白表达的负调节。图5c：abcg 2、cd133和cd44在对化学治疗药物有抗性的细胞中的过度表达。图5d：在存在和不存在1μm易瑞沙的情况下，通过硒和鱼油的组合使用，在耐化学治疗的人肺癌细胞中诱导p-p38、p-hp27、β-连环蛋白、abcg2、cd1333、n-钙粘蛋白和e-钙粘蛋白表达的调节。图5e：在存在和不存在0.1μm易瑞沙的情况下，通过硒和鱼油的组合使用在耐化学治疗的人肺癌细胞中诱导p-met、β-连环蛋白、cox-2、grp78、p-p38、p-ampkα的调节、和chop的表达。
25.图6a和6b：图6a：72小时后，含硒和鱼油的营养补充剂对耐药hcc827gr细胞中磷酸化mtor(p-mtor)的影响。图6b：通过硒和鱼油的组合使用，在耐化学治疗的人肺癌细胞中诱导的pd-l1表达的负调节。
26.图7a～7c：图7a：通过用含有硒和鱼油的营养补充剂治疗72小时，人肺癌细胞中pd-l1表达的降低。图7b：暴露于鱼油和硒72小时对a549球形细胞中pd-l1表达的影响。图7c：用硒和鱼油处理后对干细胞样球形细胞中pdl-1和pd-1表达的影响(与化学治疗药物联
合治疗和不联合治疗)。
27.图8a和8b：图8a：使用包括硒和鱼油的营养补充剂对三阴性乳腺癌动物肿瘤模型中pd-l1表达的调节。当与化学治疗药物联合使用时，协同效应明显。图8b：使用包括硒和鱼油的营养补充剂对三阴性乳腺癌的动物肿瘤模型中原发性(肿瘤)和转移性(乳腺)部位中pd-l1和pd-1表达的调节。当与化学治疗药物联合使用时，协同效应明显。
28.图9a～9j：图9a：在使用不同量的硒和鱼油补充剂的动物模型中，评估免疫治疗靶蛋白与使用化学治疗剂的协同疗法的调节的典型方案。图9b：包括硒和鱼油的不同剂量营养补充剂对原发性乳腺癌组织中pd-1、pd-l1、ctla4和foxp3表达影响的体内研究。图9c：在动物肿瘤模型中，使用不同量的硒和鱼油结合阿瓦斯汀(avastin)或紫杉醇(taxol)来调节肿瘤cd24的表达。图9d：在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇组合来调节肿瘤cd29的表达。图9e：在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油结合阿瓦斯汀或紫杉醇来调节肿瘤egfr表达。图9f：在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇组合来调节肿瘤p-mtor的表达。图9g：在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与紫杉醇组合来调节肿瘤hdac1和p-h2x的表达。图9h：在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油结合阿瓦斯汀或紫杉醇来调节肿瘤p-akt表达。图9i：通过硒和鱼油的联合使用诱导a549人肺癌球形细胞波形蛋白表达的负调节。图9j：通过硒和鱼油联合使用诱导a549人肺癌球形细胞p-ampkα表达的正调节和p-mtor表达的负调节。
29.图10a～10e：图10a：结合含有鱼油和硒的营养补充剂的基于抗体的抗肿瘤免疫疗法的研究设计。图10b：h2抗pd-1抗体(一种包括鱼油和硒的营养补充剂)，以及该抗体和补充剂的组合对在荷瘤小鼠脾脏中发现的cd
3
t细胞百分比的影响。图10c：h2抗pd-1抗体(一种包括鱼油和硒的营养补充剂)，以及该抗体和补充剂的组合对在荷瘤小鼠脾脏中发现的cd
3
/cd
4
t细胞百分比的影响。图10d：h2抗pd-1抗体(一种包括鱼油和硒的营养补充剂)，以及该抗体和补充剂的组合对在荷瘤小鼠脾脏中发现的cd
3
/cd
4
t细胞百分比的影响。图10e：h2抗pd-1抗体(一种包括鱼油和硒的营养补充剂)，以及该抗体和补充剂的组合对在荷瘤小鼠脾脏中发现的树突状细胞百分比的影响。
30.图11：本发明构思的营养补充剂与紫杉醇或阿瓦斯汀组合的典型给药方案。
31.图12：用含有不同量的硒和不同化学治疗剂的营养补充剂配方共同处理的荷瘤小鼠的血浆硒浓度。
32.图13：从用含有不同量的硒和不同化学治疗剂的营养补充剂配方共同处理的荷瘤小鼠中获得的肿瘤组织中的硒浓度。
33.图14：用化学治疗剂和含有鱼油和不同量的硒的营养补充剂治疗的荷瘤动物肿瘤中egfr表达的降低。
34.图15：用化学治疗剂和含有鱼油和不同量硒的营养补充剂治疗的荷瘤动物肿瘤中p-mtor的降低。
35.图16：用化学治疗剂和含有鱼油和不同量的硒的营养补充剂治疗的荷瘤动物肿瘤中组蛋白脱乙酰酶1(hdac1)和p-h2x的减少。
36.图17：在用化学治疗剂和含有鱼油和不同量的硒的营养补充剂治疗的荷瘤动物的肿瘤中，在ser473或thr308处磷酸化的p-akt减少。
37.图18：在用化学治疗剂和含有鱼油和不同量的硒的营养补充剂治疗的荷瘤动物的
肿瘤细胞核中p-smad的减少。
38.图19a和19b：图19a：包括硒和鱼油的营养补充剂对乳腺癌组织中cd24和cd29表达影响的体内研究。图19b：包括硒和鱼油的不同剂量的营养补充剂对乳腺癌组织中cd 24和cd29表达影响的体内研究。
39.图20：包括硒和鱼油的不同剂量的营养补充剂对转移性脑肿瘤部位中vegf、cd24、cd29和mmp-9表达影响的体内研究。
40.图21a和21b：图21a：植入人肺癌细胞的小鼠中转移性组织的相对cd31表达水平。c＝对照(未植入肿瘤细胞)，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物。图21b：植入人肺癌细胞的小鼠中原发肿瘤部位组织的相对cd31表达水平。c＝对照(未植入肿瘤细胞)，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物。
41.图22a和22b：图22a：植入人肺癌细胞的小鼠中转移性组织的相对cd8表达水平。c＝对照(未植入肿瘤细胞)，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物。图22b：植入人肺癌细胞的小鼠中原发肿瘤部位组织的相对cd8表达水平。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物。
