ADAMTS5抑制剂用于治疗胶质母细胞瘤的用途的制作方法

treatment of malignant pleural effusions.clin cancerres 5,513-520(1999))，也从未用于抗癌治疗。
4.在中国，每年有超过45,000例的患者被确诊为胶质母细胞瘤，治疗手段非常有限。胶质母细胞瘤作为恶性肿瘤，生长速度非常快，一旦发病，几个月就会夺去患者的生命，病死率接近80％。即使很快的进行手术切除，也会因为难以完全切除而造成复发。
5.虽然胶质母细胞瘤的分子靶点有很多种，但是最终被fda批准的化疗药物只有三种，而该三种药的预后效果也一般，容易产生抗药性。归纳原因，可能是哪些胶质母细胞瘤特异的分子靶点参与了疾病的过程还未研究清楚，以及肿瘤特异的单细胞微环境特点亟待阐明。而正在进入临床实验的化疗药物或联合用药疗法有50多种，但这些药物都是通用的针对肿瘤的靶点，没有结合胶质瘤的特异脑内微环境特点设计药物。而已经上市的药物替莫唑胺胶囊只能延长几个月的生存周期，易产生抗药性，存活率较低。细胞外基质分泌的各种糖蛋白和纤维可以促进肿瘤的浸润性和血管生成，所以研究针对细胞外基质的分子靶点的临床抗胶质瘤药物是非常有意义和市场前景的。
6.为了弥补这一空白，本技术研究一些细胞外基质药物的抗胶质母细胞瘤效果，在动物模型和临床上开发新的药物。中国的胶质瘤市场容量很大，我们将针对中国患者的遗传特点来设计靶向药物，提供抗肿瘤药物的新型靶点，降低肿瘤细胞的抗药性。实现精准医疗和延长患者的生存周期的目的。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种治疗胶质母细胞瘤的药物靶点和药物，所述药物靶点为a型溶栓蛋白和金属蛋白酶与血小板反应蛋白基序(adamts)酶。所述药物为一种小分子化合物adamts5抑制剂。
8.本发明的另一目的是提供一种治疗胶质母细胞瘤的联合用药物，所述联合用药物包括adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)。
9.在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗胶质母细胞瘤的药物靶点，所述靶点为adamts酶。
10.在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗胶质母细胞瘤的药物，所述药物为adamts5抑制剂。
11.在一个实施方案中，所述adamts5抑制剂为式1表示的化合物。
[0012][0013]
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗胶质母细胞瘤的联合用药物，所述联合用药物包括adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)。
[0014]
在adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)联合用药的情况下，其中adamts5抑制剂与tmz的用量比为1:5-20，更优选地，adamts5抑制剂与tmz的用量比为1:10-15，最优选地，adamts5抑制剂与tmz的用量比为1:10。
[0015]
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗胶质母细胞瘤的联合用药物，所述联合用药物包括式1表示的化合物与替莫唑胺(tmz)，
[0016][0017]
在一个实施方案中，式1表示的化合物与替莫唑胺(tmz)联合用药，其中，式1表示的化合物与tmz的用量比为1:5-20，更优选地，式1表示的化合物与tmz的用量比为1:10-15，最优选地，式1表示的化合物与tmz的用量比为1:10。
[0018]
本发明还提供了adamts5抑制剂在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。
[0019]
本发明还提供了adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)联合用药物在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。
[0020]
研究结果显示，adamts5抑制剂具有良好的抗胶质母细胞瘤的效果；adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)联合用药，显示出比替莫唑胺(tmz)更好的抗肿瘤效果。
附图说明
[0021]
图1为不同浓度下的tmz和药物x对人源胶质瘤细胞(ctx)模型在24(a)小时、48小时(a-b)、72小时(b-c)的抗肿瘤效果。
[0022]
图2为tmz和药物x联合用药48小时(左)和72小时(右)后对人源胶质瘤细胞(cdx)模型的抗肿瘤效果。
[0023]
图3a-图3d为药物x对胶质瘤小鼠模型的抗肿瘤效果评估。其中，图3a为给药后肿瘤组织的体积；图3b为胶质母细胞瘤小鼠对照组和给药组的生存周期，与对照组相比给药组的平均生存周期显著提高；图3c为胶质母细胞瘤小鼠的体重曲线；图3d显示tmz、药物x均可以显著降低肿瘤病灶的大小，左边为给药前，右边为给药后的核磁检测图像(t2相)。
[0024]
其中，tmz表示替莫唑胺；药物x(drug x)为式1表示的化合物。
具体实施方式
[0025]
本发明使用与临床病理最为相近的胶质瘤原位移植瘤小鼠模型(patient-derived orthotopic xenograft，pdox)进行验证adamts5抑制剂的作用，给小鼠喂不同剂量的adamts5抑制剂，分析其抗肿瘤效果。并且将adamts5抑制剂与化疗药物替莫唑胺联合用药，测试胶质瘤模型小鼠对替莫唑胺的抗药性是否受到adamts5抑制剂的影响。
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1、实验条件
