含有紫杉叶素的肝纤维化抑制剂和褐色脂肪细胞活化剂的制作方法

1.本发明涉及含有紫杉叶素作为有效成分的肝纤维化抑制剂和褐色脂肪细胞活化剂。此外，本发明还涉及利用含紫杉叶素的肝纤维化抑制剂的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗用途。


背景技术：

2.由于饮食生活的欧美化、运动不足等，在日本肥胖也增加，糖尿病和代谢综合征包括预备患者在内，分别上升至2200万人、2000万人。而且，近年来，伴随肥胖人口的增加，非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis：以下称为“nash”)等非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease：以下称为“nafld”)患病者急剧增加至体检的约3成、推定接近1500~2300万人，根据最新的数据，推定其中的约25%左右发展为nash，进一步如果发展为nash的纤维化，则约25%左右发病为肝硬化，并且进一步其中的约25%在10年内发病为肝细胞癌。然而，脂肪肝发展为nash的机理尚不明确，此外，nash的确诊中需要侵入性肝活检，因此难以大规模研究，未确立明确的进展因子
·
生物标志物(非专利文献1)。进一步，当前作为治疗法，基本上为饮食
·
运动疗法等生活习惯的改善，作为药物疗法，证据程度高的报告少，未确立标准的治疗法。在病毒性肝炎已经能够治疗的时代的当前，nash的预防
·
治疗对策成为紧迫的课题。
3.肥胖是指在白色脂肪细胞中脂肪蓄积而肥大化，同时白色脂肪细胞分化，其数量增加的状态。与此相对地，褐色脂肪细胞与白色脂肪细胞同样储存脂肪，但通过在线粒体中存在的解偶联蛋白质1(uncoupling protein 1：以下称为“ucp1”)的作用，不经过电子传递系统中的atp合成而将脂肪转化为热。在生物体内，可以认为通过利用白色脂肪细胞的能量储存以及经由atp合成系的能量补充、和利用褐色脂肪细胞的产热的能量消耗，进行全身性能量代谢、体脂调节。最近的研究中，褐色脂肪细胞中已知存在在胚发生初期时已经决定了细胞命运的“既有型”、和在成人中由于各种各样的环境因素等而由白色脂肪细胞分化诱导的“诱导型”这2种(非专利文献2)。在人中，“既有型”的褐色脂肪细胞在肩甲骨周围和脖颈的后部、肾周围等有限的部位少量存在，随着年龄增加而减少，但据报告，由于长期的寒冷刺激等环境因素等，在成人的白色脂肪组织中存在的白色脂肪前体细胞分化为“诱导型”的褐色脂肪细胞。因此，通过促进从白色脂肪前体细胞向褐色脂肪细胞的分化、或者激活褐色脂肪细胞，能量消耗亢进，抑制生物体中的过剩的脂肪蓄積，能够预防或改善代谢综合征(例如肥胖、糖尿病、脂质异常症、高血压症等)等。一般而言，源自代谢综合征等的慢性炎症诱导间质纤维化，最终导致脏器功能衰竭，这在脂肪组织中也不例外。最近，报告了在褐色脂肪细胞的分化和其功能的维持中发挥作用的转录因子、即prdm16与产热无关地(ucp1非依赖性)抑制脂肪组织的纤维化(非专利文献3)。
4.近年来，作为最安全的药剂的植物性制剂备受关注。其中，作为植物性制剂中的有效成分的类黄酮已知其固有的抗氧化活性和广泛的生物学效果(免疫增强作用、抗肿瘤作用、心脏保护作用、放射线损害防护作用、防老化作用、抗血小板作用、抗过敏作用、抗病毒
作用等)(非专利文献4~6)。特别地，在俄罗斯生产各种各样的植物性制剂， 200种以上的植物原料被用于医疗目的。在俄罗斯，植物性制剂占所制造的药剂的种类的约40%，其中大部分中包含类黄酮。
5.最近，该含类黄酮的药剂的列表中，增加了从兴安落叶松或西伯利亚落叶松的木质部分离的生物类黄酮复合体、即dicubertin（
ジクベルチン
）。占“dicubertin”的有效成分的大部分(90%以上)的是紫杉叶素(非专利文献7)。紫杉叶素据报告具有抗氧化特性和毛细血管保护特性(非专利文献8)，由俄罗斯联邦卫生部批准作为具有毛细血管保护和抗氧化特性的医药品。此外，作为功能性食品，也批准作为延长食品的保质期限的食品添加物。进一步，紫杉叶素最近确认了摄取方面的安全性(非专利文献9)，同时确认了在急性胰腺炎模型小鼠中的抗氧化作用(非专利文献10)、在1型糖尿病模型大鼠中的血糖改善效果(非专利文献11)、在阿尔兹海默症模型小鼠中的淀粉样蛋白β凝集抑制、脑血流的改善、水迷宫试验中的小鼠的空间认知功能的改善等痴呆症改善效果(专利文献1、非专利文献12)。
6.然而，紫杉叶素与肝纤维化抑制作用、褐色脂肪细胞活化作用相关的报告例尚不存在，此外，紫杉叶素作为伴随纤维化的nash的预防和/或治疗剂的用途的相关报告例也不存在。
7.现有技术文献专利文献专利文献1 : 国际公开第2017/199755号非专利文献非专利文献1 : nafld/nash診療
ガイドライン
２０１４，日本消化器病学会编，南江堂非专利文献2 : cell metabolism,2010,11:257
−
262非专利文献3 : cell metabolism,2018,27:180
−
194.e6非专利文献4 : pharmacol.rev.,2000,52(4):673
−
751非专利文献5 : fitoterapia,1991,62(5):371
−
389非专利文献6 : drug metabol.drug interact.,2000,17(1
−
4):291
−
310非专利文献7 : опчоп.вeн,1998,19非专利文献8 : хйм
−
фарм.журн,1995,29,9,61
−
64非专利文献9 : int.j.toxicol.,2015,34(2),162
−
181非专利文献10 : j.ethnopharmacol.,2018,224,261
−
272非专利文献11 : j.cell.biochem.,2019,120(1),425
−
438非专利文献12 :acta neuropathol.commun.,2017,5(1),26,doi:10.1186/s40478
−
017
−
0429
−
5。


技术实现要素：

8.发明要解决的课题在这样的背景下，迫切期望开发以尚未确立预防法、治疗法的nash、特别是可能发展为肝硬化、肝细胞癌的伴随肝纤维化的nash作为靶标的新型肝纤维化抑制剂，和创造利用其的nash的预防剂和/或治疗剂，以及开发有效促进体内的能量消耗、且也能够抑制脂肪
组织的纤维化的褐色脂肪细胞活化剂。
9.本发明的目的在于，对nash提供抑制纤维化的进展的新型肝纤维化抑制剂。此外，本发明的目的在于，提供新型褐色脂肪细胞活化剂。本发明的进一步的目的在于，提供对伴随肝纤维化的慢性肝病(丙型肝炎、乙型肝炎、nash等非乙型、非丙型肝炎、自身免疫性肝炎等)、特别是伴随肝纤维化的nash的预防和/或治疗(或者改善)而言有效的医药组合物或食品组合物。
10.用于解决课题的手段本发明人等在所述状况下进行了反复深入研究，结果首次发现，紫杉叶素或其盐示出优异的肝纤维化抑制作用和褐色脂肪细胞活化作用，同时在迄今没有有效的预防法、治疗法的伴随肝纤维化的nash的预防和/或治疗中能够成为有用且安全的医药组合物或食品组合物，从而完成了本发明。
