一种快速区分燕窝罐头商业无菌的检测方法与流程

1.本发明涉及一种利用顶空气相色谱-质谱联用(headspace gas chromatography-massspectrometry，hs-gc-ms)技术快速区分燕窝罐头商业无菌的检测方法。


背景技术：

2.罐头食品在生产过程中控制微生物引发的腐败变质及其产生毒素是至关重要的。密封不良或者杀菌不足会造成内容物腐败变质或平酸菌败坏
1.。燕窝罐头，是将经过一定处理的燕窝装入容器，经密封杀菌，使瓶内燕窝与外界隔绝而不再被微生物污染，同时又使瓶内不再滋生微生物或酶失去活力，从而消除了引起食品变败的主要原因，获得在室温下长期贮藏的保藏方法。一般保质期在3-12个月不等。
3.我国为了规范罐头食品安全，针对罐头食品的微生物检测制定了专门的检测标准 gb4789.26-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》。标准中商业无菌检验的原理为：将罐头食品在特定温度下保温十天。保温过程中，罐头内未被充分杀死的微生物会利用罐头食品本身的营养进行生长繁殖，导致ph值变化、气体产生、产品感官的变化(外观，色泽，气味等)，通过涂片染色镜检可以看到有明显的微生物增殖情况。罐头食品经保温试验出现胖听或泄露，经过感官检查不正常、ph值有明显变化、涂片镜检微生物有明显增殖现象时为非商业无菌。燕窝罐头保质期一般最短只有3个月，该方法检测周期长，因此建立一种快速的检测燕窝罐头商业无菌的方法，十分必要。
4.微生物的生长会产生二氧化碳，燕窝罐头腐败后，产生的二氧化碳使容器膨胀。通过比较保温前后燕窝罐头中顶部空气中二氧化碳水平变化，判断是否商业无菌：若二氧化碳水平发生显著变化，说明样品中有微生物繁殖，则判定为非商业无菌；在指定的天数之后，若二氧化碳水平没有发生显著的变化，则判定为商业无菌。非商业无菌的燕窝罐头的进一步验证，留样按gb 4789.26-2013中进行附录b异常原因分析试验并记录。
5.本方法采用顶空气相色谱质谱联用法对燕窝罐头顶空中的二氧化碳等气体进行检测，通过比较保温前后罐头食品顶空中二氧化碳水平变化，对罐头食品是否为商业无菌进行判断。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种快速区分燕窝罐头商业无菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
7.本发明的主要原理为：利用顶空气相色谱-质谱联用(headspace gas chromatography-massspectrometry，hs-gc-ms)技术检测正常燕窝罐头与腐败燕窝罐头中保温前后顶部空气中二氧化碳水平，根据二氧化碳水平是否发生显著变化，区分燕窝罐头商业无菌。
8.1、燕窝罐头的前处理
9.开启包装后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5ml至灭菌
顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1ml上层气体进样；同时用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5ml至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后 30℃～40℃放置1～5d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1ml上层气体进样。
10.2、hs-gc-ms分析条件
11.顶空(hs)进样条件：加热箱温度30～50℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1～10min；进样体积：1ml；分流比：70:1。
12.气相色谱(gc)条件：色谱柱(30m
×
250μm
×
3μm)；进样口温度：220℃；载气：高纯氦(he)，流速：1.2ml/min。
13.质谱(ms)条件：离子源ei，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70ev，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300u。
14.3、燕窝罐头顶空气测定
15.3.1将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比大于100的色谱峰；质谱图的相似度≥80％的色谱峰，ms结果经计算机检索谱库进行定性分析，利用面积归一法计算，得到燕窝罐头食品试样顶空气体的含量。空气本底、正常和异常燕窝罐头保温前后顶空气体的含量参见实施例。
16.3.2罐头食品顶空气体的百分比yi，按式(1)计算，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量：
[0017][0018]
式中：
[0019]
yi——燕窝罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率(％)；
[0020]
asi——燕窝罐头中某种顶空气体i的峰面积；
[0021]
∑asi——燕窝罐头中所有顶空气体峰面积之和。
[0022]
结果保留3位有效数字。
[0023]
燕窝罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；燕窝罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量显著增加(峰面积百分比差值超过10％)，表明有微生物繁殖，结果为阳性。