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用8-10周的nsg免疫缺陷小鼠70-80只(雌性)进行实验，根据前期的细胞实验确定药物的剂量和随机分组为对照组，tmz阳性对照组(5mg/kg)，adamts5抑制剂低剂量组(0.25mg/kg)，adamts-5抑制剂高剂量组(0.5mg/kg)，tmz adamts-5抑制剂(5mg/kg 0.5mg/kg)联合用药组。nsg小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(25mg/kg)麻醉后，置于小动物立体定向仪上。腹卧位固定后头部消毒，先将小鼠头部毛剃去，暴露颅骨表面，用手术刀在小鼠头部切一个小口，使用颅骨钻在小鼠颅骨表面钻0.7μm小孔，立体定位坐标如下：相对于前囱 1.0毫米，相对于中线2.1毫米和2.6毫米颅骨表面以下。取得胶质瘤及配对的恶变的病人来源的肿瘤组织(gbm011)，经过全自动组织处理器做成单细胞匀浆，调整细胞密度为1*105/μl。然后将准备好的5μl胶质瘤细胞悬液注射到小鼠纹状体，细胞缓慢注射5分钟，速度为1μl/min，注射器被撤回前停针5分钟。然后用骨蜡封住钻孔。种植肿瘤细胞数日后监控伤口处胶自动脱落并确保伤口愈合。每日观察nsg小鼠饮食及精神状态直至出现病理特征。
[0028]
用9.4t的小动物核磁成像在手术后一个月，两个月，三个月后分别拍摄nsg小鼠颅内肿瘤情况，确定肿瘤边界和大小。扫描条件为：at2_turborare，tr/te＝5000/40，60averages，视野20
×
20，层厚0.5mm。通过对mri图片进行肿瘤大小统计来计算肿瘤体积及待测化合物肿瘤体积的抑制率。确定小鼠造模成功后，将adamts5抑制剂腹腔注射到携带胶质瘤的小鼠体内。期间每天观察小鼠各项生理指标，制作生存曲线。定期取血液和脑脊液观测adamts5酶活和药物浓度(质谱检测)。每周对小鼠进行小动物核磁成像，观察肿瘤大小。注射三周后，用戊巴比妥钠对小鼠实施安乐死，一部分小鼠取出组织(大脑组织)进行病理切片检测。另外一部分小鼠去除肿瘤组织，测量大小并且质谱测定小鼠免疫微环境的蛋白表达。
[0029]
2、实验结果
[0030]
实验结果如下面表1所示。
[0031]
表1
[0032][0033]
其中，adamts5抑制剂为式1表示的化合物。
[0034]
adamts5抑制剂和tmz单独用药可以显著提高小鼠的生存周期，但adamts5(0.5mg/kg)浓度的体重最轻，提示高浓度的目标药物有一定的副作用。adamts5抑制剂和tmz单独用药以及联合用药均可以缩小肿瘤组织的体积。其中adamts5(0.25mg/kg)的效果最好。
[0035]
3、人源胶质瘤细胞(cdx)模型的抗肿瘤效果评估
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下面分别检测不同浓度下的tmz和药物x对人源胶质瘤细胞(cdx)模型的抗肿瘤效果。
[0037]
其中，药物x为式1表示的化合物。
[0038]
目前国内外常用的治疗胶质母细胞瘤的化疗药物为替莫唑胺(tmz)，但该药物只能将患者的生存期延长到15个月左右，且容易产生抗药性。所以药物x与替莫唑胺联合用药，是否可以避免抗药性的产生，是探究胶质母细胞瘤的新型化疗治疗方案的关键问题。
[0039]
图1为不同浓度下的tmz和药物x对人源胶质瘤细胞(ctx)模型在24(a)小时、48小时(a-b)、72小时(b-c)的抗肿瘤效果。
[0040]
分别用不同浓度的tmz和药物x对细胞计数，发现给药48小时和72小时后400μm的tmz和50μm的药物x的抗肿瘤效果有显著差异。
[0041]
单独将药物x 50μm在细胞培养的溶液中处理48小时，胶质瘤细胞开始死亡；当处理时间延长到72小时，药物x的抗肿瘤效果达到最好。
[0042]
图2为tmz和药物x联合用药48小时(左)和72小时(右)后对人源胶质瘤细胞(cdx)模型的抗肿瘤效果。图中红色虚线为肿瘤细胞生存力的50％。
[0043]
为了进一步验证联合用药的效果，我们用250μm的tmz和不同浓度梯度的x进行联合用药，其抗肿瘤在48小时和72小时逐渐显现，其中500μm的tmz和50μm的药物x联合用药的效果最好。
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结果显示，tmz和药物x联合用药对人源胶质瘤细胞(cdx)模型具备显著的抗肿瘤效果。
[0045]
联合用药跟对照相比减少了70％的细胞死亡，而单独用药物x减少了50％的细胞死亡。50μm的药物x和500μm的tmz抗肿瘤效果差不多，说明药物x的有效浓度在细胞水平上比阳性药tmz低10倍。细胞实验的浓度梯度试验为小鼠模型的药物浓度选取提供了参考。
[0046]
图3a-图3d为药物x对胶质瘤小鼠模型的抗肿瘤效果评估。
[0047]
其中，图3a为药物x分别给药(0.25mg/kg)和(0.5mg/kg)后肿瘤组织的体积，给药后肿瘤组织的体积显著减少。
[0048]
图3b为胶质母细胞瘤小鼠对照组和给药组的生存周期，给药组的平均生存周期跟对照组相比显著提高，其中0.25mg/kg的药物x处理可以较好的延长生存周期。
[0049]
图3c为胶质母细胞瘤小鼠的体重曲线，其中tmz和药物x联合用药体重下降的较慢。
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图3d显示tmz、不同浓度的药物x均可以显著降低肿瘤病灶的大小，左边为给药前，右边为给药后的核磁检测图像(t2相)。其中0.25mg/kg的药物x处理对病灶的降低最为明显。
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实验结果显示，式1表示的adamts5抑制剂具有良好的抗胶质母细胞瘤活性。且adamts5抑制剂与替莫唑胺(tmz)联合用药物对人源胶质瘤细胞(cdx)模型具备显著的抗肿瘤效果。