HEXB抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途的制作方法

hexb抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途
技术领域
1.本公开涉及肿瘤检测与治疗技术领域，具体地，涉及hexb抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途、能够定量检测hexb的试剂在制备用于肿瘤检测的试剂盒中的用途以及用于肿瘤检测的试剂盒。


背景技术：

2.多形胶质母细胞瘤(gbm)是脑中发病率较高且恶性程度较高的的原发性肿瘤。由于其侵袭性生长的特点，gbm往往会在显微外科手术切除后复发，因此，术后辅助治疗是针对gbm的标准治疗方法，其原理主要是靶向增生的肿瘤细胞、异常生成的血管或激活的致癌通路，以减缓肿瘤发展。在过去30年中，虽然在gbm的分子分型和综合治疗策略方面取得了一些进展，但是gbm患者的预期寿命并未得到显著延长，仅约为15个月。面对这种严峻的挑战，亟需从一个更加新颖且全方位的角度开发有效的治疗策略。


技术实现要素：

3.本公开的目的是提供一种能够用于治疗多形胶质母细胞瘤的药物。hexb抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途、能够定量检测hexb的试剂在制备用于肿瘤检测的试剂盒中的用途以及用于肿瘤检测的试剂盒。
4.为了实现上述目的，本公开提供hexb抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；
5.优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
6.可选地，所述hexb抑制剂包括能够抑制hexb表达的试剂、能够抑制hexb活性的试剂、能够消除hexb的试剂、和能够促进hexb体内降解的试剂中的至少一种；优选地，所述hexb抑制剂包括gal-pugnac，或者gal-pugnac的功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物中的至少一种；更优选地，所述hexb抑制剂为纳米药物载体包裹的gal-pugnac。
7.本公开还提供检测生物标志物的试剂在制备用于肿瘤检测的试剂盒中的用途，其中，所述生物标志物为hexb，所述检测生物标志物的试剂为能够定量检测所述生物标志物的试剂，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；
8.优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
9.可选地，所述用于肿瘤检测的试剂盒为通过胶体金试纸法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法或elisa法检测所述生物标志物含量的试剂盒。
10.可选地，所述能够定量检测所述生物标志物的试剂包括抗hexb的单克隆抗体；更优选地，所述抗hexb的单克隆抗体为购自santa cruz biotechnology公司的商品号为sc-376781的单克隆抗体。
11.本公开还提供用于肿瘤检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测生物标志物的
试剂，所述生物标志物为hexb，所述检测生物标志物的试剂为能够定量检测所述生物标志物的试剂，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；
12.优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
13.可选地，所述试剂盒为通过胶体金试纸法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法或elisa法检测所述生物标志物含量的试剂盒。
14.可选地，所述能够定量检测所述生物标志物的试剂包括抗hexb的单克隆抗体；更优选地，所述抗hexb的单克隆抗体为购自santa cruz biotechnology公司的商品号为sc-376781的单克隆抗体。
15.本公开还提供hexb抑制剂在制备用于预防或抑制巨噬细胞转化为m2型巨噬细胞的药物中的用途。
