一种柠檬醛和香芹酚复配组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于动物健康养殖技术领域，具体涉及柠檬醛和香芹酚复配组合物及其对梭菌属的抑菌和其对肠道梭菌属防控方面的应用。


背景技术：

2.植物精油是一种具有非常高应用价值的绿色饲料添加剂，其在畜禽生产中的应用，能够有效提升畜禽生产，并且具有绿色无污染等多重优势，植物提取物和植物精油作为新型添加剂产品逐渐被行业关注。
3.a.b.silva-angulo等公开了香芹酚和柠檬醛对单增李斯特菌的影响，香芹酚和柠檬醛可以以25％的mic组合使用，以控制李斯特菌的生长。单增李斯特菌是一种不形成芽胞、不产生荚膜的革兰阳性短杆菌，微氧气环境生长较佳，在厌氧环境下生长增殖将受到抑制，细胞膜上的脂磷壁酸由1,3-聚甘油磷酸组成(i型脂磷壁酸)，dna的g c mol％为36～42，属于李斯特菌属。
4.产气荚膜梭状芽胞杆菌(clostridium perfringens，cp简称产气梭菌)是产芽孢、厌氧性革兰阳性菌(旧名魏氏梭菌)，也是一种重要的人兽共患病原菌，广泛存在于自然环境中，也是人和动物肠道内的一种常见菌，可产生多种外毒素，对人和多种动物致病，是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。
5.但产气荚膜梭菌和单增李斯特菌有很大不同。产气荚膜梭菌是一种严格厌氧革兰氏阳性、梭状芽孢杆菌，两端平直或钝圆，多成双或短链排列，该细菌dna的g c mol％为24-27，属于梭状芽胞菌属，为提高细菌的适应能力可形成荚膜，荚膜多糖在细胞膜中具有重要作用，细胞膜上的脂磷壁酸由糖基醛醇-磷酸酯的重复单元组成(脂磷壁酸ii型和iii型组成)，可在菌体中央或次级端形成卵圆形芽孢，这有助于细菌在高温等恶劣条件下生存。产气荚膜梭菌定植于肠道的盲肠段，盲肠整体环境处于厌氧状态。故产气荚膜梭菌和单增李斯特菌在生物学分类属于不同属，且两种细菌细胞膜组成成分有较大差异，其对细菌的保护作用存在区别，由前述报道不容易想到香芹酚和柠檬醛复配组合物能对产气荚膜梭菌具有抑制等作用。
6.产气荚膜梭菌可产生多种毒素，目前为止，已发现的产气荚膜梭菌产生的毒素有23种，依据其分泌的四种主要毒素，可将产气荚膜梭菌分为a～e共五种血清型。鸡坏死性肠炎是由a型产气荚膜梭菌引起的，少数可由c型菌株诱发。正常情况下，产气荚膜梭菌栖息于盲肠，通常不会引起发病，但当家禽肠黏膜受到损伤或者肠道微生物菌群结构发生变化时，会大量繁殖，在消化道前段大量增殖，导致发生坏死性肠炎和鸡的死亡。坏死性肠炎肉鸡每克肠内容物产气荚膜梭菌有107～108菌落形成单位，而正常鸡只有102～104菌落形成单位。坏死性肠炎的病理变化眼观主要局限于小肠，特别是空肠和回肠，部分盲肠也可见病变。
7.c型产气荚膜梭菌是引起仔猪腹泻的主要细菌性病原菌之一，主要感染7日龄以内的新生仔猪，该菌经消化道感染仔猪，在其肠道中大量繁殖，所产生的毒素破坏肠道组织并经体液循环系统运输而损害远端器官(如脾脏)，从而引起仔猪腹泻及全身性器官的损伤，
引起坏死性肠炎、仔猪腹泻等疾病，影响发病仔猪的生长发育，甚至导致仔猪死亡。近几年c型产气荚膜梭菌的危害日益严重，每年因产气荚膜梭菌感染导致许多动物患病和死亡，给我国乃至世界养猪业带来严重的经济损失。
8.植物精油酚类的抗菌作用最强，香芹酚对革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌抗菌活性较强，可改变细菌表面蛋白的性质，增加菌体细胞膜的通透性，从而使细胞质中的离子流失及内外水分分配失衡致使细菌细胞死亡(魏磊等,2016)，尽管香芹酚对机体的健康有多方面的功效，但由于其在消化道前段极易被快速吸收进入循环系统，难以达到发挥作用，极大限制其功效的发挥(张显东,2017)。