42.图23a和23b：图23a：植入人肺癌细胞的小鼠中转移性组织的相对cd4/cd8表达水平。c＝对照(未植入肿瘤细胞)，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物。图23b：植入人肺癌细胞的小鼠中原发性肿瘤组织的相对cd4/cd8表达水平。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物。
43.图24a和24b：图24a：植入人肺癌细胞的小鼠中转移性组织的ctla4表达水平。c＝对照(未植入肿瘤细胞)，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝植入前用含硒和鱼油的营养
补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝植入前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝植入时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并经放射治疗的肿瘤植入动物。图24b：植入人肺癌细胞的小鼠中原发肿瘤组织中ctla4的表达水平。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的肿瘤植入动物，tr＝经放射治疗的肿瘤植入动物，ptrn＝移植前用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物，trn＝移植时用含硒和鱼油的营养补充剂治疗并放射治疗的肿瘤植入动物。
44.图25a和25b：图25a：乳腺癌动物模型肿瘤中pd-1和pd-l1的表达。用含有硒和鱼油(-n)、紫杉醇(-tax)、阿霉素(-adyri)、阿瓦斯汀或化学治疗剂和营养补充剂的组合的营养补充剂治疗动物。直方图表示相对于未治疗肿瘤中的表达进行的标准化。图25b：乳腺癌动物模型肿瘤中pd-1与pd-l1表达的比率。用含有硒和鱼油(-n)、紫杉醇(-tax)、阿霉素(-adyri)、阿瓦斯汀或化学治疗剂和营养补充剂的组合的营养补充剂治疗动物。
45.图26：含硒和鱼油补充剂的人体临床试验。接受低剂量补充剂(g1)的受试者显示在左侧，中等剂量补充剂(g2)显示在中央，高剂量补充剂(g3)显示在右侧。结果表示为在研究的第1周和第16周之间白细胞pd-1含量相对于肿瘤细胞pdl-1含量的变化。
46.图27：化学治疗剂和以低(-s)、中(-m)和高(-h)剂量提供的含硒和鱼油的营养补充剂共同治疗的效果。左侧显示了用紫杉醇治疗的动物受试者的肿瘤结果；右侧显示了从用阿瓦斯汀治疗的动物的肿瘤样品中获得的结果。
47.图28：化学治疗剂和以低(-s)、中(-m)和高(-h)剂量提供的含硒和鱼油的营养补充剂化学治疗剂共同治疗的效果。左侧显示了用紫杉醇治疗的动物受试者的肿瘤结果；右侧显示了从用阿霉素处理的动物获得的肿瘤样品获得的结果。相对于未处理对照的定量显示在每个条带下方。
48.图29：化学治疗剂和以低(-s)、中(-m)和高(-h)剂量提供的含硒和鱼油的营养补充剂共同治疗对肿瘤cxcr4表达的影响。图中显示了用阿瓦斯汀和阿瓦斯汀与含硒和鱼油的营养补充剂共同治疗的动物受试者的肿瘤结果。相对于未处理对照的定量显示在每个条带下方。
49.图30：放射治疗和含有硒和鱼油的营养补充剂的共同治疗的典型研究设计。
50.图31a和31b：图31a：在肺癌动物模型中，放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对肺组织中cd8表达的影响。c＝未处理对照，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。图31b：在肺癌动物模型中，放射治疗和含硒和鱼油的营养补充剂治疗对原发性肿瘤植入部位中cd8表达的影响。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，
trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。
51.图32a和32b：图32a：在肺癌动物模型中，放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对肺组织的cd4/cd8比率的影响。c＝未处理对照，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。图32b：在肺癌动物模型中，放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对原发性肿瘤植入部位中cd4/cd8比率的影响。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。
52.图33：在肺癌动物模型中，放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对原发性肿瘤植入部位中stat3表达的影响。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。
53.图34：放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对肺癌动物模型中原发性肿瘤植入部位pten表达的影响。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。
54.图35a和35b：图35a：在肺癌动物模型中，放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对原发性肿瘤植入部位中ctla-4表达的影响。t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。图35b：放射治疗和用含硒和鱼油的营养补充剂治疗对肺癌动物模型中肺组织ctla-4表达的影响。c＝未处理对照，t＝植入未经治疗的肿瘤细胞，ptn＝立即用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tn＝第8天用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗的植入的肿瘤细胞，ptrn＝在第8天开始用营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，tr＝在第8、10和12天开始放射治疗并立即开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞，trn＝第8、10和12天开始放射治疗并在第8天开始营养补充剂治疗的植入的肿瘤细胞。