11.即，本发明如下所述。
12.[1]肝纤维化抑制剂，其含有紫杉叶素作为有效成分。
[0013]
[2]根据上述[1]所述的肝纤维化抑制剂，其中，肝纤维化由肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝炎或自身免疫性肝炎引起。
[0014]
[3]根据上述[1]所述的肝纤维化抑制剂，其中，肝纤维化由非酒精性脂肪肝炎引起。
[0015]
[4]褐色脂肪细胞活化剂，其含有紫杉叶素作为有效成分。
[0016]
[5]根据上述[4]所述的褐色脂肪细胞活化剂，其用于抑制肝纤维化。
[0017]
[6]根据上述[5]所述的褐色脂肪细胞活化剂，其中，肝纤维化由肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝炎或自身免疫性肝炎引起。
[0018]
[7]根据上述[5]所述的褐色脂肪细胞活化剂，其中，肝纤维化由非酒精性脂肪肝炎引起。
[0019]
[8]伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗剂，其含有上述[1]~[7]中任一项所述的药剂作为有效成分。
[0020]
[9]根据上述[5]所述的褐色脂肪细胞活化剂，其用于促进能量消耗。
[0021]
[10]根据上述[5]所述的褐色脂肪细胞活化剂，其用于使ucp1的表达亢进。
[0022]
[11]根据上述[1]~[10]中任一项所述的药剂，其特征在于，以片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、锭剂或液体制剂的形态被制备。
[0023]
[12]伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗剂，其含有预防和/或治疗有效量的紫杉叶素或其盐作为有效成分。
[0024]
[13]伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防或改善用食品组合物，其含有有效量的紫杉叶素或其盐作为有效成分。
[0025]
[14]根据上述[13]所述的食品组合物，其中，附有“肝纤维化的风险减少用途”和/或“能量代谢促进用途”的标注。
[0026]
[15]根据上述[13]或[14]所述的食品组合物，其特征在于，作为补剂、功能性食品、健康食品、特殊用途食品、保健功能食品、特定保健用食品或营养功能食品而制备。
[0027]
[16]根据上述[13]~[15]中任一项所述的食品组合物，其特征在于，以片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、锭剂或液体制剂的形态被制备。
[0028]
[17]伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗方法，其特征在于，向对象经口给与预防和/或治疗有效量的紫杉叶素或其盐。
[0029]
[18]紫杉叶素或其盐，其用于伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗。
[0030]
[19]含紫杉叶素的医药组合物，其用于伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗。
[0031]
[20]含紫杉叶素的食品组合物，其用于肝纤维化的预防和/或改善。
[0032]
[21]紫杉叶素或其盐在制造用于伴随肝纤维化的非酒精性脂肪肝炎的预防和/或治疗的药物中的用途。
[0033]
发明的效果根据本发明，能够提供优异的肝纤维化抑制剂，其特征在于，含有源自安全的植物的成分、即紫杉叶素或其盐作为有效成分。由此，对nash也能够抑制纤维化的进展。此外，根据本发明，能够提供含有紫杉叶素或其盐作为有效成分的优异的褐色脂肪细胞活化剂。由此，能够促进能量消耗、或使ucp1的表达亢进，此外，还能够有效地抑制脂肪组织的纤维化，其结果是，能够预防或改善代谢综合征等。进一步，根据本发明，通过向对象给与预防和/或治疗有效量的肝纤维化抑制剂和/或褐色脂肪细胞活化剂、即紫杉叶素或其盐，能够提供在由各种各样的原因(肝炎病毒感染、nash、自身免疫性肝炎等)引起的肝纤维化的预防和/或治疗(或者改善)中有用的医药或食品组合物。尤其是，根据本发明，能够提供迄今未知有效的预防或治疗法的伴随纤维化的nash的新型且有效的预防剂。此外，通过与食物疗法、运动疗法、药物疗法(与其它药物的组合使用疗法)、除铁疗法和/或外科的治疗(减量手术、肝移植)组合，也能够增强本发明中的紫杉叶素或其盐的预防和/或治疗效果。
附图说明
[0034]
图1a是表示摄食实验中的小鼠的体重变化的图，图1b是表示摄食实验最终日时的各组小鼠的外观的照片。
[0035]
图2是表示摄食实验期间的小鼠的摄食量的变化的图。
[0036]
图3a是表示空腹时血糖的变化的图，图3b是表示将腹腔内葡萄糖负载试验的开始时刻记作0分钟，30分钟、60分钟和120分钟后的血糖值的变化的图，图3c是表示各组小鼠的餐后血糖曲线下面积的图。
[0037]
图4a是表示从摄食实验开始起经过8周和12周时的小鼠的直肠温度变化的图，图4b是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠中的ucp1基因表达的图。
[0038]
图5是表示解剖时的各组小鼠的组织重量的图(图5a：肝脏重量，图5b：附睾脂肪(epi wat)重量，图5c：褐色脂肪组织(bat)重量)。
[0039]
图6是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的空腹时血糖(fbc)(图6a)、胰岛素浓度(图6b)和胰岛素抵抗性指标(homa-r)(图6c)的图。
[0040]
图7是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的血中甘油三酯浓度的图。
[0041]
图8是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的血中瘦素浓度(图8a)、血中脂连蛋白浓度(图8b)、血中tnf-α浓度(图8c)和血中il-1β浓度(图8d)的图。
[0042]
图9是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的血中ast值(图9a)、血中alt值
(图9b)和肝脏甘油三酯浓度(图9c)的图，图9d是摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的肝脏外观的照片。
[0043]
图10是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的肝脏ampk磷酸化(上段：蛋白免疫印迹带)(图10a)和肝脏acc磷酸化(上段：蛋白免疫印迹带)(图10b)的图。
[0044]
图11是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠中的肝脏脂肪酸合成相关基因的表达的比较(图11a)和脂肪酸氧化相关基因的表达的比较(图11b)的图。