16.可选地，所述hexb抑制剂包括能够抑制hexb表达的试剂、能够抑制hexb活性的试剂、能够消除hexb的试剂、和能够促进hexb体内降解的试剂中的至少一种；优选地，所述hexb抑制剂包括gal-pugnac，或者gal-pugnac的功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物中的至少一种。
17.通过上述技术方案，本公开实施例将hexb作为具有有氧糖酵解表型的肿瘤的治疗靶点和诊断标志物，为具有有氧糖酵解表型的肿瘤提供了新的治疗手段和诊断手段。
18.本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
19.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
20.图1是gbm患者中tam标记物iba1与糖酵解标记物pkm2的相关性示意图；
21.图2是hexb在正常脑、低级别胶质瘤和gbm中的表达量示意图；
22.图3是hexb在gbm的间充质和idh1野生型组中的表达量示意图；
23.图4是hexb沉默的u87细胞和pgc1细胞中葡萄糖水平和乳酸水平检测结果示意图；
24.图5是rna干扰和gal-pugnac抑制hexb对u87细胞的糖酵解速率影响示意图；
25.图6是rna干扰和gal-pugnac抑制hexb对pgc1细胞的糖酵解速率影响示意图；
26.图7是sirna沉默hexb对gbm细胞增殖率的影响示意图；
27.图8是hexb抑制对gbm皮下异种移植肿瘤生长状况的影响示意图；
28.图9是hexb沉默对gbm原位异种移植肿瘤生长状况生存情况的影响示意图；
29.图10是idh1野生型gbm和idh1突变型gbm中hexb启动子的甲基化水平对比示意图；
30.图11是idh1野生型组织和idh1 rg32h突变型组织中hexb的表达量对比示意图；
31.图12是idh1突变对gbm细胞中hexb表达的影响及相关回复；
32.图13是靶向hexb在idh1野生型gbm模型(sb睡美人自发瘤模型)中效果更加显著。
具体实施方式
33.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
34.本公开的第一方面提供hexb抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
35.有氧糖酵解，也被称为warburg效应，是恶性肿瘤细胞中一种典型的代谢模式，在该种模式下，即使存在足够的氧气来维持氧化磷酸化代谢模式，肿瘤细胞也能将大多数葡萄糖通过糖酵解反应转化为乳酸。有氧糖酵解不仅是肿瘤恶性转化的副产物，而且还是肿瘤发生的关键驱动力，因此，揭示有氧糖酵解被激活和维持的分子机制，可以为肿瘤的检测和治疗提供新的手段。
36.gbm具有复杂的肿瘤微环境，在其微环境中，m2型巨噬细胞(tam)占所有细胞的比例高达30％，tam的富集会促进肿瘤细胞的恶性发展。本公开发明人发现，hexb可以作为有氧糖酵解和tam浸润的作用靶点，其能够通过yap1/hif1a通路、以及与微环境中的tam形成外部正反馈调节环路，来增强肿瘤细胞的有氧糖酵解。
37.具体地，为了评估gbm中有氧糖酵解和tam的相互关系，发明人基于糖酵解代谢的经典基因集合进行了ssgsea量化评分。通过cibersort解析了gbm组织中tam的相对比例，发现在多个gbm队列中，糖酵解评分与巨噬细胞比例均呈显著正相关；通过gbm患者的组化，证实了tam标记物iba1与糖酵解标记物pkm2之间亦存在较强的正相关性，如图1所示；通过对葡萄糖代谢相关基因和tam的特征基因(含有巨噬细胞和脑部小胶质细胞)进行交叉分析，筛选出hexb；基于单细胞rna测序队列(gse131928)分析了hexb的表达，发现hexb主要在gbm细胞和巨噬细胞中表达；免疫荧光证实，hexb与iba1和gfap存在共表达及相邻定位，表明hexb在tam和gbm细胞同时表达；免疫组织化学和酶联免疫吸附测定法发现，与正常脑和低级别胶质瘤相比，hexb在gbm中明显过量表达和分泌，如图2所示；其他生物信息学分析发现，hexb在gbm的间充质和idh1野生型组等代谢模式与免疫微环境构成复杂的亚型中显著高表达，如图3所示，间接证实了hexb与有氧糖酵解及免疫微环境重构可能存在的强烈关联。
38.为了进一步说明hexb在gbm细胞中的生物学作用，发明人评估了hexb在两种hexb高表达水平细胞系(u87细胞系和pgc1细胞系)中的表达。在hexb沉默组中，肿瘤细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生严重降低，如图4所示；使用海马分析仪来探索hexb在调节糖酵解趋势中的作用，发现rna干扰和gal-pugnac(hexb抑制剂，抑制其酶活性)对hexb的抑制作用显著减弱了gbm细胞的糖酵解速率，如图5和6所示.因此，这些发现说明hexb介导gbm肿瘤细胞的有氧糖酵解过程。