9.植物提取物中醛类的抗真菌活性最高(林霜霜等,2017)，柠檬醛可抑制多种霉菌的增殖，可提高饲料的品质，增加机体肠道内菌群的稳定性，且霉菌毒素是坏死性肠炎的诱导因素之一(张放等,2016)，同时柠檬醛可导致细胞膜的脂质过氧化，导致活性氧的破裂，增加细胞膜的通透性(ju,j,et al.,2020)，柠檬醛对产气荚膜梭菌在体外有一定的抑制作用，但柠檬醛在酸性条件下很容易发生酸催化降解和氧化，如柠檬醛进入体内胃肠道表面的氨基酸等消化产物会导致柠檬醛降解，从而降低其在肠道中的抗菌效果。且w.si等人的研究表明，柠檬醛在ph值＝2时，在体外3小时后柠檬醛的抑菌效果显著降低。
10.在现有技术中并未发现单独将香芹酚和柠檬醛复配用于抑制肠道梭菌属细菌的相关报道，产气荚膜梭菌和单增李斯特菌在具体结构等方面有很大不同，由a.b.silva-angulo等报道内容也不能想到本

技术实现要素：
。现有技术中抑制梭菌属生长、预防和控制畜禽肠道梭菌引起的疾病症状并无有效的方法，是畜禽养殖亟需解决的问题。
发明内容
11.为了解决上述问题，本发明研究发现柠檬醛和香芹酚复配组合物可抑制梭菌属的生长，可改善畜禽肠道梭菌引起的疾病症状。
12.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
13.一种柠檬醛和香芹酚复配组合物，其由柠檬醛和香芹酚组成，所述柠檬醛和香芹酚复配的质量比为1～50份：1～50份，所述复配组合物用于制备防治产气荚膜梭状芽胞杆菌的饲料或饲料添加剂。
14.优选的，所述柠檬醛和香芹酚复配的质量比为1～10份：1～15份。
15.优选的，所述柠檬醛和香芹酚复配的质量比为2份：3份。
16.所述柠檬醛和香芹酚复配组合物在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
17.所述饲料或饲料添加剂用于抑制产气荚膜梭状芽胞杆菌的定植。
18.所述饲料或饲料添加剂用于改善产气荚膜梭菌感染引起的坏死性肠炎。
19.本发明将两种精油进行复配，希望通过两种精油对真菌和细菌作用机理改善肠道内菌群的稳态和直接抑制肠道内梭菌属的生长，控制畜禽肠道梭菌属的定植和繁殖，有效的改善畜禽肠道梭菌引起的疾病症状。本发明至少包括以下益处：
20.1、本发明柠檬醛和香芹酚复配组合物对梭菌属有较好的抑菌作用并可控制肠道梭菌属疾病，为坏死性肠炎肉鸡生长性能和肠道健康方面的应用提供了技术理论基础，也可为动物免受坏死性肠炎的侵扰提供参考。
21.2、本发明在家禽饲料中添加一定量的柠檬醛和香芹酚复配组合物显著提高了黄
羽肉鸡的末体重，促进黄羽肉鸡的生长，为更好地研究饲料添加剂，促进动物生长，提供了很好了理论依据。
22.3、本发明所述的柠檬醛和香芹酚作为营养调控物质，添加量少，可以直接加入动物饲料中，发挥的生理活性高，安全、有效、不会引起毒副作用。
附图说明
23.图1为柠檬醛和香芹酚对产气荚膜梭菌mic值的影响示意图。其中，图a为柠檬醛和香芹酚复配对atcc13124的mic值的影响；图b为柠檬醛和香芹酚复配对cvcc2030的mic值的影响；图c为柠檬醛和香芹酚复配对cvcc2070的mic值的影响；图d为柠檬醛和香芹酚复配对cvcc2038的mic值的影响；图e为柠檬醛和香芹酚复配对cvcc2032的mic值的影响。每幅图中试管中精油的浓度依次为，阴性对照组、阳性对照组、0.065μl/ml、0.125μl/ml、0.25μl/ml、0.5μl/ml、1μl/ml、2μl/ml、4μl/ml、8μl/ml。
24.图2为实施例5中小肠病变结果解剖示意图。其中，图2a为对照组解剖图；图2b为vi组；图2c为ⅲ组；图2d为阳性对照组解剖图。
具体实施方式
25.本发明中使用的受试产气荚膜梭菌atcc13124、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027、猪源产气荚膜梭菌cvcc2038、猪源产气荚膜梭菌cvcc 2032，均为市售菌株，柠檬醛、香芹酚为市售产品，纯度含量均为99.98％，可通过正规商业渠道购买获得。
26.本发明中使用的试验方法为本领域常规技术方法，使用的实验试剂等，为市售获得或按照本领域常规方法配置得到。
27.实施例1柠檬醛、香芹酚、柠檬醛和香芹酚复配在体外对产气荚膜梭菌mic的影响