[0045]
图12是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的血中过氧化脂质浓度(图12a)、肝脏过氧化脂质浓度(图12b)、mn-sod基因表达(图12c)、cuzn-sod基因表达(图12d)、过氧化氢酶（catalase）基因表达(图12e)和gp-x(glutathione peroxidase，谷胱甘肽过氧化物酶)基因表达(图12f)的图。
[0046]
图13是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的肝脏的f4/80基因表达(图13a)、tnf-α基因表达(图13b)和il-1β基因表达(图13c)的图。
[0047]
图14是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的肝脏的p38 mapk磷酸化(图14a)、nf-κb磷酸化(图14b)和jnk磷酸化(图14c)的图。
[0048]
图15是表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠的肝脏纤维化指标组的基因表达(αsma基因表达(图15a)、pai1基因表达(图15b)、tgf-β1基因表达(图15c)和type1 collagen基因表达(图15d))、以及蛋白质量(f4/80蛋白质量(图15e)、αsma蛋白质量(图15f)和tgf-β1蛋白质(图15g))的图。
[0049]
图16表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠(a：仅普通食、b：普通食 3%紫杉叶素、c：仅高脂肪食、d：高脂肪食 3%紫杉叶素)的肝脏组织进行苏木精-曙红(he)染色的照片(比例尺：白框内100μm，其它500μm)。
[0050]
图17表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠(a：仅普通食、b：普通食 3%紫杉叶素、c：仅高脂肪食、d：高脂肪食 3%紫杉叶素)的肝脏组织进行偶氮卡红(azan)染色的照片(比例尺：50μm)。
[0051]
图18表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠(a：仅普通食、b：普通食 3%紫杉叶素、c：仅高脂肪食、d：高脂肪食 3%紫杉叶素)的肝脏组织进行天狼星红(sirius red)染色的照片(比例尺：100μm)。
[0052]
图19表示摄食实验开始经过12周后的各组小鼠(a：仅普通食、b：普通食 3%紫杉叶素、c：仅高脂肪食、d：高脂肪食 3%紫杉叶素)的肝脏组织通过抗f4/80抗体进行免疫组织化学染色的照片(比例尺：100μm)。
具体实施方式
[0053]
本说明书中使用的术语如以下那样定义。
[0054]
本说明书中，“紫杉叶素”是指下述式(1)：[化1]
所示的化合物。紫杉叶素是占从兴安落叶松或西伯利亚落叶松的木质部分离的生物类黄酮复合体、即dicubertin的有效成分的大部分(90%以上)的类黄酮的一种。
[0055]
本说明书中，作为紫杉叶素的盐，可以举出通过使医药可接受的碱作用而能够容易地形成的盐。作为这样的盐，可以举出例如钠盐、钾盐等碱金属盐等。
[0056]
源自西伯利亚落叶松的紫杉叶素是光学活性体(( )-紫杉叶素)。本发明的紫杉叶素中，不仅包括( )-紫杉叶素，还包括作为其镜像异构体的(-)-紫杉叶素、光学纯度低的化合物(将光学纯的两种镜像异构体以适当的配合比混合得到的物质)和外消旋体。此外，本发明的紫杉叶素还包括标记体、即构成紫杉叶素的1或2种以上的原子被同位素(例如2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
15
n、
18
o、
18
f、
35
s等)标记的化合物。
[0057]
本发明的紫杉叶素或其盐的光学活性体可以通过本身公知的方法而化学合成，或者通过从兴安落叶松或西伯利亚落叶松的木质部提取和/或精制从而制造。具体而言，可以通过使用光学活性的合成中间体，或将最终物的外消旋体按照常规方法(参照例如j.jacques等人的“enantiomers,racemates and resolution,john wiley and sons,inc.”等)进行光学拆分，从而得到光学活性体。此外，( )-紫杉叶素有市售，也可以直接使用市售品。
[0058]
本发明的紫杉叶素或其盐可以是晶体，晶型可以是单一的或晶型混合物均包括在紫杉叶素或其盐中。晶体可以应用本身公知的结晶法通过结晶化而制造。
[0059]
本发明的紫杉叶素或其盐中，还可以包括它们的溶剂化物。它们的溶剂化物是指在紫杉叶素或其盐上配位有溶剂的分子，也包括水合物。例如，可以举出紫杉叶素或其盐的水合物、乙醇化物、二甲基亚砜化物等。
[0060]
本说明书中，“非酒精性脂肪性肝病(nafld)”是指根据nafld/nash诊疗指南2014(日本消化器病学会编，南江堂；非专利文献1)，在组织诊断或图像诊断中确认脂肪肝，排除了酒精性肝损害等其它肝病的病态。nafld被分类为在组织学上以大滴性(使核不均匀存在程度的大脂肪滴)的肝脂肪变性作为基础而发病、可以认为病态几乎不发展的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver：以下称为“nafl”)、和非酒精性脂肪肝炎(nash)。nafl中，未确认到肝细胞损害(气球样变性)、纤维化。
[0061]
本说明书中，“非酒精性脂肪肝炎(nash)”是指根据nafld/nash诊疗指南2014(日本消化器病学会编,南江堂；非专利文献1)，进行性且也成为肝硬化、肝细胞癌的发病病灶的病态，是除了肝细胞的大滴性脂肪化(肝脂肪变性)之外，还确认到伴有炎症的肝细胞的气球样变性(肝细胞损害)、纤维化的病态。根据脂肪化的程度、气球样变性等肝细胞的变
化、炎症的程度、纤维化的进展
·
恶化的程度，被分类为轻度、中度、重症。此外，nash如果是初期则也存在未确认到纤维化的病例，但由于纤维化的进展而导致大多数病例中观察到脂肪滴的减少
·
消失，因此需要注意。根据younossi等人的诊断基准(hepatology,2011；53：1874-1882)，在nash的病理诊断中，纤维化的程度才被视为规定重症度的因素。本发明的肝纤维化抑制剂对伴随肝纤维化的nash(中等度以上的nash)的预防和/或治疗是特别有效的。
[0062]
本说明书中，“肝纤维化”是指弥漫性肝病(急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化等)的基本病态，其程度与病态的进行相关。高度的肝纤维化意味着向肝硬化的转移，且暗示肝细胞癌发生的高风险。在各种各样的肝病中，有肝纤维化的程度与包括全死亡率在内的预后强相关的报告(例如j.gastroenterol.,2016；51：380-389等)。此外，通过近年的病毒性肝炎治疗的进步，证明了肝纤维化是可逆的病态。