39.此外，通过sirna沉默hexb可以显著降低gbm细胞的增殖率，如图7所示；此外，敲除hexb不会影响细胞凋亡的状态，用丙酮酸模拟糖酵解作用，发现丙酮酸可以逆转沉默hexb的生长抑制作用，这说明hexb对肿瘤细胞增殖的促进作用取决于其对糖代谢的调节，而不是通过其他方法(例如凋亡)；在无血清培养条件下建立了五个具有高水平hexb表达gbm神经球，内源性敲除hexb或施用gal-pugnac后，gbm神经球的球形成和自我更新能力受到抑制；建立gbm皮下异种移植模型，发现抑制hexb可以显著抑制皮下肿瘤的生长速度，如图8所示；同时，hexb沉默的gbm细胞的原位异种移植延迟了肿瘤的形成并延长了生存期，如图9所示。因此，这些发现说明hexb通过增强糖酵解过程来促进gbm细胞增殖。
40.此外，本公开发明人还发现，在多形胶质母细胞瘤中，idh1基因的突变可以通过表
观遗传方式，使hexb低表达，从而在一定程度上消除hexb的促糖酵解效应。具体地，idh1野生型gbm中hexb的表达明显高于idh1突变型gbm，如图3所示；而且idh1野生型gbm中hexb启动子的甲基化水平明显低于idh1突变型gbm，如图10所示；gbm组织中的ihc显示idh1野生型组织比idh1 rg132h突变体中具有更多的hexb，如图11所示；构建具有不同idh1突变的u87和pgc1细胞系，发现在idh1rg32h突变细胞中，hexb的表达水平显着降低，如图12所示；在突变细胞中施用了idh1突变代谢物2hg抑制剂，发现可以恢复hexb表达，如图12所示。同时，靶向hexb疗法在idh1野生型gbm中的治疗效果更加显著，如图13所示。
41.根据本公开，所述hexb抑制剂可以在一定的范围内选择，例如，所述hexb抑制剂可以包括能够抑制hexb表达的试剂、能够抑制hexb活性的试剂、能够消除hexb的试剂、和能够促进hexb体内降解的试剂中的至少一种；优选地，所述hexb抑制剂可以包括gal-pugnac，或者gal-pugnac的功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物中的至少一种；更优选地，所述hexb抑制剂为纳米药物载体包裹的gal-pugnac。其中，所述纳米药物载体为固体纸质纳米粒。所述纳米药物载体与gal-pugnac的重量比为0.5：1。纳米药物载体包裹的gal-pugnac能够具有较高的稳定性和血脑屏障透过率，从而更有助于实现缓释及肿瘤微环境定点释放。
42.本公开的第二方面提供检测生物标志物的试剂在制备用于肿瘤检测的试剂盒中的用途，其中，所述生物标志物为hexb，所述检测生物标志物的试剂为能够定量检测所述生物标志物的试剂，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
43.在本公开实施例中，具体地，将hexb作为具有有氧糖酵解表型的肿瘤检测的生物标志物的原理，与前述将其作为具有有氧糖酵解表型的肿瘤治疗靶点的原理相似或相同，此处不再赘述。
44.根据本公开，利用所述试剂盒检测hexb的方法可以在一定的范围内选择，例如，所述用于肿瘤检测的试剂盒为通过胶体金试纸法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法或elisa法检测所述生物标志物含量的试剂盒。
45.根据本公开，所述能够定量检测所述生物标志物的试剂可以在一定的范围内选择，例如，所述能够定量检测所述生物标志物的试剂可以包括抗hexb的单克隆抗体。
46.本公开的第三方面提供用于肿瘤检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测生物标志物的试剂，所述生物标志物为hexb，所述检测生物标志物的试剂为能够定量检测所述生物标志物的试剂，所述肿瘤具有有氧糖酵解表型；优选地，所述肿瘤为多形胶质母细胞瘤，更优选地，所述肿瘤为idh1野生型的多形胶质母细胞瘤。
47.可选地，所述试剂盒为通过胶体金试纸法、免疫印迹法、免疫组化法、免疫荧光法或elisa法检测所述生物标志物含量的试剂盒。
48.可选地，所述能够定量检测所述生物标志物的试剂包括抗hexb的单克隆抗体。
49.本公开的第四方面提供hexb抑制剂在制备用于预防或抑制巨噬细胞转化为m2型巨噬细胞的药物中的用途。