55.图36：使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合治疗的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤
中免疫检查点、血管生成和侵袭性相关蛋白的剂量依赖性调节的研究结果。
56.图37：使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合治疗的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中免疫检查点、血管生成和侵袭性相关蛋白的剂量依赖性调节的研究结果。
57.图38：使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合治疗的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中nkp46的剂量依赖性调节的研究结果。
58.图39：使用硒和鱼油与紫杉醇或阿瓦斯汀组合的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中cd28、cd86和cd80的剂量依赖性调节的研究结果。
具体实施方式
59.以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。不承认此处提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或隐含引用的任何出版物都是现有技术。
60.本发明的主题提供了组合物和方法，其中使用营养补充剂(例如包含铬和某些植物来源材料(nutrawell)的补充剂和/或包含硒酵母肽复合物和鱼油的补充剂)来提供免疫治疗效果，这可以通过调节常规免疫治疗药物靶向的细胞表面标志物来证明。在一些实施方案中，这种营养补充剂与其他抗肿瘤疗法如放射和/或化学治疗剂联合应用。在一些实施方案中，这种共同治疗可以显著地在调节用作免疫治疗靶点的细胞表面标志物方面产生显著的协同效应。
61.应当理解，所公开的技术提供了许多有利的技术效果，包括提供了针对调节与免疫疗法相关的细胞表面标志物的表达的新颖且耐受性良好的方法，而且还增强或补充了当前抗肿瘤方案的有效性。
62.下述讨论提供了本发明主题的许多示例性实施方案。尽管每个实施方案代表发明元素的单个组合，但是发明主题被认为包括所公开元素的所有可能组合。因此，如果一个实施方案包括元素a、b和c，而第二个实施方案包括元素b和d，那么即使没有明确公开，本发明的主题也被认为包括a、b、c或d的其他剩余组合。
63.在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明某些实施方案的表示成分数量、性质如浓度、反应条件等的数字应理解为在某些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施例中，书面描述和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例寻求获得的期望性质而变化。在一些实施例中，数值参数应该根据记录的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的一些实施例的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可能精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可能包含一定的误差，这些误差必然是由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差引起的。
64.虽然下述的一些发现涉及鱼油和硒源的使用，但是申请人注意到表1中提供的营养补充剂配方包括鱼油和硒酵母成分(例如由硒酵母制备的肽和/或氨基酸)。因为在鱼油和硒酵母研究中发现的这种效果可以扩展到这种营养补充剂的使用，或者扩展到包括鱼油和硒酵母与表1所示制剂的一种或多种剩余成分组合的配方。表1中所示的补充物配方是最小剂量配方，已经发现其具有高水平的可接受性，并且在调节与抗肿瘤免疫疗法相关的细胞表面标志物的表达方面具有预料不到的有益效果。如下所示，当联合使用时，这种营养补充剂还可以补充和/或增强常规抗肿瘤治疗的效果。本发明构思的典型营养补充剂的配方
如下表1所示。
65.66.67.[0068][0069]
表1
[0070]
表1所示的组合物包括具有各种生理和生化作用的成分，包括抗炎活性、降低血糖水平、降低胆固醇和抗肿瘤活性。其他成分提供高水平的必需维生素、矿物质和氨基酸的补充。其他成分(例如酶、卵磷脂)在食用时有助于组合物成分的消化和吸收。这些互补活性的结合提供了超越单个组分的简单相加效应的协同效应。应该理解的是，表1中所示的组合物还包括用于改善适口性和可接受性的某些调味剂(例如红糖、蜂蜜、香草香精和掩蔽剂)。某些成分(如蜂蜜、红糖、牛奶、大米蛋白、酪蛋白)可以同时提供风味和热量。发明人已经发现，上述食用调味剂的组合在提供有效量的营养补充剂的食用顺应性方面是有效的。在一些实施例中，可以排除这些食用调味剂，而不会对营养补充剂的效果产生负面影响。
[0071]
应该理解的是，表1提供了提供所引用成分的最小日剂量的配方的描述，并且对于这些中的每一个所表达的范围被认为是所引用范围内的中间范围和/或子范围的公开。例如，30μg～4,000μg硒的范围表示每天提供30μg～4,000μg硒的最小配方，并且对于包括位于该范围内的各种子范围(例如500μg～2,000μg、2,000μg～4,000μg等)的配方具有指导意义。表1中所示的组合物可以由单一配方或两种或多种配方代表，它们共同提供组分成分。