[0063]
肝纤维化的评价除了利用肝活检的组织诊断之外，还可以使用纤维化扫描仪而非侵入性地测定肝脏的硬度。最近，报告了被称为冠状结构(cls)的特征性组织图像在肥胖的脂肪组织、nash中共通形成，以此为起点而组织纤维化进行(例如菅波孝祥,上原纪念生命科学财团研究报告集,31(2017)等)。
[0064]
本说明书中，“肝纤维化抑制剂”是指通过向对象给与从而抑制肝纤维化的进展的药剂。此外，“肝纤维化抑制剂”中，还包括改善纤维肝的药剂。成为本发明的“肝纤维化抑制剂”的对象的肝纤维化没有特别限定，适合地由肝炎病毒感染、nash或自身免疫性肝炎引起，更适合地由nash引起。
[0065]
本说明书中，“褐色脂肪细胞活化剂”是指通过促进在对象的白色脂肪组织中分化诱导褐色脂肪细胞的作用(即，增加褐色脂肪细胞数的作用)和/或活化褐色脂肪细胞从而使ucp1的表达亢进，由此示出使能量消耗亢进的作用的物质。
[0066]
褐色脂肪细胞的存在、褐色脂肪细胞数的变化和/或褐色脂肪细胞中的能量消耗量的上升可以通过测定褐色脂肪组织重量、直肠温度、测定ucp1 mrna表达、ucp1蛋白质量、组织学上观察细胞、通过pet测定
18
f标记葡萄糖的积累、测定寒冷诱导产热等来评价。
[0067]
本说明书中，“促进能量消耗”是指通过产热而提高褐色脂肪细胞的能量消耗量。
[0068]
本说明书中，“使ucp1的表达亢进”是指促进对象中的ucp1基因的表达量、增大ucp1蛋白质的翻译量和活化ucp1之中至少任一种作用。通过使ucp1的表达亢进，能够在促进白色脂肪细胞中的脂肪分解的同时活化ucp1，将游离的脂肪酸转变为热，最终减少体脂肪，因此能够期待抗肥胖效果。
[0069]
本说明书中，“预防”中包括防止疾病的发病、延迟疾病的发病和防止病态发生。“预防有效量”是指足以实现预防目的的有效成分的用量。
[0070]
本说明书中，“治疗”中包括治愈疾病、改善疾病的病态(例如1个或多个症状)和抑制疾病(的重症度)的进展。“治疗有效量”是指足以实现治疗目的的有效成分的用量。因此，“改善”是被包括在“治疗”中的概念。
[0071]
本说明书中，“对象”是指为了预防和/或治疗(或者改善)疾病或疾病的病态而给与或摄取含有必要的有效量的有效成分的医药或食品的对象。作为该“对象”，可以举出人或非人动物(特别是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、羊、猴等))。
[0072]
本说明书中，“饮食疗法”是指通过将炭水化合物的能量比率限制为50~60%、将脂
质的能量比率限制为20~25%的低卡路里饮食摄取而实现体重减少的疗法。作为具体的体重减少的目标，例如在bmi(body mass index，体重指数)为25~30的肥胖症的情况下，可以举出实现体重的3%以上的体重减少，bmi为35以上的高肥胖症的情况下，可以举出现体重的5~10%的体重减少(参照肥胖症诊疗指南2016)，nafld/nash患者的情况下，可以举出7%以上的体重减少(参照nafld/nash诊疗指南2014)等。
[0073]
本说明书中，“运动疗法”是指通过例如最大强度的50%左右(轻微出汗程度)的有氧运动每1次30~60分钟、每周3~4次、持续4~12周，从而改善肝脂肪化的疗法。
[0074]
本说明书中，“药物疗法”是指通过与后述的其它药剂的组合使用而实现作用的增强、副作用的减少等的疗法。
[0075]
本说明书中，“除铁疗法”是指减少对肝脏造成负担的过量铁的摄取的疗法。作为除铁疗法，具体而言，可以举出放血疗法(每2周1次放出200~400ml的血液的疗法)和铁限制饮食(将1日的饮食中的铁设为6~7mg以下)。
[0076]
本发明的药物组合物(本发明的预防和/或治疗剂)如后述试验例所示，紫杉叶素示出优异的肝纤维化抑制作用(肝脏的amp活化蛋白激酶(ampk)活化、肝脏组织中的炎性细胞因子的表达抑制和肝脏组织的纤维化的减少)和褐色脂肪细胞活化作用(直肠温度的上升和ucp1基因的表达的增加)，因此紫杉叶素或其盐、或者含有其作为有效成分的组合物能够适合用作肝纤维化抑制剂(以下称为“本发明的肝纤维化抑制剂”)和/或褐色脂肪细胞活化剂(以下称为“本发明的褐色脂肪细胞活化剂”)。此外，与该肝纤维化抑制作用、褐色脂肪细胞活化作用相关地，发现nash的纤维化防止效果、抗肥胖效果、糖耐量改善和胰岛素抵抗性提高，因此本发明的肝纤维化抑制剂和/或褐色脂肪细胞活化剂不仅作为各种代谢综合征的预防和/或治疗剂，还作为伴随纤维化的nash的预防和/或治疗剂是有用的。显著抑制肝脏组织的纤维化的药剂迄今几乎未知，因此本发明的药物能够成为重症度高的nash的有效的预防和/或治疗剂。
[0077]
以下，本说明书中，紫杉叶素或其盐、或者含有其作为有效成分的药物组合物有时也称为“本发明的药物”或“本发明的预防和/或治疗剂”。
[0078]
本发明的药物可以是仅由紫杉叶素或其盐组成的药物、或者配合了紫杉叶素或其盐与药物上可接受的载体等的药物中任一者。本发明的药物可以向对象经口给与其预防有效量或治疗有效量。
[0079]
作为药物上可接受的载体，可以举出例如赋形剂(例如淀粉、乳糖、砂糖、碳酸钙、磷酸钙等)、粘结剂(例如淀粉、阿拉伯胶、羧基甲基纤维素、羟基丙基纤维素、结晶纤维素等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石等)、崩解剂(例如羧基甲基纤维素、滑石等)、溶剂(例如注射用水、生理食盐水、林格氏液、酒精、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油等)、助溶剂(例如聚乙二醇、丙二醇、d-甘露醇、海藻糖、苯甲酸苯甲酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等)、悬浮化剂(例如硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素等包衣基材；聚山梨醇酯类、聚氧乙烯氢化蓖麻油等)、等渗化剂(例如氯化钠、甘油、d-甘露醇、d-山梨糖醇、葡萄糖等)、缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等缓冲液等)、增稠剂(例如藻酸钠、黄原胶、软骨素硫酸钠、聚乙烯醇、
聚维酮等)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等)、抗氧化剂(例如亚硫酸盐、抗坏血酸盐等)、着色剂(例如水溶性食用焦油色素(例如食用红色2号和3号、食用黄色4号和5号、食用蓝色1号和2号等食用色素)、水不溶性色淀色素(例如前述水溶性食用焦油色素的铝盐)、天然色素(例如β-胡萝卜素、叶绿素、氧化铁红)等)、甜味剂(例如糖精钠、甘草酸二钾、阿斯巴甜、甜菊糖等)等。
[0080]
本发明的药物(即，本发明的预防和/或治疗剂)可以将上述各种成分混合后，将混合物按照本身公知的手段，制成例如片剂、丸剂、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、微胶囊)、散剂、颗粒剂、细粒剂、锭剂或液体制剂(包括糖浆剂、乳剂、混悬剂)等经口给与用的制剂。