50.本公开发明人发现，hexb能够与肿瘤微环境中的m2型巨噬细胞形成外部正反馈调节环路。具体地，通过cibersort展示了gbm数据库中免疫细胞成分的含量，发现高表达hexb的组在多个队列中伴有更多的m0巨噬细胞和m2巨噬细胞。此外，外源性hexb可以显著促进源自thp1的巨噬细胞的趋化性。在外源性hexb刺激下添加gal-pugnac可显著减弱巨噬细胞
的趋化能力。通过gbm样品中的免疫荧光和ihc，验证了hexb和m2型巨噬细胞之间的正相关和共位关系。为了探索hexb在巨噬细胞极化中的作用，在源自患者的pbmc中进行了流式细胞术。结果表明，外源性hexb显著逆转了诱导的m1极化过程，而用gal-pugnac处理可强烈抑制m2极化，在gl261原位模型中，gal-pugnac还可以促进m2过渡。以上结果表明，hexb可以作为巨噬细胞趋化性和m2交替极化的关键靶标。
51.通过对gse5099队列的分析，发现hexb的内源性表达在巨噬细胞向m2型分化的过程中增加。在thp1和pbmc中进行了实验，发现m2亚型巨噬细胞中hexb的表达和分泌显著上调。因此，在神经胶质瘤的微环境中，hexb和m2巨噬细胞之间存在一个正反馈环。使用u87颅内肿瘤模型来验证外部正反馈回路，发现与对照组相比，u87和巨噬细胞联合注射组的肿瘤生长加快，而且u87和hexb预处理巨噬细胞联合注射组的生长最快，gal-pugnac可以显著抑制肿瘤。
52.可选地，所述hexb抑制剂包括能够抑制hexb表达的试剂、能够抑制hexb活性的试剂、能够消除hexb的试剂、和能够促进hexb体内降解的试剂中的至少一种；优选地，所述hexb抑制剂包括gal-pugnac，或者gal-pugnac的功能片段、衍生物及其盐或溶剂化物中的至少一种。
53.下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
54.本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
55.实施例1
56.本实施例用于说明hexb在gbm细胞中高表达。
57.使用符合医学伦理委员会标准的操作，在患者及其治疗专家知情且同意的情况下收集肿瘤组织和临床病理治疗，其中，两名独立的神经病理学专家对肿瘤组织对应的肿瘤类型进行了诊断，并确认了这些肿瘤组织符合用于分子检测的质量要求。
58.收集组织样本完毕后，对人正常星形胶质细胞(nha)、低级别胶质瘤细胞和多形胶质母细胞瘤细胞进行免疫组织化学和酶联免疫吸附测定。
59.免疫组织化学测定按照如下方法进行：
60.(1)切片制备：利用pbs冲洗样本，清除表面的血液、烧伤组织及附着的癌旁脑组织；利用4％多聚甲醛于4℃条件下固定72小时以上；按照50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇ⅰ、95％乙醇ⅱ、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ的浓度顺序进行乙醇梯度脱水，各浓度脱水时间为30min；利用二甲苯-无水乙醇1:1混合液透皮处理10min，然后依次二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ各透皮处理10min；浸蜡两次，每次30min；最后，包埋模具，充分冷却后进行切片；
61.(2)组织化学染色：将切片于60℃烘烤1小时后，利用二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ各处理10分钟；然后依次利用无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各脱蜡处理5分钟；蒸馏水处理5分钟，pbs清洗3次，每次水合5分钟；加入过氧化物酶封闭液去除内源性过氧化物酶，室温孵育10min，孵育结束后在pbs中浸润3次，每次5min；根据一抗说明书选择枸橼酸钠或ph8.0 edta作为抗原，在37℃的封闭液中封闭30min，按说明书推荐浓度稀释一抗，在4℃的加湿箱中培养过夜；第二天进行二抗后续孵育、dab显色(30s-2mim)、苏木精复染(2min)、盐酸酸化(10s)、脱水(同包埋脱水步骤)及贴装；染色结果在显微镜下拍
摄，每个组织切片至少随机选取5个标准视野，并按照国际公认的gis组织化学评分公式进行量化，进行后续统计分析。
62.酶联免疫吸附测定根据hexb-elisa试剂盒(cloudclone)的说明书进行。
63.测定结果如图2所示，由图2可以看出，hexb在多形胶质母细胞瘤细胞中的表达量明显高于人正常星形胶质细胞(nha)和低级别胶质瘤细胞。