[0072]
还应该理解的是，表1教导了最小配方(或低剂量)，并且本发明构思的实施方案可以包括包含更高剂量或范围的配方或配方的使用，例如组合物包含50％以上组分成分的中剂量(即比表1所示的高1.5倍)或组合物包含100％以上组分成分的高剂量(即比表1所示的高2倍)。因此，中剂量和高剂量配方包括将这些乘数应用于表1所示的最小配方的配方。例如，最低剂量配方中30μg～4,000μg的硒范围可以用1.5倍的乘数修改为中等剂量配方中的45μg～6,000μg，高剂量配方中的60μg～8,000μg可以用2倍的乘数修改。如上所述，这些中剂量和高剂量配方范围内的中间范围被认为是公开的。这种中剂量或高剂量组合物可以由单一配方或两种或多种配方代表，它们共同提供组分成分。
[0073]
在本发明构思的一些实施方案中，表1中列出的组分或成分可以作为较大分子、盐或复合物的一部分提供。例如，诸如硒、铬和/或钼的金属可以以硒酵母、铬酵母和钼酵母(分别)的形式提供，或者作为这种酵母配方的组分提供。
[0074]
在本发明构思的其他实施方案中，营养补充剂可以包括鱼油和硒酵母制剂，或者一种或多种来自这种酵母的含硒肽或氨基酸。这种硒肽可以包括硒代半胱氨酸和/或硒代蛋氨酸。
[0075]
在优选的实施方案中，本发明构思的组合物和方法中使用的鱼油的dha与epa的重量比约为2:3。在本技术的上下文中，该上下文中的术语“大约”包括与标称值的
±
10％或
±
20％的偏差。
[0076]
应当理解，本发明构思的一些实施方案是使用含硒和鱼油的营养补充剂治疗癌症的组合物和方法，而其他实施方案是调节活细胞中特定生物标志物的量的组合物和方法，而本发明构思的其他实施方案涉及将这种补充剂与一种或多种常规抗癌疗法，特别是免疫疗法结合使用。
[0077]
一些癌细胞对常用的化学治疗药物有耐药性，如易瑞沙/厄洛替尼。在一些个体中，这种耐药性发生在化学治疗过程中，导致有效性丧失和肿瘤的发展。在另一些情况下，癌症在治疗前对化学治疗药物有耐药性，使得肿瘤随着常规化学治疗的实施而发展。图1说明了肿瘤细胞中易瑞沙/厄洛替尼耐药性的已知机制。egfr(一种受体酪氨酸激酶或rtk)的突变激活在非小细胞肺癌中很常见，并导致erk、akt和rela的激活，进而促进癌症进展。在非耐药细胞中(左图)，易瑞沙/厄洛替尼阻断表皮生长因子受体的活性，导致肿瘤消退。在耐药细胞(右图)中，axl(另一种rtk)过量产生，为激活erk、akt和rela提供了一条不受药物阻断的替代途径。这种axl的过度表达与波形蛋白的过度表达有关，这表明内皮间充质转化可能在易瑞沙/厄洛替尼耐药性的形成中起作用。
[0078]
hcc827gr细胞系是对易瑞沙具有抗性的肺癌细胞系。如图2所示，这些细胞产生大量的axl，用易瑞沙治疗后，axl没有减少。然而，令人惊讶的是，硒酵母和鱼油的联合应用在没有或存在易瑞沙的情况下均显著降低了axl的表达，从而使这些耐药细胞对药物敏感。同时含有硒(例如，作为硒酵母)和鱼油的营养补充剂可以有效降低药物(例如，易瑞沙)抗性
细胞中axl的表达。因此，具有耐药性状态未知或正在改变的肿瘤的患者可以单独使用营养补充剂或联合使用化学治疗药物和营养补充剂进行治疗。
[0079]
如图3所示，axl的正确折叠依赖于热休克蛋白90(hsp90，一种伴侣蛋白)。由于axl折叠不当导致降解率增加，抑制或减少hsp90的表达可导致axl减少。值得注意的是，相对于易瑞沙敏感的亲代hcc827细胞系，axl和hsp90在易瑞沙抗性hcc827gr中的表达均升高，如图4所示。
[0080]
如图5a所示，用同时包含硒和鱼油的营养补充剂处理对易瑞沙抗性的hcc827gr细胞72小时，可降低axl和hsp90表达，而仅用易瑞沙治疗没有明显效果。值得注意的是，当使用易瑞沙和营养补充剂的组合时，在减少axl表达方面有明显的协同作用。
[0081]
发明人已经发现，用鱼油和硒(或用含有鱼油和硒的营养补充剂)处理可以调节除hsp90以外的热休克蛋白的表达。发明人发现，用硒和鱼油处理可以调节热休克蛋白的表达，例如p-hsp27。这种热休克蛋白被认为具有保护作用，是免疫疗法的常见目标。如图5b所示，用鱼油和硒的组合处理被发现在降低p-hsp27表达方面产生了协同效应，这是硒或鱼油单独处理所没有的。
[0082]
免疫疗法是当肿瘤细胞对化学治疗药物产生耐药性时仍然可用的一种治疗方式。如图5c所示，相对于易感亲代细胞系，耐药性人肺癌细胞(hcc827gr)显示了免疫治疗靶点如cd133、cd44和abcg2的过表达。图5d和5e显示了在存在和不存在不同浓度的化学治疗药物易瑞沙的情况下，用鱼油和硒治疗对该耐药细胞系(hcc827gr)中各种免疫治疗靶点和其他肿瘤标志物(即p-p38、p-hsp27、β-连环蛋白、abcg2、cd133、n-钙粘蛋白、e-钙粘蛋白、p-met、cox-2、grp78、p-ampkα和chop)表达的影响。应当理解，在某些情况下，与化学治疗药物的协同治疗似乎部分抵消了鱼油和硒的联合作用，特别是在药物浓度较高时。
[0083]
如图6a左图所示，受体酪氨酸激酶激活akt也导致磷酸化mtor增加，进而导致肿瘤细胞生长和耐药肿瘤细胞增殖增加。发明人已经发现，使用包含硒和鱼油的营养补充剂可以导致axl、hsp90、磷酸化atk和磷酸化mtor的减少(见图6的右图)。
[0084]
pd-1和pd-l1是调节t细胞反应的“检查点”蛋白，也是癌症免疫疗法的靶点。pd-l1通常在癌细胞中过度表达，并与活化的细胞毒性t细胞上存在的pd-1结合，导致其抑制。这些被抑制的t细胞对攻击癌细胞无效。免疫疗法旨在预防或阻断pd-1和pd-l1之间的相互作用。例如，免疫治疗药物派姆单抗是针对pd-1的单克隆抗体。这阻止了pd-l1的结合并阻断了细胞毒性t细胞的抑制。这种单克隆抗体药物通过注射或输注给药，并且具有潜在的免疫原性。令人惊讶的是，如图7a所示，发明人发现包含硒和鱼油的营养补充剂可以显著降低人肺癌细胞hcc827中的pd-l1表达。
[0085]
如图6b所示，鱼油和硒的组合可有效降低化学治疗耐药细胞中pd-l1的表达。令人惊讶的是，用鱼油和硒酵母的组合治疗在降低这种化学治疗耐药癌细胞中的pd-l1表达方面非常有效，而用化学治疗药物易瑞沙治疗则没有效果。
[0086]