[0081]
关于片剂、颗粒剂、细粒剂的形状的食品组合物，为了掩蔽味道、提高光稳定性、提高外观或者肠溶性等目的，可以使用前述包衣基材而通过本身公知的方法包衣。
[0082]
本发明的药物中的紫杉叶素或其盐的含量根据制剂的形态而不同，通常相对于制剂整体，为约10~100重量%、优选为约30~100重量%、更优选为约50~100重量%。
[0083]
紫杉叶素或其盐的给与量(即，预防有效量或治疗有效量)根据给与对象、疾病、症状、剂型、给与途径等而不同，例如人的情况下，对成人的患者(体重约60kg)经口给与的情况下，每1天换算为作为有效成分的紫杉叶素，则可以通常将10~10000mg、优选为30~1000mg、更优选为50~500mg分为1天1次至多次给与，餐前、餐后、随餐均可。给与间隔没有特别限定。
[0084]
紫杉叶素或其盐可以与其它疗法(即，前述饮食疗法、运动疗法、药物疗法、除铁疗法、外科的治疗)组合使用。由此，可以增强紫杉叶素或其盐的预防和/或治疗效果。这些之中，特别优选与饮食疗法和运动疗法的组合、或与药物疗法的组合。
[0085]
与药物疗法的组合的具体方式示于以下。
[0086]
紫杉叶素或其盐只要不损害其药效，则可以与其它药剂(组合使用药)组合使用。此时，给与间隔没有限定，将它们可以对对象同时给与，也可以隔有时间差给与。此外，也可以制成组合含有紫杉叶素或其盐和组合使用药的单一制剂而给与。
[0087]
组合使用药的给与量可以以在临床上使用的用量作为基准而适当选择。此外，紫杉叶素或其盐与组合使用药的配合比可以根据给与对象、给与途径、对象疾病、症状、组合使用药的种类等而适当选择。
[0088]
作为将紫杉叶素或其盐(或者本发明的褐色脂肪细胞活化剂)用于nash的预防和/或治疗时的组合使用药，可以举出例如胰岛素抵抗性改善药、hmg-coa还原酶抑制药、血管紧张素ii受体拮抗药、非他汀系高胆固醇血症治疗药、抗氧化药等。
[0089]
作为“胰岛素抵抗性改善药”，可以使用例如噻唑烷衍生物(例如盐酸吡格列酮、曲格列酮、罗格列酮或其马来酸盐、gi-262570、jtt-501、mcc-555、ym-440、krp-297、cs-011、fk-614、nn-622、az-242、bms-298585、ono-5816、lm-4156、bm-13-1258、mbx-102、gw-1536等)、双胍(例如苯乙双胍、二甲双胍、丁二胍等)等。
[0090]
作为“hmg-coa还原酶抑制药”，可以使用例如普伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、非诺贝特、西立伐他汀、itabastatin、罗伐他汀或它们的盐(例如钠盐等)等。
[0091]
作为“血管紧张素ii受体拮抗药”，可以使用例如坎地沙坦酯、氯沙坦、依普沙坦、缬沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦、他索沙坦等。
[0092]
作为“非他汀系高胆固醇血症治疗药”，可以使用例如依泽替米贝等。
[0093]
作为“抗氧化药”，可以使用例如维生素e、甜菜碱、己酮可可碱、n-乙酰基-l-半胱氨酸等。
[0094]
本发明的食品组合物以下，本说明书中，紫杉叶素或其盐、或者含有其作为有效成分的食品组合物也可以称为“本发明的食品组合物”。
[0095]
本发明的食品组合物可以为仅由紫杉叶素或其盐组成的组合物、或者配合紫杉叶素或其盐和食品添加物等的组合物的任一者。作为本发明的食品组合物，只要含有紫杉叶素或其盐、且对象能够经口摄取即可，食品组合物的种类、形状等没有特别限制。此外，如后述试验例所示，紫杉叶素示出优异的肝纤维化抑制作用和褐色脂肪细胞活化作用，因此本发明的食品组合物能够用于肝纤维化抑制用途、褐色脂肪细胞活化的用途、nash的预防和/或改善用途等。
[0096]
作为本发明的食品组合物，可以举出例如饴糖（drop）、糖果、压片糖（
ラムネ
）、软糖、口香糖等点心类；曲奇、薄脆、饼干、薯片、面包、蛋糕、巧克力、甜甜圈、布丁、果冻等西洋点心；仙贝、羊羹、大福、荻饼、日式馒头、长崎蛋糕等日式点心；冰淇淋、冰糖果、雪糕（sherbet）、意大利冰淇淋等冷点心；主餐面包、法式面包、牛角面包等面包类；乌冬面、荞麦面、中式面、棊子面等面类；鱼糕、竹轮、鱼肉香肠等鱼肉炼制制品；火腿、香肠、汉堡肉、咸牛肉等畜肉制品；盐、胡椒、味噌、酱油、酱汁、沙拉酱（dressing）、蛋黄酱、番茄酱（ketchup）、甜味料(例如砂糖、蜂蜜、粉糖、糖浆、果酱、橘子酱等)、辣味料(例如辣椒、胡椒等)等调味类；明石烧、章鱼烧、文字烧（monjayaki）、大阪烧、炒面、炒乌冬面等铁板烧食品；奶酪、黄油、人造黄油、酸奶等乳制品；纳豆、炸豆腐（atsuage）、豆腐、魔芋、团子、泡菜、佃煮、饺子、烧麦、可乐饼、三明治、披萨、汉堡、沙拉等各种熟食；牛肉、猪肉、鸡肉等畜产物；虾、贝柱、蚬子、昆布等水产物；将蔬菜
·
果实类、植物、酵母、藻类等制成粉末得到的各种粉末；将油脂类
·
香料类(香草、柑橘类、鲣鱼等)制成粉末固体化的物质；饮料等。
[0097]
作为饮料，可以举出汤、味噌汁等饮食品；速溶咖啡、速溶红茶、速溶奶粉、速溶汤、冲泡味噌汁等粉末饮食品；威士忌、波本威士忌、蒸馏酒、利口酒、葡萄酒、果酒、日本酒、中国酒、烧酒、啤酒、酒精度数1%以下的无酒精啤酒、发泡酒、勾兑烧酒（chuhai）等酒精饮料；加入果汁(例如苹果、橘子、葡萄、香蕉、梨子、梅子的果汁等)的饮料、加入蔬菜汁(例如番茄、胡萝卜、芹菜、黄瓜、西瓜的蔬菜汁等)的饮料、加入果汁和蔬菜汁的饮料、清凉饮料水、牛奶、豆浆、牛奶饮料、饮用型的酸奶、咖啡、可可、茶饮料(红茶、绿茶、麦茶、糙米茶、煎茶、玉露茶、焙茶、乌龙茶、姜茶、普洱茶、博士茶、玫瑰茶、菊茶、药草茶(例如薄荷茶、茉莉花茶)等)、营养饮品、运动饮料、矿泉水等非酒精饮料等。
[0098]
作为这样的作为食品组合物的合适例子，可以举出例如果冻、茶饮料、酒精饮料、饴糖（drop）、糖果、压片糖、曲奇、薄脆、饼干、巧克力、奶酪、黄油、人造黄油、口香糖等。
[0099]
此外，本发明的食品组合物也可以制备为功能性食品、健康食品、特定保健用食品、特殊用途食品(例如患者用食品)、补剂等，优选制备为特定保健用食品、特殊用途食品或补剂。
[0100]
作为本发明的食品组合物的形状，可以举出例如片剂、丸剂、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、微胶囊)、散剂、颗粒剂、细粒剂、锭剂或液体制剂(包括糖浆剂、乳剂、混悬剂)等，优
选为片剂或胶囊剂。
[0101]
作为本发明的食品组合物，特别优选为片剂或胶囊剂的形状的特定保健用食品、特殊用途食品或补剂。
[0102]
本说明书中，补剂是指用于补充营养素等的营养辅助食品，不仅是指营养功能食品等，还是指具有为了保持、恢复、增进健康等而发挥的功能(特别是nash的预防和/或改善功能)等的健康辅助食品、健康功能食品等。
[0103]