64.实施例2
65.本实施例用于说明hexb介导gbm肿瘤细胞的有氧糖酵解过程。
66.本实施例中使用的u87细胞系和pgc1细胞系是经hexb表达量测试后确定的hexb高表达的胶质瘤细胞系。其中，u87细胞系的培养条件为：dulbecco的改良eagle培养基(dmem；gibco，grand island，ny，usa)，并在37℃和5％co2条件下补充10％fbs(gibco)和1％青霉素/链霉素(gibco)；pgc1细胞系的培养条件为：在含有10％fbs和1％青霉素/链霉素(gibco)的rpmi-1640培养基(gibco)中培养，37℃，5％co2。
67.(1)通过nvitrogen lipofectamine 3000(赛默飞世尔科技，中国上海)，于6孔板中利用慢病毒包被的sirna(其序列信息如表1所示)对u87细胞系和pgc1细胞系进行转染，以沉默u87细胞系和pgc1细胞系中的hexb基因。转染成功后进行培养，然后用高灵敏度葡萄糖检测试剂盒(sigma，中国上海)和乳酸检测试剂盒ii(sigma，中国上海)检测葡萄糖和乳酸水平，检测结果如图4所示。
68.表1
[0069][0070]
由图4可以看出，在hexb沉默组中，肿瘤细胞的葡萄糖消耗和乳酸产生严重降低。
[0071]
(2)分别对u87细胞系进行rna干扰和gal-pugnac抑制，然后利用海马xfe96细胞外通量分析仪(seahorse bioscience)测定细胞外酸化率，以评估抑制hexb后对u87细胞系糖酵解速率的减弱效果，测定结果如图5所示；
[0072]
分别对pgc1细胞系进行进行rna干扰和gal-pugnac抑制，然后利用海马xfe96细胞外通量分析仪(seahorse bioscience)测定细胞外酸化率，以评估抑制hexb后对pgc1细胞系糖酵解速率的减弱效果，测定结果如图6所示。
[0073]
由图5和图6可以看出，rna干扰和gal-pugnac(hexb抑制剂，抑制其酶活性)对hexb的抑制作用显著减弱了gbm细胞的糖酵解速率。
[0074]
(3)利用重组人hexb(rhhexb)对u87细胞系进行处理，然后利用海马xfe96细胞外通量分析仪(seahorse bioscience)测定细胞外酸化率，以评估活化hexb后对u87细胞系糖酵解速率的增强效果，测定结果如图7所示；
[0075]
利用重组人hexb(rhhexb)对pgc1细胞系进行处理，然后利用海马xfe96细胞外通量分析仪(seahorse bioscience)测定细胞外酸化率，以评估活化hexb后对pgc1细胞系糖酵解速率的增强效果，测定结果如图8所示。
[0076]
由图7和8可以看出，重组人hexb(rhhexb)的治疗增强了gbm细胞的糖酵解过程。
[0077]
综上所述，由本实施例的操作(1)至(3)可以看出，hexb介导gbm肿瘤细胞的有氧糖酵解过程。
[0078]
实施例3
[0079]
本实施例用于说明hexb通过增强糖酵解过程来促进gbm细胞增殖。
[0080]
分别建立gbm皮下异种移植模型和原位异种移植模型。在皮下异种移植模型中抑制hexb，观察皮下肿瘤的生长速度，如图10所示；在原位异种移植模型中成膜hexb，观察原位肿瘤的形成情况，如图11所示。
[0081]
建立异种移植模型的材料来源如下：雌性balb/c裸鼠和雄性c57bl/6n小鼠(6-8周龄)购自查尔斯河(中国北京)。
[0082]
对于皮下异种移植模型，将u87细胞以每200μl 2
×
106细胞的密度注射到裸鼠的右后侧。每3天测量一次皮下移植荷瘤小鼠的肿瘤生长情况。皮下肿瘤体积计算如下：肿瘤体积(mm3)＝(最长直径长度)
×
(最短直径)2/2。
[0083]
对于颅内肿瘤异种移植，用细胞浓度为5
×
105细胞，体积为3μl的脑内注射法，将u87细胞移植到右侧大脑皮质3.0mm深处，于荷瘤小鼠死亡时或移植后3周取全脑作进一步检查检查。在颅内胶质瘤模型中选择肿瘤横截面积最大的切片进行肿瘤大小测量。
[0084]
由图8可以看出，抑制hexb可以显著抑制皮下肿瘤的生长速度；由图9可以看出，hexb沉默的gbm细胞的原位异种移植延迟了肿瘤的形成并延长了生存期。
[0085]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0086]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0087]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。