发明人还发现鱼油和硒的组合可以调节具有癌症干细胞特征的癌球细胞中的pd-l1。图7b描绘了来源于a549人肺癌细胞的干细胞样球形细胞中pd-l1表达的示例性蛋白质印迹。图7c显示了在使用和不使用抗肿瘤化合物共同治疗的情况下，使用不同量的硒和鱼油的类似研究的典型结果。如图所示，pd-l1在没有干细胞特征的亲代细胞中最小，但在干细胞样球形细胞中显著表达。单独使用化学治疗药物不能调节pd-l1表达。硒和鱼油的联合
应用降低了这些干细胞样球形细胞中pd-l1的表达水平，并且可以将它们降低到低于在不显示干细胞特征的亲代细胞中观察到的水平。
[0087]
图8a显示了含硒和鱼油的营养补充剂对转移肿瘤组织(即从植入部位到乳房)中表达的pd-1和pd-l1的影响的研究结果，所述转移肿瘤组织是由将三阴性乳腺癌细胞植入小鼠而产生的。还用紫杉醇、紫杉醇和补充剂的组合、阿霉素、阿霉素和补充剂的组合、阿瓦斯汀以及阿瓦斯汀和补充剂的组合对动物进行治疗。如图所示，用含硒和鱼油的营养补充剂进行的体内治疗降低了肿瘤组织中pd-1和pd-l1的表达。当与化学治疗药物联合使用时，协同效应明显。图8b显示了在三阴性乳腺癌动物模型中，包含硒和鱼油的营养补充剂对原发肿瘤部位和转移性肿瘤部位中pd-1与pd-l1的表达比率的影响结果。当与化学治疗药物联合使用时，协同效应明显。
[0088]
额外的研究表明，通过含有硒和鱼油的营养补充剂对肿瘤组织中的pd-1和pd-l1表达以及免疫疗法中有用的其他免疫检查点标志物的体内调节是剂量依赖性的。应当理解，在一些实施方案中，本发明构思的营养补充剂可以对依赖于肿瘤位置的免疫检查点标志物的表达提供不同的效果。例如，通过本发明构思的营养补充剂对免疫检查点蛋白的调节可以在原发肿瘤部位(例如在动物模型中的植入部位)和转移部位(例如在动物模型中的肺、肝、脾等)之间有所差异。图9a描绘了这种现象的动物模型研究的典型研究设计。使用了三种不同的补充剂配方，分别提供低剂量(nfs)、中剂量(nfm：含硒量是nfs的1.5倍)和高剂量(nfh：含硒量是nfs的两倍)的硒和鱼油。这些补充剂与化学治疗药物(如紫杉醇或阿霉素)联合使用。图9b显示了鼠模型中三阴性人乳腺癌原发部位的pd-1、pd-l1、ctla4和foxp3的研究结果。如图所示，通过以剂量依赖的方式使用营养补充剂来降低pd-l1，其中紫杉醇和阿霉素没有明显的效果。pd-1、ctla4和foxp3免疫检查点标志的表达以剂量依赖性方式增加。图9c显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油结合阿瓦斯汀或紫杉醇调节肿瘤cd24表达的剂量依赖性。图9d显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇联合调节肿瘤cd29表达的剂量依赖性。图9e显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇联合调节肿瘤egfr表达的剂量依赖性。图9f显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇联合调节肿瘤p-mtor表达的剂量依赖性。图9g显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与紫杉醇组合调节肿瘤hdac1和p-h2x表达的剂量依赖性。图9h显示了在动物肿瘤模型中，使用不同水平的硒和鱼油与阿瓦斯汀或紫杉醇联合调节肿瘤p-akt表达的剂量依赖性。
[0089]
波形蛋白既可以在细胞内表达，也可以在细胞表面表达，是免疫疗法靶向的另一种蛋白质。如图9i所示，鱼油和硒的联合使用降低了治疗的细胞中波形蛋白的表达。当单独使用鱼油或硒时，看不到这种效果。免疫疗法的另一个靶点是p-ampkα，其可以抑制mtor，并与肿瘤细胞和t细胞的氧化代谢有关。如图9j所示，鱼油和硒的组合在增加p-ampkα方面具有协同作用。这反过来与如此处理的细胞中p-mtor的降低有关。
[0090]
发明人相信，包含硒和鱼油的营养补充剂的用途包括可以通过至少降低肿瘤pd-l1表达来替代和/或补充癌症化学治疗和/或常规免疫疗法。还应当理解，这种营养补充剂可以方便地口服给药，并且耐受性良好。
[0091]
涉及使用特异性单克隆抗体(或其衍生物)的免疫疗法在癌症治疗中的应用越来越多。这些免疫疗法中的许多针对pd-1和pdl-1之间的相互作用。例如，4h2是一种对pd-1具
有特异性的嵌合鼠抗体。图10a描述了一项研究的设计，该研究旨在确定当与这种基于抗体的抗肿瘤免疫疗法结合使用时，含有鱼油和硒的营养补充剂的效果。在植入肿瘤细胞并如图10a所示进行处理的小鼠的脾脏中发现的cd3阳性t细胞的百分比如图10b所示。如图所示，与未治疗的对照组相比，未治疗的荷瘤小鼠的cd
3
t细胞数量急剧减少。用h2抗体治疗几乎没有任何改善。用含有鱼油和硒的营养补充剂治疗后，cd
3
阳性t细胞的百分比有明显提高。令人惊讶的是，pd-1特异性抗体和含有鱼油和硒的营养补充剂的联合使用大大提高了cd
3
t细胞的百分比，表明具有协同作用。
[0092]
在植入肿瘤细胞并如图10a所示处理的小鼠脾脏中发现的cd3阳性和cd
4
t细胞的百分比显示在图10c中。如图所示，与未治疗的对照组相比，未治疗的荷瘤小鼠的cd
3
/cd
4
t细胞的百分比急剧降低。用h2抗体治疗似乎进一步降低了cd
3
/cd
4
t细胞的百分比。用含有鱼油和硒的营养补充剂治疗对cd
3
/cd
4
阳性t细胞的百分比几乎没有影响。令人惊讶的是，pd-1特异性抗体和含有鱼油和硒的营养补充剂的联合使用提高了cd
3
/cd
4
t细胞的百分比，表明具有协同作用。
[0093]
在植入肿瘤细胞并如图10a所示处理的小鼠脾脏中发现的cd3阳性和cd8阳性t细胞的百分比如图10d所示。如图所示，与未治疗的对照组相比，未治疗的荷瘤小鼠显示出cd
3
/cd
8
t细胞的百分比急剧降低。用h2抗体治疗略微增加了cd
3
/cd
8
t细胞的百分比，用含有鱼油和硒的营养补充剂治疗也是如此。令人惊讶的是，pd-1特异性抗体和含有鱼油和硒的营养补充剂的联合使用显著提高了cd
3
/cd
8
t细胞的百分比，表明具有协同作用。
[0094]