本发明的食品组合物可以通过例如利用公知的方法在食品中添加紫杉叶素或其盐来制造。具体而言，例如片剂的食品组合物可以通过例如添加、混合紫杉叶素或其盐、和赋形剂(例如乳糖、白糖、甘露醇等)、甜味剂、增香剂等材料，用压片机等施加压力而成型为片剂的形状，从而制造。根据需要，也可以添加其它材料(例如维生素c等维生素类、铁等矿物质类、食物纤维等其它添加物)。胶囊剂的食品组合物可以例如将含有紫杉叶素或其盐的液态、悬浮状、糊状、粉末状或颗粒状的食品组合物填充在胶囊中、或用胶囊基剂内包成型，从而制造。
[0104]
本发明的食品组合物中，只要不阻碍本发明的效果，除了通常使用的食品原材料、食品添加物、各种营养素、维生素类、风味物质(例如奶酪、巧克力等)等，还可以配合生理学可接受的载体等。作为生理学可接受的载体等，可以使用惯用的各种有机或者无机载体物质，可以举出赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂、乳化剂等。此外，作为食品添加物，可以举出着色剂、甜味剂、防腐剂、抗氧化剂、增香剂等。进一步，可以含有其它材料、例如铁等矿物质类、果胶、卡拉胶、甘露聚糖等食物纤维等。
[0105]
作为赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、助溶剂、悬浮化剂、缓冲剂、增稠剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、抗氧化剂，可以举出各自与前述本发明的药物中使用的相同的物质。
[0106]
作为维生素类，可以为水溶性或脂溶性，可以举出例如棕榈酸视黄醇、生育酚、双苯酰硫胺、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺素、抗坏血酸钠、胆钙化醇、烟酰胺、泛酸钙、叶酸、生物素、酒石酸氢胆碱等。
[0107]
关于片剂、颗粒剂、细粒剂的形状的食品组合物，为了掩蔽味道、提高光稳定性、提高外观或者肠溶性等目的，可以使用包衣基材通过本身公知的方法包衣。作为其包衣基材，可以举出与前述本发明的药物中使用的相同的物质，可以同样实施。
[0108]
本发明的食品组合物中的紫杉叶素或其盐的含量相对于食品组合物整体，为约0.1~50重量%、优选为约0.5~30重量%、更优选为约1~20重量%。
[0109]
这样得到的食品组合物是安全的，因此能够向对象、特别是优选对人持续给与。
[0110]
本发明的食品组合物的摄取量只要是紫杉叶素或其盐的活化褐色脂肪细胞的有效量、或者预防和/或改善nash的有效量的范围内即可。例如，在为了nash的预防和/或改善目的而使成人摄取本发明的食品组合物的情况下，根据摄取的对象、摄取形态、摄食量等而不同，但是作为紫杉叶素或其盐的摄取量，一般而言每1天换算为作为有效成分的紫杉叶素，则可以通常10~10000mg、优选为30~1000mg、更优选为50~500mg分为1天1次至多次摄取。此外，从对嗜好性、摄食量不造成影响地表现出效果的观点出发，也优选为上述的摄取量。对象为其它动物的情况下，也可摄取同样的量。
[0111]
进一步，本发明的食品组合物可以仅使用其，也可以与其它疗法(即，前述饮食疗法、运动疗法、药物疗法、除铁疗法、外科治疗)组合使用。具体而言，可以例如与其它的具有
肝功能改善作用的药物组合物、食品组合物、或饲料组合使用。通过与其它疗法的组合，能够进一步提高肝纤维化抑制效果、褐色脂肪细胞活化效果(具体而言，例如能量消耗促进效果)、nash(特别是伴随肝纤维化的nash)的预防和/或改善效果等。
[0112]
此外，本发明的食品组合物中，还包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品、保健功能食品、标记疾病风险减少标识的食品或特殊用途食品(例如患者用食品)那样的分类的食品。作为疾病风险减少标识，可以举出例如用于减少肝纤维化的风险、活化褐色脂肪细胞、促进能量代谢的内容的标识等。因此，本发明的食品组合物是附有例如包含紫杉叶素或其盐、用于减少肝纤维化的风险的内容；包含紫杉叶素或其盐、活化褐色脂肪细胞、促进能量代谢的内容等标识的饮食品。
[0113]
在此，附有这些食品组合物的功能标识可以在产品的主体、容器、包装、说明书、附件或宣传物中任一者上进行。
实施例
[0114]
以下，基于试验例和制剂例，更详细说明本发明，但本发明不因试验例和制剂例而被限定，可以在不脱离本发明的范围的范围变化。此外，本发明中使用的试剂、装置、材料等在没有特别提到的情况下，是商业可获取的。
[0115]
以下的试验例中使用的紫杉叶素直接使用从ametis jsc(俄罗斯)购买的物质。
[0116]
试验例1：在高脂肪食诱导性肥胖模型小鼠中摄取紫杉叶素对nash产生的效果(1)方法(1-1)摄食实验作为实验动物，使用c57bl/6j小鼠。从日本
クレア
株式会社在7周龄时购买，1周的驯化后，在8周龄如下表1所述，随机分为4组。
[0117]
摄食
·
饮水设为自由，1周测量1次摄食量、进行体重测定。此外，摄食实验开始日和其后4周一次(摄食开始起经过4周、8周、12周时)测定空腹时血糖。经过12周时，为了分析糖耐量，实施腹腔内葡萄糖负载试验(ipgtt)。此外，经过8周和12周时，测量直肠温度(表2)。
[0118]
ipgtt实施日的5天后，测定最终的空腹时血糖，在醚麻醉下全采血后，通过颈椎脱臼使其安乐死，如下表3所述，进行样品采集以及部分重量测定。
[0119]
(1-2)样品的制备(仅肝脏)
·
保存肝脏样品进行部分组织观察用裁剪并洗涤后，浸渍在4%多聚甲醛中，在4℃下固定过夜。将固定的样品洗涤后，用升高的乙醇系列脱水后，进行石蜡包埋。
[0120]
剩余肝脏样品用液氮急速冷冻后，至供于各实验为止在-80℃下保存。
[0121]
(1-3)分析(i)血中浓度
·
生物化学检查
·
胰岛素浓度：超高灵敏度小鼠胰岛素 elisa试剂盒(
モリナガ
)
·
瘦素浓度：小鼠/大鼠瘦素 elisa试剂盒(
モリナガ
)
·
脂连蛋白浓度：小鼠/大鼠脂连蛋白 elisa试剂盒(大塚制药)
·
甘油三酯：实验室测定试剂盒(和光)
·
tnf-α、il-1β浓度：elisa试剂盒(proteintech)
·
alt、ast量：assay kit(
フナコシ
)
·
糖耐量：根据空腹时血糖值至摄取后120分钟为止的血糖值变动曲线，用梯形公式算出血糖曲线下面积(area under curve,auc)。
[0122]
(ii)氧化应力
·
血中
·
肝脏组织脂质过氧化：脂质过氧化(mda)比色测定试剂盒(biovision, inc)
·
抗氧化酶基因(mn-sod、cuzn-sod、过氧化氢酶、gpx)表达：实时定量rt pcr。
[0123]
(iii)肝脏脂肪酸合成/脂肪酸氧化
·
srebp1c、lxrα、fas、scd1、pparα、cpt1a基因表达：实时定量rt pcr。
[0124]
(iv)ampk/acc活性
·
ampk磷酸化、acc磷酸化：蛋白质印迹法。
[0125]
(v)肝脏组织炎症指标/炎症诱导信号通路活性
·
f4/80、tnf-α、il-1β基因表达：实时定量rt pcr
·
p38 mapk磷酸化、nf-κb p65磷酸化、jnk磷酸化：蛋白质印迹法。