[0024]
仪器分析结果为阴性，感官检查、ph测定正常，则报告为商业无菌。
[0025]
仪器分析结果为阳性，经过国标gb 4789.26-2013验证试验无微生物增殖现象，则报告为商业无菌。
[0026]
仪器分析结果为阳性，经过国标gb 4789.26-2013验证试验有微生物增殖现象，则报告为非商业无菌。
[0027]
该检测方法作为一种燕窝罐头商业无菌的初步筛选工具，比现有的传统检测方法时间缩短5～6天，不但可以降低检测成本，而且还适应快速发展的国际贸易需求。
附图说明
[0028]
图1是空气本底总离子流(tic)质谱色谱图。
[0029]
图2是商业无菌的燕窝罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(tic)质谱色谱图。
[0030]
图3是非商业无菌的燕窝罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(tic)质谱色谱图。
具体实施方式
[0031]
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
[0032]
实施例1
[0033]
(1)、燕窝罐头的前处理
[0034]
开启包装后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5ml至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后作为保温前检测，用顶空针抽取1ml上层气体进样；同时用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物至少5ml至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口36℃放置 3d后，作为保温后检测，设定顶空自动进样器条件，用顶空针抽取1ml上层气体进样。
[0035]
(2)、hs-gc-ms分析条件
[0036]
顶空(hs)进样条件：加热箱温度36℃，定量环温度：60℃，传输线温度：60℃，样品平衡时间：1min；进样体积：1ml；分流比：70:1。
[0037]
气相色谱(gc)条件：agilent cp7348pt porabond q pt色谱柱色谱柱(30m
×
250μm
ꢀ×
3μm)；进样口温度：220℃；载气：高纯氦(he)，流速：1.2ml/min。
[0038]
质谱(ms)条件：离子源ei，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70ev，传输线温度230℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：20～300u。
[0039]
(3)、燕窝罐头顶空气测定
[0040]
3.1将试样注入气相色谱-质谱联用仪，设定自动识别信噪比大于100的色谱峰；质谱图的相似度≥80％的色谱峰，ms结果经计算机检索谱库进行定性分析，利用面积归一法计算，得到燕窝罐头食品试样顶空气体的含量。空气本底、正常和异常燕窝罐头保温前后顶空气体的含量参见表1、表2、表3。
[0041]
3.2罐头食品顶空气体的百分比yi，按式(1)计算，通过测定相应峰面积对所有成分峰面积总和的百分数来计算给定组分i的含量：
[0042][0043]
式中：
[0044]
yi——燕窝罐头中某种顶空气体占总顶空气体的百分比，单位为百分率(％)；
[0045]
asi——燕窝罐头中某种顶空气体i的峰面积；
[0046]
∑asi——燕窝罐头中所有顶空气体峰面积之和。
[0047]
结果保留3位有效数字。
[0048]
燕窝罐头保温前后顶空气体中二氧化碳含量未有显著增加，结果为阴性；罐头食品保温前后顶空气体中二氧化碳量显著增加(峰面积百分比差值超过10％)，表明有微生物繁殖，结果为阳性。
[0049]
仪器分析结果为阴性，感官检查、ph测定正常，则报告为商业无菌。
[0050]
仪器分析结果为阳性，经过国标gb 4789.26-2013验证试验无微生物增殖现象，则报告为商业无菌。
[0051]
仪器分析结果为阳性，经过国标gb 4789.26-2013验证试验有微生物增殖现象，则报告为非商业无菌。
[0052]
表1空气本底质谱色谱峰对应气体列表
[0053][0054]
5ml无菌水至灭菌顶空进样瓶内，顶空瓶封口后检测空气本底气体组成，空气本底总离子流(tic)质谱色谱图(图1)，结果为空气本底二氧化碳含量低于2％，结果见表1。
[0055]
表2商业无菌的燕窝罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
[0056][0057]
国标方法检测为商业无菌的燕窝罐头，燕窝罐头内容物5ml至灭菌顶空进样瓶内，商业无菌的燕窝罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(tic)质谱色谱图(图2)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为0.18％，未有显著增加，结果为阴性，与国标方法检测方法一致，均为商业无菌，结果见表2。
[0058]
表3非商业无菌的燕窝罐头保温前后质谱色谱峰对应气体列表
[0059][0060]
国标方法检测为非商业无菌的燕窝罐头，燕窝罐头内容物5ml至灭菌顶空进样瓶内，非商业无菌的燕窝罐头保温前和保温后顶空气体总离子流(tic)质谱色谱图(图3)，结果为保温前和保温后二氧化碳含量差值(峰面积百分比差值)为14.95％，二氧化碳量显著增加，结果为阳性，与国标方法检测方法一致，均为非商业无菌，结果见表3。