28.(1)细菌复苏及培养
29.将受试产气荚膜梭菌atcc13124、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027、猪源产气荚膜梭菌cvcc2038、猪源产气荚膜梭菌cvcc2032甘油菌按1:1000的比例接种至高压灭菌的脑心浸液肉汤(brain heart infusion broth，bhi)液体培养基中，置于厌氧培养箱，37℃静置过夜培养，备用。
30.用接菌环蘸取试管内的细菌培养物划线于亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板，继续置于厌氧培养箱，37℃静置过夜培养，备用。于超净工作台内将平板上生长良好的单菌落挑取接种于高压灭菌的bhi液体培养基中，按上述培养条件连续于bhi液体培养基及亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板上传代，以确保细菌的活力。
31.将最后传代的亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板封口，备用，用以后续实验细菌的接种。
32.(2)柠檬醛、香芹酚、柠檬醛和香芹酚复配对受试产气荚膜梭菌mic的测定
33.于超净工作台内将平板上生长良好的单菌落挑取接种于高压灭菌的bhi液体培养基中，置于厌氧培养箱，37℃静置过夜培养，备用。
34.采用双倍稀释法，用60％的酒精将柠檬醛、香芹酚、柠檬醛和香芹酚复配(质量比1:1)稀释成不同浓度的稀释液，取稀释液0.1ml加入到装有0.8ml bhi液体培养基的试管
中，再接入0.1ml受试菌的菌悬液，充分振荡，使柠檬醛的终浓度分别为600μl/ml、300μl/ml、150μl/ml、75μl/m l、37.5μl/m、18.75μl/ml、9.375μl/ml、4.6875μl/ml，香芹酚、柠檬醛和香芹酚复配的终浓度分别为8.00μl/ml、4.00μl/ml、2.00μl/ml、1.00μl/m l、0.50μl/m、0.25μl/ml、0.125μl/ml、0.0625μl/ml，接种0.1ml过夜培养的受试产气荚膜梭菌悬液(1
×
105cfu)。另选取不含柠檬醛和香芹酚复配的bhi培养基，同样接种1
×
105cfu菌悬液作为阳性对照组，阴性对照组接种等体积高压灭菌的bhi液体培养基。将全部试管放入厌氧培养箱中，37℃静置培养48h后观察，结果如图1和表1-3所示。
35.结果判定：细菌培养48h后，于适当光线下肉眼观察试管内细菌的生长情况，以试管内培养液透明澄清、无产气荚膜梭菌生长的最低药物浓度判定为柠檬醛、香芹酚、柠檬醛和香芹酚复配对受试产气荚膜梭菌的mic值(minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度)。
36.表1柠檬醛对产气荚膜梭菌mic值的影响
[0037][0038][0039]
注：“ ”表示试管浑浊，有菌落生长；
“‑”
表示试管澄清，无菌落生长，下标同。
[0040]
由表1可知，柠檬醛对产气荚膜梭菌atcc13124、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030、猪源cvcc 2038的最小抑菌浓度为300μl/ml；柠檬醛对鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027和猪源产气荚膜梭菌cvcc2032最小抑菌浓度为600μl/ml。
[0041]
表2香芹酚对产气荚膜梭菌mic值的影响
[0042][0043]
注：“ ”表示试管浑浊，有菌落生长；
“‑”
表示试管澄清，无菌落生长，下标同。
[0044]