图10e显示了在植入肿瘤细胞并如图10a所示处理的小鼠脾脏中发现的树突细胞的百分比。如图所示，与未治疗的对照组相比，未治疗的荷瘤小鼠的树突细胞百分比急剧降低。用h2抗体治疗对树突状细胞的百分比几乎没有影响。用含有鱼油和硒的营养补充剂治疗可以增加树突状细胞的百分比，结合使用pd-1特异性抗体和含有鱼油和硒的营养补充剂也发现了这一点。
[0095]
如上所述，可以提供包含不同量硒(se)的营养补充剂，并且该补充剂也可以与化学治疗剂一起提供或结合使用。动物研究中使用的典型给药方案如图11所示。图12显示了这种给药方案对荷瘤小鼠血清/血浆硒浓度的影响。如图12所示，用含硒和鱼油的营养补充剂治疗荷瘤小鼠，同时用化学治疗剂治疗，导致血浆硒浓度的升高。值得注意的是，尽管使用具有一定硒含量范围的营养补充剂进行治疗，血浆硒浓度相对一致。
[0096]
图13示出了从如图12中处理的荷瘤小鼠获得的肿瘤组织的硒含量。令人惊讶的是，在用含有鱼油和硒的营养补充剂的组合治疗并且也用化学治疗剂治疗的荷瘤小鼠的肿瘤组织中，硒以硒剂量相关的方式被隔离。这表明硒的选择性摄取和/或保留，可能在肿瘤组织中提供局部作用，同时通过简单的口服给药系统地提供。
[0097]
表皮生长因子受体(egfr)是肿瘤发生的驱动因素，并且经常在肺癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞中被不恰当地激活(例如，通过扩增)。egfr还与耐药性的发展有关，因为扩增已被证明是由化学治疗药物施加的选择性压力驱动的。如图14所示，当用含有不同量硒和鱼油的营养补充剂与化学治疗药物(例如紫杉醇或阿瓦斯汀)共同治疗荷瘤动物时，肿瘤组织中egfr表达以剂量特异性方式降低。令人惊讶的是，egfr表达以硒剂量依赖性的方式降低，即使表达不受单独化学治疗(例如紫杉醇)的影响。
[0098]
如上所述，磷酸化mtor(p-mtor)也与肿瘤生长和耐药性有关。如图15所示，发现用
化学治疗剂(例如紫杉醇或阿瓦斯汀)结合含有鱼油和不同量硒的营养补充剂共同治疗荷瘤小鼠会以硒剂量依赖的方式急剧降低p-mtor的表达。
[0099]
组蛋白乙酰化酶介导的组蛋白乙酰化是一种影响基因表达的表观遗传修饰。组蛋白去乙酰化酶的异常表达与肿瘤的发展有关，基因表达的改变会导致细胞功能的破坏，如细胞增殖、细胞周期调节和凋亡。因此，组蛋白去乙酰化酶的抑制被研究作为癌症治疗的目标。如图16所示，已经发现将含有鱼油和不同量硒的营养补充剂与化学治疗剂联合使用，可以以硒剂量依赖的方式降低荷瘤小鼠肿瘤中组蛋白脱乙酰酶的表达。图16还显示，p-h2x，一种与双链dna断裂的存在相关的标志物，在用化学治疗剂和营养补充剂的组合进行治疗的荷瘤小鼠的肿瘤组织中以硒剂量依赖的方式强烈减少，所述营养补充剂包括鱼油和不同量的硒。
[0100]
磷酸化akt(p-akt)被认为是某些癌症预后不良的标志，包括乳腺癌和胃癌。如图17所示，当用含有不同量的鱼油和硒的营养补充剂与化学治疗剂共同治疗荷瘤小鼠时，肿瘤组织中的p-akt thr308和p-akt ser473均减少。观察到的减少是硒剂量依赖性的方式进行的。
[0101]
smad家族蛋白是tgf-β信号通路的一部分，参与肿瘤的发展和转移。癌细胞核中p-smad 2水平升高与预后不良有关。如图18所示，用含有鱼油和不同量硒的营养补充剂结合化学治疗剂治疗荷瘤小鼠，显著降低了肿瘤细胞核中p-smad 2/3的含量。降低的程度与硒的剂量有关。
[0102]
癌细胞可以具有干细胞样特征，其存在可以指示转移和/或产生对化学治疗药物的耐药性的能力。cd24和cd29是常用于确定干细胞特征的程度的标志物。图19a显示了营养补充剂效果的体内研究结果，所述营养补充剂包括硒和鱼油，所述硒和鱼油通过注射至具有三阴性乳腺癌细胞的小鼠而在原发肿瘤部位表达cd24和cd29。小鼠也用紫杉醇、紫杉醇和补充剂的组合、阿霉素、阿霉素和补充剂的组合、阿瓦斯汀和补充剂的组合进行治疗。图19b显示了通过使用包含硒和鱼油的营养补充剂对肿瘤c24和cd29表达的调节是剂量依赖性的。如图9所示，含有低、中和高剂量硒的营养补充剂与阿瓦斯汀或紫杉醇联合提供。如图所示，含有硒和鱼油的营养补充剂可以显著降低原发性肿瘤部位中cd24和cd29的表达(以剂量依赖的方式)，即使常规化学治疗药物基本无效。这表明肿瘤细胞中干细胞样特征的程度降低，并且随后转移和/或产生耐药性的趋势降低。
[0103]
图20显示了使用不同量的含硒和鱼油的营养补充剂(与紫杉醇联合使用)对从转移性脑肿瘤部位获得的样品中与转移性能力相关的标志物，特别是cd24、cd29、mmp-9和vegf的结果。虽然单独使用紫杉醇没有明显效果，但使用含硒和鱼油的营养补充剂以剂量依赖性方式降低了与转移相关的vegf、cd24、cd29和mmp-9标志物的表达。
[0104]
cd31是指示肿瘤细胞中干细胞特征的另一个标志物，其与肿瘤细胞的转移趋势相关。图21a和21b显示了植入小鼠的肺癌细胞在转移性和原发性肿瘤部位的cd31表达水平的体外研究结果。动物或者用营养补充剂进行预先治疗，或者在植入时开始进行治疗。如图21a和21b所示，含有硒和鱼油的营养补充剂在降低转移性组织和原发性肿瘤组织中cd31的表达方面是有效的，预先治疗提供了类似于常规放射治疗的效果(但没有伴随的副作用)。
[0105]
cd8阳性t细胞是癌症免疫疗法的另一个潜在靶点。在肿瘤中这种肿瘤浸润性t细胞的存在与癌症患者的总生存期相关。图22a和22b显示了植入小鼠的肺癌细胞在转移性和
原发性肿瘤部位中cd8表达水平的体外研究结果。动物或者用营养补充剂进行预先治疗，或者在植入时开始进行治疗。如图22a和22b所示，含有硒和鱼油的营养补充剂在增加转移性组织和原发性肿瘤组织中cd8阳性t细胞的浸润方面是有效的，预先治疗提供了类似于常规放射治疗的效果(但没有伴随的副作用)。令人惊讶的是，当营养补充剂的预先治疗与放射治疗相结合时，发现了显著的协同作用。
[0106]
cd4阳性t细胞对致癌前衰老细胞具有活性，是癌症免疫疗法的另一个靶标。这种cd4阳性t细胞与cd8阳性t细胞具有协同作用，随着衰老细胞积累更多突变并从衰老转移到肿瘤发生，cd8阳性t细胞变得活跃。因此，cd4阳性和cd8阳性t细胞之间的正常平衡状态是理想的。cd4和cd8表达之间的比率提供了对受影响组织中这些t细胞相对群体的量度。图23a和23b显示了植入小鼠的人肺癌细胞在转移性和原发性肿瘤部位中cd4表达相对于cd8表达水平的体外研究结果。动物或者用营养补充剂进行预先治疗，或者在植入时开始进行治疗。如图23a和23b所示，含有硒和鱼油的营养补充剂在降低转移性组织和原发性肿瘤组织中的cd4/cd8比率方面是有效的，预先治疗提供了类似于常规放射治疗的效果(但没有伴随的副作用)。令人惊讶的是，营养补充剂治疗(尤其是治疗前)比常规放射治疗更有效。