[0126]
(vi)肝脏纤维化指标
·
αsma、pai1、tgf-β、1型collagen基因表达：实时定量rt pcr
·
f4/80、αsma、tgf-β1蛋白质量：蛋白质印迹法。
[0127]
(vii)肝脏
·
组织学的分析
·
形态、脂肪蓄积观察：苏木精-曙红(hematoxylin eosin：he)染色
·
纤维化观察：偶氮卡红(azan)染色、天狼星红染色、免疫组织化学(抗f4/80抗体)。
[0128]
(viii)褐色脂肪细胞
·
ucp1相关的分析
·
对象组织：褐色脂肪组织
·
靶标：ucp1基因
·
分析手段：实时rt pcr分析。
[0129]
(2)结果(i)体重变化(1/周测定)根据图1的结果，摄食实验开始后，在3周在仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)中确认到体重差异(增加)，在4周在仅高脂肪食组与其它组之间确认到显著差异。此外，摄食实验开始后，在6周在普通食 紫杉叶素组(普通食/有tax)中在体重减少方面确认到显著差异，在8周在普通食 紫杉叶素组与其它组全部中在体重减少方面确认到显著差异。摄食实验开始起12周，在仅高脂肪食组中确认到显著的体重增加。与此相对地，高脂肪食 紫杉叶素组(高脂肪食/有tax)的体重与仅普通食组(普通食/无tax)同等，普通食 紫杉叶素组中与其它组相比也未确认到体重增加。
[0130]
(ii)摄食量(1/周测定)根据图2的结果，在摄食期间，在仅普通食组(普通食/无tax)、普通食 紫杉叶素组(普通食/有tax)间在摄食量方面没有发现差异，在仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)、高脂肪食 紫杉叶素组(高脂肪食/有tax)间在摄食量方面也没有发现差异。一天的紫杉叶素摄食量在摄食实验开始经过12周时如下所述。
[0131]
高脂肪食 紫杉叶素摄取组(高脂肪食/有tax)：约100mg / 约36g bw/只/日。
[0132]
(iii)空腹时血糖(1/4周测定)和糖耐量根据图3a，从实验开始起经过12周时的空腹时血糖在仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)中显示出显著高值，在普通食 紫杉叶素组(普通食/有tax)中显示出显著低值。
[0133]
根据图3b，腹腔内葡萄糖负载试验开始后，60分钟的血糖值在仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)中显示出显著高值，在普通食 紫杉叶素组(普通食/有tax)中显示出显著低值。
[0134]
根据图3c，auc方面也与仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(普通食/有tax)中显著减少。
[0135]
(iv)直肠温度(摄食实验开始起经过8周、12周时)根据图4a，实验开始起8周时的直肠温度在仅高脂肪食组(高脂肪食/无tax)中显示出显著低值，在普通食 紫杉叶素组(普通食/有tax)中显示出显著高值。该倾向针对12周时的直肠温度也同样。据此，暗示通过紫杉叶素的摄食而褐色脂肪细胞活化的结果是，能量消耗亢进，直肠温度上升。
[0136]
(v)ucp1基因表达根据图4b，ucp1基因表达与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著增加。据此，暗示通过紫杉叶素的摄食，与产热相关的ucp1基因的表达亢进。
[0137]
(vi)脏器重量根据图5a，肝脏重量(liver weight)与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0138]
根据图5b，附睾脂肪重量(epi wat weight)与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0139]
此外，根据图5c，褐色脂肪组织重量(bat weight)与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0140]
(vii)血中胰岛素浓度/胰岛素抵抗性指标(homa-r)根据图6a，摄食实验开始经过12周后的空腹时血糖与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中显著减少，此外，与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著减少。
[0141]
根据图6b，血中胰岛素浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0142]
此外，根据图6c，针对胰岛素抵抗性指标(homa-r)，也与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0143]
(viii)血液生物化学根据图7，血中甘油三酯浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)示出减少倾向(p=0.079)。
[0144]
(ix)血中脂肪细胞因子浓度根据图8a，血中瘦素浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0145]
根据图8c，tnf-α浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中示出减少的倾向(p=0.076)。
[0146]
根据图8d，il-1β浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中示出减少的倾向(p=0.0932)。
[0147]
(x)肝功能检查根据图9b，血中alt值与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0148]
根据图9c，肝脏甘油三酯浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0149]
(xi)肝脏ampk/乙酰辅酶a羧化酶(acc)活性根据图10a，ampk磷酸化与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中显著增加，此外，与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著增加。
[0150]
根据图10b，acc磷酸化与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中显著增加，此外，与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著增加。
[0151]