由表2可知，香芹酚对标准菌株产气荚膜梭菌atcc13124的最小抑菌浓度为1μl/ml、香芹酚对鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030、猪源cvcc 2038、猪源产气荚膜梭菌cvcc2032的最小抑菌浓度为4μl/ml；香芹酚对鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027和最小抑菌浓度为8μl/ml。
[0045]
表3柠檬醛和香芹酚复配对产气荚膜梭菌mic值的影响
[0046][0047][0048]
注：“ ”表示试管浑浊，有菌落生长；
“‑”
表示试管澄清，无菌落生长，下标同。
[0049]
由图1和表3可知，随着柠檬醛和香芹酚复配组合物浓度的增加，试管内培养液的浑浊程度越来越低，说明复配组合物浓度影响产气荚膜梭菌的抑菌效果。其中，柠檬醛和香芹酚复配对产气荚膜梭菌atcc13124、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027、猪源cvcc 2032的最小抑菌浓度为0.25μl/ml；柠檬醛和香芹酚复配对鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030和猪源产气荚膜梭菌cvcc2038最小抑菌浓度为0.5μl/ml。
[0050]
实施例2柠檬醛和香芹酚复配在体外对产气荚膜梭菌mbc的影响
[0051]
将实施例1中mic试验中的各组试管内培养液吸取0.1ml，接种至亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板，37℃静置培养48h后，观察结果。
[0052]
结果判定：产气荚膜梭菌于亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板培养48h后，于适当光线下肉眼观察平板上细菌的生长情况，以亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板上无可见菌落生长的最低浓度判定为柠檬醛和香芹酚复配对受试产气荚膜梭菌的mbc值(minimum bactericidal concentration，最小杀菌浓度)。
[0053]
表4柠檬醛和香芹酚复配对产气荚膜梭菌mbc的影响
[0054][0055][0056]
注：“ ”表示平板上有菌落生长；
“‑”
表示平板上无菌落生长，下标同。
[0057]
由表4可知，产气荚膜梭菌atcc13124、鸡源产气荚膜梭菌cvcc2027、猪源cvcc2032的最小杀菌浓度为0.5μl/ml；鸡源产气荚膜梭菌cvcc2030和猪源产气荚膜梭菌cvcc2038最小杀抑菌浓度为1.0μl/ml。说明柠檬醛和香芹酚复配对产气荚膜梭菌有较强的抑菌作用。
[0058]
实施例3
[0059]
一种柠檬醛和香芹酚复配组合物，由以下柠檬醛与香芹酚按质量份1:1复配而成。
[0060]
实施例4
[0061]
一种柠檬醛和香芹酚复配组合物，由柠檬醛与香芹酚按质量份2：3复配而成。
[0062]
实施例5
[0063]
为了验证本发明柠檬醛和香芹酚复配组合物对梭菌属抑菌和肠道梭菌属防控方面的应用，将实施例3-4中的组合物添加至禽全价料中制得禽饲料。
[0064]
试验选取健康的1日龄雌性黄羽肉鸡960只，按体重差异不显著的原则平均分为9组，每组4个重复，每个重复30只，地面笼养。其中一个组为对照组，饲喂基础日粮。一组为阳性对照组，饲喂基础饲粮 感染产气荚膜梭菌；其余为其余组为试验组，饲喂对应饲粮 感染产气荚膜梭菌；试验阶段自由采食饮水，每日记录采食量，试验期为24d。
[0065]
试验组i组饲料中添加的不是柠檬醛和香芹酚的复配组合物，而是单独添加质量
比0.02％的柠檬醛至禽全价料中制得；试验组ⅱ组饲料中添加的不是柠檬醛和香芹酚的复配组合物，而是单独添加质量比0.02％的香芹酚至禽全价料中制得；试验组ⅲ组饲料中添加0.05％实施例3所述的柠檬醛和香芹酚的复配组合物至禽全价料中制得，试验组iv组饲料中添加0.02％实施例3所述的柠檬醛和香芹酚的复配组合物至禽全价料中制得，试验组v组饲料中添加0.05％实施例4所述的柠檬醛和香芹酚的复配组合物至禽全价料中制得，试验组vi组饲料中添加0.02％实施例4所述的柠檬醛和香芹酚的复配组合物至禽全价料中制得，试验组vii组饲料中添加0.5％实施例4所述的柠檬醛和香芹酚的复配组合物至禽全价料中制得。