[0107]
ctla4是另一种可以下调免疫反应的免疫检查点蛋白，是癌症免疫疗法的潜在靶点。例如，伊匹单抗是一种针对ctla4的治疗性抗体，用于癌症免疫疗法。不幸的是，使用伊匹单抗会导致严重的自身免疫反应。图24a和24b显示了植入小鼠的人肺癌细胞在转移性和原发性肿瘤部位ctla4表达水平的体外研究结果。动物或者用营养补充剂进行预先治疗，或者在植入时开始进行治疗。如图24a和24b所示，含有硒和鱼油的营养补充剂在增加转移性组织和原发性肿瘤组织中ctla4的表达方面是有效的，预先治疗提供了类似于常规放射治疗的效果(但没有伴随的副作用)。
[0108]
在本发明构思的一些实施方案中，含有硒和鱼油的营养补充剂可用于修饰或调节pd-1和/或pdl-1的表达。图25a显示了当用含有硒和鱼油的营养补充剂和常用化学治疗剂进行治疗时，乳腺癌模型动物模型中pd-1和pdl-1表达的治疗结果。图25b显示了这些肿瘤中pd-1和pd-l1表达之间的比率。如图所示，使用含硒和鱼油的营养补充剂进行治疗可降低肿瘤中pd-l1的表达。这种减少至少补充了用化学治疗药物治疗时观察到的pd-l1的减少。相反，用含硒和鱼油的营养补充剂治疗可增加pd-1的表达。很明显，在未治疗的肿瘤中，pd-1与pd-l1表达的比率较低，但在用含硒和鱼油的补充剂治疗时显著增加。化学治疗药物治疗对pd-1:pd-l1比值的影响相对较小，但通过与营养补充剂共同治疗时，这种影响得到了增强。
[0109]
在人体临床试验中也研究了含硒和鱼油的营养补充剂对白细胞的pd1含量与肿瘤细胞的pdl-1含量之比的变化率的影响。图26显示了这种试验的结果，其中患者接受了低剂量补充剂(g1)、中等剂量补充剂(g2，含硒量是g1的1.5倍)或高剂量补充剂(g3，含硒量是g1的两倍)。在治疗的第1周和第16周测定白细胞的pd1含量和肿瘤细胞的pdl-1含量。如图所示，向癌症患者提供含有硒和鱼油的营养补充剂可以增加白细胞pd1/肿瘤pdl-1的比率，并且是以剂量依赖的方式进行的。
[0110]
还进行了人体临床试验，以表征含硒和鱼油的营养补充剂对循环肿瘤细胞数量的影响，循环肿瘤细胞数量与原发肿瘤部位的转移有关。将患者分成接受不同量营养补充剂的三组，并对循环肿瘤细胞数、血清硒含量、血清epa含量和血清dha含量进行表征。结果如
表2所示。
[0111]
[0112][0113]
第1组(g1)患者接受低剂量的含硒和鱼油的营养补充剂，第2组(g2)患者接受中等剂量的营养补充剂，第3组(g3)患者接受高剂量的营养补充剂。
[0114]
表2
[0115]
如表2所示，接受含硒和鱼油的营养补充剂的最高剂量的患者显示出循环肿瘤细胞的最高减少率，并且还显示出硒、epa和dha的最高血清浓度。因此，向癌症患者提供包含硒和鱼油的补充剂可导致循环肿瘤细胞减少，并因此减少肿瘤的转移。
[0116]
发明人还发现，含有硒和鱼油的补充剂可以增强乳腺癌动物模型中自然杀伤细胞
(nk)的活性。图27显示了以低、中和高剂量与化学治疗药物(即紫杉醇和阿瓦斯汀)联合给药的这种补充剂的研究结果。如图所示抑癌基因pten的表达相比于紫杉醇诱导的表达增加呈现剂量依赖性。与紫杉醇或阿瓦斯汀诱导的表达减少相比，p-pten的表达以剂量依赖性的方式减少。与紫杉醇或阿瓦斯汀诱导的降低相比，p-stat3的表达同样呈剂量依赖性降低，并且在高剂量含硒和鱼油的营养补充剂时降低至几乎检测不到的水平。磷-p53的表达在未经治疗的动物受试者中降低至几乎检测不到，与紫杉醇或阿瓦斯汀产生的作用相比，其表达呈剂量依赖性增加。
[0117]
进行了一项类似的研究，其中t细胞和免疫检查点标志物从人类疾病动物模型中的三阴性乳腺癌肿瘤样本中表征。结果如图28所示。如图所示，免疫检查点蛋白pd-1的表达通过用紫杉醇或阿霉素处理而略微增加，并且通过用含硒和鱼油的营养补充剂处理而以剂量依赖性方式增强。发明人认为，这至少部分是由于肿瘤组织更广泛的t细胞浸润，由于活性增强而导致的。相反，免疫检查点蛋白pd-l1的表达基本上不受化学治疗药物治疗的影响，并且通过与含硒和鱼油的营养补充剂的共同治疗以剂量依赖性方式显著降低。ctla4和foxp3的表达通过化学治疗药物治疗而增加，并且通过与营养补充剂的共同治疗以剂量依赖性方式增强所述表达效果。
[0118]
cxcr4在肿瘤中的表达与向cxcl12表达组织的转移有关，并且cxcr4抑制化合物已被证明具有抗肿瘤活性。如图29所示(其利用了与图28中描述的相似的乳腺癌动物模型)，单独用阿瓦斯汀治疗对cxcr4的肿瘤表达几乎没有影响，然而，与包括硒和鱼油的营养补充剂的共同治疗导致肿瘤组织中cxcr4表达的显著的剂量依赖性降低。
[0119]
在肺癌的动物模型中进行了类似的研究，其中营养补充剂与放射治疗结合使用。在一些实验中，在开始重复放射治疗之前，用含硒和鱼油的补充剂进行7天的营养补充；在其他实施例中，营养补充和放射治疗同时开始。典型的研究如图30所示。
[0120]
cd8与细胞毒性t细胞相关，cd4/cd8的比值升高与存活率增加相关。如图31a所示，如果以携带肿瘤的动物(t)相对于对照、未治疗的动物(c)来看，cd8的表达在肺组织样品中降低。用含有硒和鱼油(pt)的营养补充剂进行预先治疗和在植入后第8天(tn)进行治疗都会增加cd8表达，放射治疗(tr)和放射治疗和营养补充剂(trn)共同治疗也是如此。令人惊讶的是，在第8天(ptrn)用营养补充剂预先治疗后，然后进行放射治疗，在增加cd8表达方面产生了协同效应。应当理解，图31a的结果代表了从肿瘤细胞的主要植入部位向动物肺的转移。如图31b所示，在原植入部位的肿瘤组织中发现了类似的结果。
[0121]