(xii)肝脏脂肪酸合成/脂肪酸氧化根据图11a，srebp1c、lxrα、fas和scd1基因的表达与仅高脂肪食组(高脂肪食/无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(高脂肪食/有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0152]
根据图11b，cd36基因的表达与仅高脂肪食组(高脂肪食/无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(高脂肪食/有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0153]
(xiii)氧化应力和抗氧化作用根据图12a，血中脂质过氧化标志物、即丙二醛(mda)浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0154]
根据图12b，肝脏脂质过氧化标志物、即肝脏的mda浓度与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中显著减少，此外，与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著减少。
[0155]
此外，根据图12c、d、e和f，由氧化应力诱导的抗氧化酶组(mn-sod、cuzn-sod、过氧化氢酶、gp-x)的基因表达与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。进一步，根据图12c，mn-sod的基因表达与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著减少。
[0156]
(xiv)肝脏组织炎症指标基因表达根据图13a，成熟巨噬细胞标志物f4/80基因表达与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0157]
根据图13b和c，tnf-α、il-1β基因表达与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0158]
(xv)炎症诱导信号通路活性根据图14a，p38 mapk磷酸化与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到减少倾向(p=0.1045)。
[0159]
根据图14b，nf-κb p65磷酸化与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0160]
根据图14c，c-jun氨基末端激酶(jnk)磷酸化与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到减少倾向(p=0.1701)。
[0161]
(xvi)肝脏纤维化指标分析(基因表达分析)根据图15a~c，纤维化指标组(αsma、pai1、tgf-β1)的基因表达与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0162]
根据图15d，胶原蛋白1与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到减少倾向(p=0.07)。
[0163]
(蛋白质量分析)根据图15e，f4/80与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。此外，与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，在普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中也确认到显著减少。
[0164]
根据图15f，αsma与仅高脂肪食组(无紫杉叶素)相比，在高脂肪食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到减少倾向(p=0.054)。
[0165]
根据图15g，tgf-β1与仅普通食组(无紫杉叶素)相比，普通食 紫杉叶素组(有紫杉叶素)中确认到显著减少。
[0166]
(xvii)组织学观察根据图16的苏木精-曙红(hematoxylineosin：he)染色的照片，在仅高脂肪食组中确认到显著的脂肪蓄积。另一方面，在高脂肪食 紫杉叶素组中，尽管确认到脂肪蓄积，但与仅高脂肪食组相比显著减少，确认抑制脂肪肝。
[0167]
根据图17的偶氮卡红(azan)染色的照片(蓝色浓染为纤维状的部位表示胶原蛋白纤维)，与仅高脂肪食组相比，在高脂肪食 紫杉叶素组中蓝色染色的胶原蛋白的量减少，确认到抑制肝脏组织的纤维化。
[0168]
根据图18的天狼星红(siriusred)染色的照片(红色浓染为纤维状的部位表示胶原蛋白纤维)，与仅高脂肪食组相比，在高脂肪食 紫杉叶素组中红色染色的胶原蛋白的量减少，图17的偶氮卡红染色也同样，确认抑制肝脏组织的纤维化。
[0169]
根据图19的利用抗f4/80抗体的免疫组织化学染色的照片，仅高脂肪食组中存在确认到肝组织cls(hepaticcrown-likestructures：hcls，肝冠状结构)(参照部分放大图)的倾向，但在高脂肪食 紫杉叶素组中几乎没有发现，确认肝脏组织中的炎症抑制。
[0170]
制剂例1(片剂的制造)1)紫杉叶素50g2)乳糖50g3)玉米淀粉15g4)羧基甲基纤维素钙44g5)硬脂酸镁1g1000片总计160g将1)、2)、3)的总量和30g的4)用水炼合，真空干燥后，进行整粒。该整粒后混合14g的4)和1g的5)，通过压片机压片。像这样，得到每1片含有紫杉叶素50mg的片剂1000片。
[0171]
制剂例2(胶囊剂的制造)1)紫杉叶素50mg2)微粉纤维素10mg
3)乳糖19mg4)硬脂酸镁1mg总计80mg将1)、2)、3)和4)混合，填充在明胶胶囊中。
[0172]
[产业实用性]根据本发明，能够提供特征在于含有作为安全的源自植物的成分的紫杉叶素或其盐作为有效成分的优异的肝纤维化抑制剂。由此，对nash也能够抑制纤维化的进展，其结果是，能够预防nash的重症化。此外，根据本发明，能够提供含有紫杉叶素或其盐作为有效成分的优异的褐色脂肪细胞活化剂。由此，能够促进能量消耗，或使ucp1的表达亢进，此外，脂肪组织的纤维化也能够有效抑制。其结果是，能够预防或改善代谢综合征等。进一步，根据本发明，通过向对象给与作为肝纤维化抑制剂和/或褐色脂肪细胞活化剂的紫杉叶素或其盐的预防和/或治疗的有效量，能够提供在由各种各样的原因(肝炎病毒感染、nash、自身免疫性肝炎等)引起的肝纤维化的预防和/或治疗(或者改善)中有用的药物组合物或食品组合物。尤其是，根据本发明，能够提供迄今未知有效的预防或治疗法的伴随纤维化的nash的新型且有效的预防和/或治疗剂。此外，通过与饮食疗法、运动疗法、药物疗法(与其它药物的组合使用疗法)、除铁疗法和/或外科治疗(减量手术、肝移植)组合，还能够增强本发明中的紫杉叶素或其盐的预防和/或治疗效果。
[0173]
本技术以在日本于2019年6月25日提交的日本特愿2019-117229为基础，其内容全部包括在本说明书中。