[0066]
坏死性肠炎模型的建立，产气荚膜梭菌标准株atcc13124经过复苏培养后使用无菌pbs制成悬浊液(106cfu/ml)，雏鸡连续2天(14日龄至15日龄)灌服1ml产气荚膜梭菌悬浊液作为坏死性肠炎组(阳性对照组)，试验组按照以上步骤灌服1ml产气荚膜梭菌悬浊液，阴性对照组灌服1ml的pbs。每天观察各组鸡的临床变化和死亡情况。试验结束时，每组每个重复各处死6只鸡，屠宰留取雏鸡盲肠内容物备用，并仔细观察小肠病变情况，根据坏死性肠炎的严重程度计分，肠道损伤评分采用0～6分制：0分(没有明显损伤)、1分(肠壁变薄、变脆)、2分(出现1～5个坏死灶)、3分(出现6～15个坏死灶)、4分(出现16个或16个以上坏死灶)、5分(出现2～3cm长的片状坏死)、6分(出现大片的弥漫性坏死)。
[0067]
盲肠内容物产气荚膜梭菌计数：取1g的盲肠内容物用无菌生理盐水稀释为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
倍的含菌稀释液，每种稀释梯度各吸取0.1ml涂布至亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂平板，每个样品做5个重复。同时另取空白平板添加0.1ml稀释生理盐水做空白对照，在厌氧培养箱37℃，培养24小时，计数特征性的菌落。
[0068]
由表5、表6和图2可知，对照组肠道无病变(图2a)，阳性对照组肠道发生糜烂性坏死(图2d)，试验组对坏死性肠炎有改善作用，如ⅲ组部分雏鸡肠壁出现少量出血坏死点(图2c)，而vi组则肠道得到较大修复大部分恢复至健康水平，少量雏鸡肠道则仅出现肠壁变薄(图2b)。与阳性对照组(坏死性肠炎组)相比，饲粮添加柠檬醛和香芹酚复配混合物可显著提高黄羽肉鸡的末体重、平均体增重、平均日采食量和降低料重比(p《0.05)；降低坏死性肠炎肉鸡的死亡率和肠道病变评分。i组、ⅱ组、ⅲ组、iv组、v组、vi组、vii组雏鸡末体重和平均日采食量与对照组无显著差异(p＞0.05)，且v组、vi组、vii组雏鸡的末体增重与对照组相似。说明柠檬醛和香芹酚复配可对坏死性肠炎雏鸡的生长性能有一定的促进作用，其中vi组(饲粮中添加0.02％柠檬醛(2)和香芹酚(3)复配)对坏死性肠炎肉鸡的促生长效果最好。
[0069]
表5饲粮中添加柠檬醛或香芹酚对黄羽肉鸡生长性能和健康状况的影响
[0070][0071]
注：同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(p》0.05)，不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p》0.01)。下表同。
[0072]
表6饲粮中添加柠檬醛和香芹酚对黄羽肉鸡生长性能和健康状况的影响
[0073][0074][0075]
注：表6中对照组和阳性对照组数据与表5相同故未列出。
[0076]
由表7和表8可知，vi组和vii组盲肠内容物中产气荚膜梭菌与阴性对照组无显著差异；与坏死性肠炎组相比，饲粮中柠檬醛和香芹酚复配可显著降低坏死性肠炎肉鸡盲肠内容物中产气荚膜梭菌的数量(p《0.05)。其中vi组和vii组(饲料添加0.02％柠檬醛(2)和香芹酚(3)复配和0.05％柠檬醛(3)和香芹酚(3)复配)的抑菌效果最佳。此结果与实施例1
柠檬醛和香芹酚复配对产气荚膜梭菌的影响结果相一致。
[0077]
表7饲粮中添加柠檬醛或香芹酚对黄羽肉鸡盲肠中产气荚膜梭菌总数的影响
[0078][0079]
表8饲粮中添加柠檬醛和香芹酚对黄羽肉鸡盲肠中产气荚膜梭菌总数的影响
[0080][0081]
注：表8中对照组和阳性对照组数据与表7相同故未列出。
[0082]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。