如上所述，cd4/cd8的比率被认为是针对肿瘤的t细胞活性的指示。如图32a所示，在肺癌动物模型(代表转移部位)的肺组织中，对照未治疗动物(c)的cd4/cd8比率相对于在注射肺癌细胞(t)的未治疗动物中发现的比率较低。使用如上所示的方案，仅用辐射(tr)处理的动物的肺组织显示出cd4/cd8比率的轻微降低，而用含硒和鱼油的营养补充剂处理的动物显示出cd4/cd8比率的显著降低。这是针对只接受营养补充剂治疗的动物(ptn、tn)或在提供营养补充剂的同时接受放射治疗的动物(ptrn、trn)发现的。值得注意的是，在开始放射治疗(ptrn)之前，用含硒和鱼油的营养补充剂进行治疗降低了肺组织的cd4/cd8的比率至基本上与对照动物相同。图32b显示了类似研究的结果，其中组织样本是从主要植入部位产生的肿瘤中获得的。
[0122]
观察到stat3在癌症中升高，并且与抑制免疫系统对肿瘤细胞的反应有关。如图33
所示，在肺癌的动物模型中(如上所述)，在接受放射治疗的动物(tr)、用含硒和鱼油的营养补充剂治疗的动物(ptn，tn)和用放射治疗和营养补充剂治疗的动物(ptrn，trn)中，原发性肿瘤组织中stat3的表达降低。应当理解，使用营养补充剂的治疗至少补充了放射治疗对肿瘤stat3表达的影响，并且可以与放射治疗一样有效。
[0123]
如上所述，在针对乳腺癌动物模型的研究中，pten抑制是肿瘤细胞的特征。图34显示了来自使用肺癌动物模型进行的研究得到的数据，其中含有硒和鱼油的营养补充剂与放射治疗结合使用(如上所述)。如图所示，pten的表达在未治疗动物的肿瘤组织中较低，而在仅用辐射治疗的动物中适度增加。发现用营养补充剂治疗可增加肿瘤组织中pten的表达(ptn、tn、ptrn、trn)，特别是当动物在植入时用补充剂治疗时(ptn、ptrn)。
[0124]
如上所述，在针对乳腺癌动物模型的研究中，ctla-4被认为是t细胞活化的指标。表征从肺癌动物模型(如上所述)的原代肿瘤细胞接种位点获得的肿瘤细胞中ctla-4表达的研究结果显示在图35a中。如图所示，来自未治疗肿瘤(t)的样本显示了低水平的ctla-4表达，其在放射治疗(tr)时增加。使用含硒和鱼油的营养补充剂也与肿瘤组织中ctla-4表达的增加有关(ptn、tn、ptrn、trn)，并且至少是同步放射治疗的补充(ptrn、trn)。有趣的是，植入时采用营养补充剂的治疗(ptn，ptrn)提供了ctla-4表达的最大增强。图35b显示了对从肺获得的组织(即转移部位)进行的研究的类似结果。
[0125]
申请人认为，在施用包含硒和鱼油的营养补充剂(没有使用化学治疗药物和/或辐射的共同治疗)后，在某些组织中发现的基因表达水平的调节可能是由于肿瘤细胞中表达的变化、周围组织中表达的变化、肿瘤组织和/或周围组织被免疫系统细胞浸润的结果和/或免疫系统细胞中表达的变化。申请人注意到，用营养补充剂治疗引起的基因表达的许多变化与免疫系统细胞对抗肿瘤活性的激活的变化一致。
[0126]
本发明构思的另一个实施方案是用于降低肿瘤侵袭性和/或血管生成，同时调节肿瘤免疫检查点蛋白的方法和组合物。发明人已经在三阴性乳腺癌的动物模型中鉴定了硒和鱼油对与肿瘤血管生成和侵袭相关的蛋白质(除了免疫检查点蛋白质)的剂量依赖性调节。结果如图36～39所示。图36显示了在使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中mmp-9、pd-l1和pd-l2的剂量依赖性调节。图37显示了在使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中ctla4、cox-2、foxp3、p-akt s473和p-akt t308的剂量依赖性调节。图38显示了使用硒和鱼油与紫杉醇或阿霉素组合的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中nkp46的剂量依赖性调节。图39显示了在使用硒和鱼油与紫杉醇或阿瓦斯汀组合的三阴性乳腺癌动物模型的肿瘤中cd26、cd80和cd86的剂量依赖性调节。
[0127]
本发明构思的另一个实施方案是通过用如上所述的营养补充剂的活性成分(例如硒和/或鱼油)处理从患者血液中分离(例如通过白细胞电泳)的血液或免疫细胞(例如nk细胞)来治疗癌症的方法。这种离体治疗可以激活血液或免疫细胞和/或调节与抗肿瘤免疫功能改善相关的标志物的表达。这种离体刺激可以发生在组织培养中分离的免疫细胞扩增之前、期间或之后。刺激后，活化/修饰的免疫细胞返回到患者体内，在那里它们相对于相应的未刺激的免疫细胞显示出增强的抗肿瘤活性。任选地，可以培养这种受刺激的细胞，并在重新植入前扩增它们的数量(例如通过克隆性扩增)。在一些实施方案中，除了暴露于含有硒和鱼油的营养补充剂的活性成分之外，这种分离的免疫细胞可以通过其他方法(例如通过
遗传操作)进行修饰，以增强抗肿瘤活性。
[0128]
在本发明构思的一些实施方案中，免疫细胞的离体治疗与放射治疗相结合。在一些实施方案中，可以在收集免疫细胞之前对个体进行放射治疗，使得使用营养补充剂的活性成分的离体刺激针对受辐照的细胞。在其他实施方案中，免疫细胞的离体刺激发生在放射治疗之前，使得辐射被施加到已经用营养补充剂的活性成分预先治疗过的免疫细胞，或者在输注这种治疗过的细胞之后被施加到患者。在其他实施方案中，从患者收集的免疫细胞可以在接受放射治疗时被分离并用本发明构思的营养补充剂的活性成分进行治疗。在一个优选的实施方案中，这种放射治疗与旨在杀死肿瘤细胞的放射治疗相比相对温和，并且足以在免疫细胞中产生一定程度的活化、刺激和/或以其他方式改善的抗肿瘤功能，而不会产生放射治疗的常见副作用(例如免疫抑制、胃肠症状、脱发、粘膜损伤、皮肤损伤等)。
[0129]
对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离这里的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，许多其他的修改是可能的。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应该以与上下文一致的最广泛的可能方式来解释。具体而言，术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”应该被解释为以非排他性的方式指代元件、组件或步骤，指示所引用的元件、组件或步骤可以存在，或者被利用，或者与未明确引用的其他元件、组件或步骤组合。其中说明书权利要求书涉及从由a、b、c
……
和n组成的组中选择的至少一个，文本应该被解释为只需要组中的一个元素，而不是a加n，或者b加n等。